水产微生物实验—培养基的配制

实验二培养基的配制一、基础知识培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

飞自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。

但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。

不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜酸细菌例外)。

所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。

此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。

根据微生物的种类和实验目的不同，培养基的类别如下（一）按成分的不同分1．天然培养基。

主要成分是复杂的天然有机物质，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。

这些复杂天然有机物质的成分不完全了解，每次所用的原料，其中各成分的数量也不恒定。

这类培养基是实验室和发酵工厂常用的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯培养基，玉米粉、黄豆饼粉培养基、血琼脂培养基等。

2．合成培养基用化学成分完全了解的纯化合物药品配制而成的培养基，因此也称化学成分明确的培养基(chemically defined medium)，如高氏I号培养基、查氏培养基、M9培养基等。

一般用于研究微生物的形态，营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传分析等。

高氏I号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。

如果加入适量的抗菌药物(如各种抗生素、酚等)，则可用来分离各种放线菌。

此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀、如高氏工号培养基中的磷酸盐和镁盐相互混合时易产生沉淀；因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将三种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。

此外，合成培养基有的还要补加微量元素，如高氏工号培养基中的FeS04·7H2O的量只有0.001％，因此在配制培养基时需预先配成高浓度的FeSO4·7H2O贮备液，然后再按需加入一定的量到培养基中。

高氏工号培养基配方如下可溶性淀粉20gNaCl 0.5gKNO31gK2HPO4·3H2O 0.5gMgSO4·7H2O 0.5gFeSO4·7H2O 0.01g琼脂15-25g水1000 mlpH 7.4-7.63．半合成培养基在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养基。

大多数微生物都能在此种培养基上生长，应用广泛。

例如常用的马铃薯葡萄糖培养基，很多霉菌都生长良好。

（二）按培养基的物理状态分1．固体培养基在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。

实验用的凝固剂有琼脂、琼脂糖、明胶和硅胶，后者用于配制自养微生物的固体培养基．对其他多数微生物来讲，以琼脂最为合适，一般加入1.5％-2.5％即可凝固成固体。

此培养基可供微生物的分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。

2．半固体体培养基在液体培养基中加入少量凝固剂即为半固体培养基。

例如用琼脂作凝固剂时只需加入0.2％-0.7％。

此种培养基常用来观察细菌运动的特征、菌种保存和噬菌体的分离纯化及制备等。

3．液体培养基不含任何凝固剂，配后成液体状态的培养基。

广泛用于微生物的培养，生理代谢和遗传学的研究以及工业发酵等。

（三）按培养基的用途分1.基础培养基含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。

最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白陈培养基．这种培养基可作为一些特殊培养基的基础成分。

牛肉膏蛋白胨培养基是工种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。

由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。

基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。

其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。

在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂，琼脂在常用浓度下96℃时溶化，实际应用时，一般在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。

琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。

固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。

由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖．牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水1000 mlpH 7.4-7.62．营养培养基(加富培养基)在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液，血清、动物(或植物)组织液，酵母浸膏或生长因子等．用以培养对营养要求苛刻的微生物，如培养百日咳杆菌需要含有血液的培养基。

血液培养基是一种含有脱纤维动物血(一般用兔血或羊血)的牛肉膏蛋白胨培养基。

因此除培养细菌所需要的各种营养外，还能提供辅酶(如V因子)，血红素(X因子)等特殊生长因子。

因此血液培养基常用于培养，分离和保存对营养要求苛刻的某些病原微生物。

此外，这种培养基还可用来测定细菌的溶血作用。

血液琼脂培养基的配方如下：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl 5g琼脂15-20g水1000 m1pH 7.4-7.6无菌脱纤维兔血(或羊血) 100ml3.鉴别培养基是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基．某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。

主要用于不同类型微生物的生理生化鉴定。

如用来检查细菌能否利用不同糖类产酸产气的糖发酵培养基和能否产生硫化氢的醋酸铅培养基等。

4．选择培养基利用微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加人这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利于所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。

如分离真菌的马丁氏(Martin)培养基和既有选择柞用又有鉴别作用的远藤氏(Endo)培养基等。

微生物遗传学研究中用来选择营养缺陷型的培养基以及分子克隆技术中常用的加抗生素X-gal(5-溴-4-氧-3-吲哚--βD-半乳糖苷)的培养基等均属于选择培养基。

马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。

此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgS04·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。

其中葡萄糖主要作为碳，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4、MgS04·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷、镁离子。

这种培养基的特点是培养基中加入的孟加拉红和链霉素能有效的抑制细菌和放线菌的生长，而对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。

马丁氏培养基配方如下：KH2PO41gMgSO4·7H2O 0.5g蛋白胨5g葡萄糖10g琼脂15-20g水1000 mlpH 自然此培养液1000 ml 加1%孟加拉红水溶液3.3 ml。

临用时以无菌操作在100 ml培养基中加入1%的子原核微生物0.3ml，使其终浓度为30μg/ml。

二、实验目的1．明确培养基的配制原理2．通过对基础培养基的配制，掌握配片培养基的一般方法和步骤3．通过对高氏I号培养基的配制，掌握配制合成培养基的一般方法。

4．通过对分离直菌的马丁氏（Martin）培养基配制，掌握选择培养基配制方法，并明确选择的原理。

5．掌握血液琼脂培养基的配制方法，明确血液培养基的用途。

三、实验器材1．溶液或试剂牛肉膏，蛋白质，Nacl，琼脂，1mol/L NaoH，1mol/L Hel, 可溶性淀粉，KNO3，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，KH2PO4，葡萄粮，孟加拉红（1%的水溶液），链霉素（1%水溶液）2．仪器或其他用具试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养其也装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，PH试纸（PH 5.5-9.0），棉和，牛皮纸，江号笔，麻绳，纱布，装有5-10粒玻璃的无菌三角瓶，无菌注射器，无血平皿等。

3．动物健康的兔或羊四、实验步骤（一）牛肉膏蛋白胨培养基的制备培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放人烧杯中。

牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒人烧杯。

也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。

蛋白胨很易吸湿，在称取时动作耍迅速．另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品．瓶盖也不要盖错。

2．溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解(图V—1)。

将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。

在制备用三角瓶盛固体培养基时，一也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5%-2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。

在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。

同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。

配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细苗生长．3．调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。

反之，用1m01/L HCl进行调节。

对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行(使用方法、可参考有关说明书)。

pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。

配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固．因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH．4．过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。

一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去(本实验勿需过滤)。

5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。

分装装置见图V-2。

(1)液体分装分装高度以试管高度的l/4左右为宜。

分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。