消毒剂效力与有效期验证方案

TEST METHOD VALIDATION PROTOCOL 分析方法验证方案
方案编号(版本号:):Protocol No. (Version:) :
(V: )TMP-07-077
分析方法名称TEST METHOD: QUALIFICATION OF DISINFECTANT EFFECTIVENESS
AND STABILITY
消毒剂效力及有效期确认方案
PROTOCOL APPROVAL PAGE
方案批准页
方案准备
PROTOCOL PREPARATION
WYETH PHARMACEUTICAL CO., LTD.
SIGNATURE 签名DATE 日期惠氏制药有限公司
QC Microbial Analyst
QC Microbial Analyst
PROTOCOL REVIEW
方案复核
QC Senior Analyst
QC Manager
QAValidation Officer
方案批准
PROTOCOL APPROVAL
Senior QO Manager
PROTOCOL REVISION HISTORY PAGE 方案修订历史记录页
REVISION NUMBER 修订次数VERSION版本号
REVISION CONTENT
修订内容
0 1 Original原稿
1.目的PURPOSE (5)
2.范围SCOPE (5)
3.引言INTRODUCTION (5)
(5)
4.参考资料REFENRENCE
5.验证方法TEST METHOD (6)
5.1.所用仪器和物料 (6)
5.2.测试工作菌种 (6)
5.3.实验程序 (6)
6.接受标准 (8)
6.1.消毒效力接受标准： (8)
6.2.中和效力控制及其接受标准： (8)
1.目的PURPOSE
验证惠氏苏州工厂目前使用的几种消毒剂Process LpHse: 酸性、Process VespheneⅡse:碱性、Ethanol 酒精溶液、快活溶液，在不锈钢、橡胶、瓷砖、玻璃、塑料门帘、墙面等不同材质上的消毒效力，同时验证消毒剂的使用有效期。

2.范围SCOPE
本验证需要验证的消毒剂有：Process LpHse: (酸性)、Process VespheneⅡ se:(碱性)、Ethanol 酒精溶液、快活溶液FORWARD disinfectant四种。

表1：各消毒剂使用时涉及的材质
消毒剂类型适用对象所涉及的材质
Process LpHse: 酸性酚类消毒剂
（广谱、中
效）
生产设备/器具/车间
地面、墙壁、天花板
不锈钢、橡胶、瓷砖、玻璃、
塑料门帘、墙面
Process VespheneⅡ se:碱性酚类消毒剂
（广谱、中
效）
车间设备/器具/操作
间地漏
不锈钢、橡胶、瓷砖、玻璃、
塑料门帘、墙面
Ethanol 酒精溶液醇类消毒剂
（中效）
生产设备/器具/微生
物实验室
不锈钢、橡胶、瓷砖、玻璃、
塑料门帘、墙面
快活溶液季铵盐类消毒
剂（低效）
车间地面、墙壁、天
花板/非控制区域、
车间公用区
不锈钢、橡胶、瓷砖、玻璃、
塑料门帘、墙面
3.引言INTRODUCTION
本验证的原理是，在某种材质表面接种0.1ml (104-105CFU)的菌种，室温下自然风干后，将消毒剂直接喷在材质表面，等消毒剂作用一段时间后，检验没有被杀灭的细菌数；根据细菌被杀灭的数量，来判断消毒剂的杀菌效果。

实际消毒操作时，消毒剂喷到要消毒物体表面后，再通过人为的涂擦等操作使消毒剂与物体表面充分接触，同时，此操作也会机械去除掉一部分微生物。

在该验证中，消毒剂是喷到材质表面，这种方法要比实际消毒时的效果差，因此验证的结果更能体现实际的消毒效果。

4.参考资料REFENRENCE
Disinfectant Effectiveness Study（812-Analytical Report-0807-1.0）
SOPTS-35(V5)
5.验证方法TESTMETHOD
5.1.所用仪器和物料
?所用培养皿、移液管、容器均在121度下灭菌30分钟后使用
?无菌一次性培养皿，移液管。

?生物安全柜(BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜)工作窗口吸入风速为≥0.5m/s
?灭菌锅
?培养箱（25度和32度各一个）
5.2.测试工作菌种
?大肠埃希菌（ CMCC(B)44102）菌种斜面
?金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26003）菌种斜面
?白色念珠菌（ CMCC98001）菌种斜面
?环境菌种科氏葡萄球菌斜面（六、九、十月环境检测沉降菌平板上连续检出科氏葡萄球菌，特选此菌为环境菌种）
需验证的消毒剂应质量合格并在有效期即将结束时开始验证试验，实验所用的仪器设备均在校正合格期限内。

5.3.实验程序
5.3.1.消毒剂的配置：
消毒剂按照相关的程序进行稀释，配置好的消毒剂溶液储存在实际操作时使用
的喷壶中，在有效期内（7天）每天模拟日常使用方法使用，第8天开始验证试
验。

消毒剂配置方法及消毒反应时间见表 2.
5.3.2.材质的准备：
所需的材质均是在实际操作中消毒剂所消毒的表面材质，准备的材质需为无菌
材质，在实验过程中，每个实验组需3块同种材质同时进行。

表2.消毒剂配置方法及消毒反应时间
消毒剂稀释比例反应时间菌种
Process LpHse: 酸
性1:256(v/v) 3,5,10minutes
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
白色念珠菌
科氏葡萄球菌
Process Vesphene Ⅱ se:碱性1:128(v/v) 3,5,10minutes
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
白色念珠菌
科氏葡萄球菌
Ethanol 酒精溶液75% 2,3,5minutes
大肠埃希菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌科氏葡萄球菌
快活溶液1:10(v/v) 3,5,10minutes
大肠埃希菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌科氏葡萄球菌
5.3.3.菌悬液的制备：
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及环境菌种科氏葡萄球菌的营养
琼脂斜面培养物，接种至营养琼脂斜面上，在35 ~ 37℃培养20 ~ 22小时。

再接种上述菌种的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，在35 ~ 37℃培养18 ~ 24小时，上述营养肉汤培养物用0.9%无菌生理盐水溶液逐级10倍稀释，制成每0.1 ml含菌落数104-105CFU的菌悬液。

5.3.4.实验操作：
准备3块待测表面材质于生物安全柜内，分别吸取0.1 ml(104-105CFU)接种于3块待测表面材质上，让其在生物安全柜中自然风干后待测，将配置好的的消毒
装入喷壶中，均匀地喷洒在材质的表面后立即开始计时，按表2等计时结束后，迅速把该材质放入100ml的D/E 中和液中，充分振荡1min后经0.45微米的滤膜过滤，用100ml/次的D/E 中和液冲洗3次，取滤膜放在D/E中和琼脂平板上培养。

培养条件：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及环境菌种科氏葡萄球菌在30-35℃，至少3天，重复以上实验操作3次，完成验证实验。

5.3.5.阴性控制实验：
100ml的D/E 中和液经0.45-micron的滤膜后，取滤膜放在D/E中和琼脂平板上培养，培养条件：细菌30-35℃，至少3天，
5.3.
6.
阳性控制实验：
准备3块无菌的待测表面材质于生物安全柜内，分别吸取0.1 ml(10-100CFU)阳性菌接种于3块待测表面材质上，让其在生物安全柜中自然风干后，将每种带
菌的材质放入100ml 无菌的缓冲溶液中，充分振荡1min ，经0.45微米的滤膜过滤，用100ml/次的D/E 中和液冲洗3次，取滤膜放置于D/E 中和琼脂平板上培养。

培养条件：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及环境菌种科氏葡萄球菌在30-35℃，至少3天。

6.接受标准6.1.
消毒效力接受标准：
计算Log Reduction ，评价该种消毒剂对该菌种的杀灭效果，Log Reduction=Log(Average#of Organisms in Control Plates)-Log(Average# of Organisms in Test Plates) 接受标准：Log Reduction ≥3
6.2.中和效力控制及其接受标准：
吸5ml 已配制好的消毒剂，经0.45微米的滤膜过滤后，用100ml/次中和液冲洗3次，加入1ml 菌悬液（10-100cfu ）置滤膜上，用100ml/次中和液冲洗1次，取滤膜放在D/E 中和琼脂平板上培养，计数。

每种菌重复做3份样品。

分别取上述菌悬液1ml （10-100cfu ）置100*10mm 的无菌平皿，浇入约20ml （≈45℃）TSA 培养，计数。

每种菌重复做3份样品。

培养条件：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和环境菌种科氏葡萄球菌30-35℃，至少3天。

根据结果计算回收率：
Percent
Recovery ==
%
100Control
Positive CFU Mean Sample CFU 接受标准：Percent Recovery ≥70%。