蛋白质等电点的测定 ppt课件
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实验一、蛋白质的两性电离及等电点测定
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（2）用细滴管缓慢加入0.02mol/L盐酸溶液，、边滴边摇， 直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的pH值接近酪蛋 白的等电点。观察溶液颜色的变化，记录，分析原因。
（3）继续滴入0.02mol／L盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色 的变化，记录，分析原因。
（4）再滴入0.02mol／L氢氧化钠溶液进行中和，观察是否
➢ 3、通过往五支不同pH值溶液的试管内加入酪蛋 白，观察沉淀出现的情况，确定其等电点。
➢ 4、共同讨论测定等电点的原理。
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2
一、蛋白质的两性电离 多肽链中氨基酸残基中有可解离基团，
如 ： 末 端 -COO- 、 -NH3+ ， 酸 性 氨 基 酸 侧 链- COO- ，Lys的ε-NH3+，Ar现方式做保护处理对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑并不能对任何下载内容负责
实
验
一
蛋
白
质
两
性
电
离
与
等
电
点
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【教学目标】
➢ 1、独立操作，一丝不苟地作实验。 ➢ 2、仔细观察不同阶段试剂颜色变化及沉淀的出
现和消失，通过现象观察能分析蛋白质两性电离 的性质，正确填写实验报告。
出现沉淀，记录，解释原因。当继续滴入0.02mol／L氢
氧化钠溶液时，观察沉淀和溶液颜色的变化。解释其原因。
作好记录。
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结果及分析
操作
在酪蛋白溶液中加入 指示剂 滴入HCL至出现大量 沉淀 继续滴入HCL
滴入NaOH溶液
继续滴入NaOH溶液 至沉淀溶解
实验结果
精选2
【实验原理】
蛋白质的性质实验二-蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白质沉淀反应结果分析
要点一
蛋白质沉淀反应原理
当溶液的pH值低于或高于蛋白质的 等电点时，蛋白质带负电荷或正电荷 ，容易与其他带相反电荷的物质发生 静电吸引而产生沉淀。沉淀反应可用 于分离纯化和测定蛋白质含量。
要点二
实验结果
实验观察到在pH值低于或高于等电 点时，蛋白质出现沉淀现象。通过离 心分离和称重，测定了沉淀物中蛋白 质的质量和含量。实验结果表明，该 蛋白质在不同pH值下的沉淀效果显 著，可用于蛋白质的分离纯化和含量 测定。
实验试剂
盐酸、氢氧化钠、醋酸、醋酸钠、磷酸盐缓冲液等。
配置不同pH值的缓冲液
选择适当的缓冲液，如醋酸-醋酸钠缓 冲液、磷酸盐缓冲液等。
根据需要配置不同pH值的缓冲液，确 保缓冲液的准确性和稳定性。
蛋白质溶液的等电点测定
将蛋白质溶液与不同pH值的缓冲液混合，观察蛋白质的溶解度变化。
当蛋白质溶解度最低时，记录对应的pH值，即为该蛋白质的等电点。
了解蛋白质的沉淀反应及原理
沉淀反应
蛋白质在某些条件下，失去溶解性从 溶液中析出的现象。
原理
蛋白质的沉淀反应通常与溶液的pH值 、离子强度、温度等因素有关，当这 些因素发生变化时，蛋白质的溶解度 可能会降低，导致沉淀的产生。
02
实验原理
蛋白质等电点的概念及影响因素
蛋白质等电点
蛋白质分子在溶液中处于净电中性状态时的pH值，此时蛋白质的溶解度最低。
通过测定不同pH值下的蛋白质电导率，确定了蛋 白质的等电点。
在实验过程中，观察到了蛋白质的溶解度变化和 电荷性质的变化。
分析实验结果与理论预期的差异
实验结果与理论预期基本一致，没有出现明显的偏差。
实验结果支持了蛋白质等电点沉淀的理论，即当溶液pH值等于蛋白质等电点时，蛋白质溶解度最低， 容易发生沉淀。
实验一蛋白质的等电点测定
实验一蛋白质的等电点测定一.实验目的１.掌握蛋白质的两性解离性质２.学习测定蛋白质等电点的方法二．实验原理蛋白质是两性电解质，在溶液中存在下列平衡：pH＞pI pH = pI pH＜pI蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液酸碱度（ｐH值）的影响。
当溶液的pH达到一定数值时，其颗粒上的正负电荷数目相等，在电场中，既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，如：在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。
可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度来测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲溶液。
向各种不同的缓冲液中加入酪蛋白后。
沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
三.实验器材：水浴锅、温度计、200ml锥形瓶、100ml容量瓶、吸管、试管等四.试剂与材料：１.材料：酪蛋白2.试剂：（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液称取0.4g酪蛋白，加1mol/LNaOH10ml使其完全溶解，加水50ml，再缓慢加1mol/LHAc10ml(边加边搅拌,ＮaOH和 HAc的浓度和体积必须准确，加HAc时一定要慢)，定溶至100 ml。
(2)1.00mol/L醋酸溶液(3)0.10mol/L醋酸溶液(4)0.01mol/L醋酸溶液五.实验步骤：（1）取同样规格的试管4支并编号，按下表顺序精确加入各试剂并混匀试管号蒸馏水（ml）0.01mol/LHAc(ml)0.10mol/LHAc(ml)1.00mol/LHAc(ml)1 8.4 0.6 - -2 8.7 - 0.3 -3 8.0 - 1.0 -4 7.4 - - 1.6(2)向以上试管中各加入酪蛋白醋酸钠溶液1ml，加一管，摇匀一管。
蛋白质的等电点测定 ppt课件
（2 ）观察其混浊度。静置 15 分钟后，再观察其混
浊度。结果可用“+、++、+++”表示浑浊度，最混
浊的一管pH即接近酪蛋白的等电点。
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9
五、实验结果与分析
实验结果：
Ø 按照实验报告要求计算实验结果。
分析： 通过操作本次实验，探讨影响本实验结果的主要影响因 素。 分析实验成功或失败的主要原因。
ppt课件 5
试剂使用规则
使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原
瓶。
取标准溶液时，应该将标准溶液倒入干净烧杯中，再用干净吸管吸取标 准液，以免污染瓶中的标准液体。
使用滴管时，滴管尖端朝下，避免试剂流入橡皮帽内。
2
3
观察溶液颜色和 结合思考 1 ， 沉淀 解释
结合思考 2 ， 解释
4 5
滴加 0.1mol/L 氢氧化钠溶液进行 观察溶液颜色和 中和，直至沉淀出现 沉淀 继续滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液 ppt课件
观察溶液颜色和 结合思考 1 ， 沉淀 解释 18
2、测定酪蛋白等电点
（1）取5支试管，按书中表格分别加入各试剂，混匀。
01moll醋酸溶液22试剂?17?ppt课件四实验步骤与结果11观察蛋白质的两性反应步骤操作现象解释结论11取试管11加20滴05酪蛋白溶液和5577滴001溴甲酚绿指示剂混匀观察溶液颜色和沉淀结合思考11解释22缓慢滴加01moll盐酸溶液随滴随摇直至大量沉淀发生观察溶液颜色和沉淀结合思考22解释33继续滴加01moll盐酸溶液观察溶液颜色和沉淀结合思考11解释44滴加01moll氢氧化钠溶液进行中和直至沉淀出现观察溶液颜色和沉淀结合思考22解释55继续滴加01moll氢氧化钠溶液观察溶液颜色和沉淀结合思考11解释?18?ppt课件22观察其混浊度
蛋白质等电点的测定
将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保 证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为0，则可关闭电源。
5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。
二、等电聚焦电泳
原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而 又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连 续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能 造成介质pH由酸到碱逐步变化。
2)各种蛋白质pI不同 3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI 形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH 梯度 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝 胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋 白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值 等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的 区带。
四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶 表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 蒸馏水 6.75 10%过硫酸铵 0.05 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 混匀后置真空干燥器中抽气 10 min
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保 证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为0，则可关闭电源。
5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为： 蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。
二、等电聚焦电泳
原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而 又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连 续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能 造成介质pH由酸到碱逐步变化。
2)各种蛋白质pI不同 3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI 形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH 梯度 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝 胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋 白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值 等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的 区带。
四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶 表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液 2.5 两性电解质载体 0.5 蒸馏水 6.75 10%过硫酸铵 0.05 10%TEMED 0.1 蛋白质混合样品 0.1 混匀后置真空干燥器中抽气 10 min
蛋白质的理化性质课件参考.ppt
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练习
• 下列哪种蛋白质在pH5.0的溶液 中带负电荷？
• A．pI为5.5的蛋白质 B．pI为4.0的蛋白质 C．pI为7.0的蛋白质 D．pI为5.0的蛋白质
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体内大多数蛋白质的等电点在pH5.0 左右，
因而在生理条件下以阴离子形式存在 。
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6
3.电泳
定义： 带电粒子在电场中向电性相反的电极移动的现象。
若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素，有些
可恢复其天然构象和生物活性,称为蛋白质的复性。
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核糖核酸酶的变性与复性示意图
8M尿素或 β-巯基乙醇
透析
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（五）、变性与复性
过核 程糖
核 酸 酶 的 变 性
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蛋白质沉淀
概念 蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。
方法 盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、
蛋白质在带电场中泳动的速度和方向与其所 带电荷的性质、数量及分子的大小、形状有关。
带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动 较慢，从而达到分离蛋白质的目的。
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白
分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白
、γ球蛋白。
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8
A：染色后显示的蛋白质区带 B：光密度扫描定量分析
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正常
肝硬化
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二、蛋白质的胶体性 质
1.蛋白质有胶体性质
蛋白质是生物大分子，分子量在1万～10万 kD（千道尔顿）之间，分子直径在胶体颗粒 的范围（1—100nm）
蛋白质的性质实验(二)——蛋白质的等电点测定和沉淀反应
六、实验思考
何谓蛋白质的等电点和沉淀反应？有何实用意义？ 详细记录各实验的结果和现象，并解释这些现象。
（2）不可逆的沉淀反应：蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质 常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。如加热引起的蛋白质沉淀与凝 固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应 注意：蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电 荷），并不析出，因此变性的蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀 的蛋白质也未必都已变性 沉淀蛋白质的方法 盐析法：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（如硫酸铵，硫酸钠或氯 化钠），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐的浓度不同，析出的蛋 白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在 饱和硫酸铵溶液中析出。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性，当除去盐 后，即可溶解 重金属盐沉淀法：当溶液pH大于蛋白质等电点时，蛋白质颗粒带负电 荷，容易与重金属离子（Hg2+、Pb2+、Cu2+或Ag+）结合成不溶性盐而 沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救 就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再用催吐剂排出体外
某些有机酸沉淀法：某些有机酸指的是三氯乙酸、磺基水杨酸和硝酸 等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与酸类的酸 根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀 有机溶剂沉淀法：向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、 乙醇或丙酮），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数，致使蛋 白质颗粒容易凝集而沉淀。此法如果控制在低温下操作并且缩短处理 时间，则可使变性速度减慢 加热变性沉淀法：几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类 促进蛋白质加热凝固，当蛋白质处于等电点时，加热变性凝固最完全 和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使 蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋 白质处于等电点，也破坏了带电状态。古代人将大豆蛋白质的浓溶液 加热并点入大量盐卤（含MgCl2）制豆腐，便是此方法的成功应用
实验一、蛋白质的等电点测定
三、试剂仪器和试剂
1、仪器设备
试管及试管架 滴管 吸量管 容量瓶
2、试剂
0.5% 酪蛋白溶液 0.01%溴甲基酚绿指示剂 0.10 mol/L 盐酸溶液 0.10 mol/L 氢氧化钠溶液 1.00 mol/L 醋酸溶液 0.10 mol/L 醋酸溶液 0.01 mol/L 醋酸溶液
Ø 要爱护公物，小心使用仪器和实验设备，注意节约用水、电、药品 和器材。
➢ 所有固体废弃物如：废纸、固体废弃物、沉淀物等必须弃于垃圾 桶中。强酸、强碱必须倒入玻璃器皿中，用水稀释后倒入水槽。
➢ 实验室和实验台应保持整洁。公用试剂用毕，立即盖严并还原。 实验完毕，仪器洗净放好。
➢ 在实验过程中必须遵守操作规程，不得随意乱动乱用。如不会使 用，应请教指导教师。凡因乱动乱用违反操作规程而损坏仪器设 备，造成事故者，按有关规定进行赔偿和处理。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下 列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸 碱度影响。
常用方法：利用溴甲酚绿指示剂的变色来 观察蛋白质的两性性质。
3.8
5.6
当溶液的pH为一定值时，蛋白质极性基团解离的 正负离子数相等，净电荷为0，此溶液的pH值为 该蛋白质的等电点。
微生物、动物的组织、细胞培养物、血液和分泌物 都可能存在细菌 和病毒感染的潜在危害，处理生物材料必需小心谨慎，做完实验必须 用肥皂、洗涤剂或消毒液洗手。
被污染的物品，必须进行高压消毒或烧成灰烬。 被污染的玻璃用具应在清洗和高压消毒前立即浸泡在适当的消毒液中。
5
试剂使用规则
Ø 使用试剂前应该仔细辨认标签，看清名称及浓度，是否为本实验所需。 Ø 取出试剂后，立即将瓶塞盖好，放回原位；未用完的试剂决不可倒回原
蛋白质等电点的测定
百泰派克生物科技
蛋白质等电点的测定
蛋白质表面存在一些酸碱性离子基团，如氨基、羧基、酚基、巯基等，因此蛋白质与氨基酸一样本身带有净电荷。
在不同pH的溶液中解离所带的正负电荷不同，在
某一pH值的溶液中，其解离的正负电荷相等，这时溶液的pH值就称为蛋白的等电点（isoelectric point, pI）。
蛋白质的等电点与其空间结构有关，因此对于某一特定蛋白质来说其等电点也是固定的。
当蛋白质处于与其等电点相同pH的溶液中时，在该溶液中的溶解度最小，可以从
溶液中沉淀出来，故蛋白质等电点常用于蛋白质的分离和提纯。
蛋白等电点的测定方法有传统的沉淀法和经典的等电聚焦法等。
沉淀法利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，在醋酸与醋酸钠配制的不同pH
缓冲液中加入待测的样品蛋白质，比较其在不同pH的缓冲液中的沉淀量，沉淀量
最多的缓冲液所对应的pH就是该蛋白的等电点。
等电聚焦法利用蛋白质在等电点时净电荷为零的原理将待测蛋白质在特殊的缓冲液中进行聚丙烯凝胶电泳，这种特殊的缓冲液为两性电解质，可以在凝胶内形成连续的pH梯度，当电泳完毕时，蛋白质迁移到的位置对应的pH就是该蛋白质的等电点。
百泰派克生物科技基于毛细导管等电聚焦（cIEF）提供蛋白等电点的测定一站式技术服务，适用于多种氨基酸、多肽、重组蛋白、酶类、单克隆抗体等样品的等电点测定，欢迎免费咨询。
实验蛋白质的等电点测定和沉淀反应ppt课件
(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL， 加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为 5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟 后，再观察其混浊度。 最混浊(有颗粒沉淀)的一 管pH即为酪蛋白的等电点。
(二)蛋白质沉淀实验
1. 蛋白质的盐析
n 加5%卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量 饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球 蛋白的沉淀。
n 离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉 淀是否溶解？为什么？
3．有机酸沉淀蛋白质
n 取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
n 离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察
沉淀是否溶解。
4．有机溶剂沉淀蛋白质
n 取1支试管，加入2 mL蛋白质溶液，再加 入2 mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生 成。
现象
解释
4．有机溶剂沉淀蛋白质
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管 号 操作
1
振荡混匀
加数滴盐酸
2
振荡混匀
醋酸中和
加数滴盐酸
3
振荡混匀
碳酸钠中和
加数滴盐酸
现象
解释
n 水浴锅 n 温度计 n 锥形瓶 n 100mL容量瓶 n 吸管 n 试管及试管架
3、试剂
n 0.4% 酪蛋白乙酸钠溶液： 取20mL牛奶，加入 10mL 1mol/L NaAC,用去离子水定容至100mL
n 1.00 mol/L 醋酸溶液 n 0.10 mol/L 醋酸溶液 n 0.01 mol/L 醋酸溶液
实验结果
(一)酪蛋白等电点的测定
管号 pH值 混浊度 1 2 3 4
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2020/11/13
8
实验器材与试剂：
器材： • 水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容
量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液
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实验步骤：
(1) 取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精 确地加入各试剂，然后混匀。
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二、等电聚焦电泳
原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而 又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连 续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能 造成介质pH由酸到碱逐步变化。
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12
2)各种蛋白质pI不同
ห้องสมุดไป่ตู้
3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI 形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH 梯度
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最常用的方法是：
①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH ③浊度、分光光度法 ④基于蛋白质与离子交换的作用
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一、测定溶解度最低时的溶液PH
实验原理：
借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定 酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠 混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白 的等电点。
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中 存在下列平衡：
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蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液 的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值 时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等， 在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不 向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋 白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的 等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质 都有变化，可利用此种性质的变化测定各 种蛋白质的等电点。
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝
胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋
白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值
等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的
区带。
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三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
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图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
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四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
6.75
10%过硫酸铵
0.05
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5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
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三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。
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3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
试管号
1 2 3 4
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蒸馏水 （ml）
8.4
8.7
8.0
7.4
0.01M醋酸 （ml） 0.6
—
—
—
0.1M醋酸 （ml）
—
0.3
1.0
—
1M醋酸 （ml）
—
—
— 1.6
10
(2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫 升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的 pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊 度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊 的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
10%TEMED
0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
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（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保 证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为0，则可关闭电源。
蛋白质等电点的测定
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主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
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