辣椒ACC氧化酶基因部分序列的分离与鉴定

滇重楼辣椒轻斑驳病毒分离物的鉴定及全基因组序列分析作者：杨林毅陈潞陈泽历来源：《湖北农业科学》2020年第13期摘要：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是多年生草本植物，其药用部位为地下根茎，是一种重要的中药材。

为明确侵染滇重楼的病毒病原，对采自云南省曲靖市的滇重楼进行透射电镜观察、DAS-ELISA和RT-PCR技术检测。

在透射电镜下观察到杆状病毒粒子，大小为（200～300） nm×（20～36） nm。

对采集到的7份病样进行DAS-ELISA检测，结果表明，其中5份病样呈阳性。

通过RT-PCR技术扩增、克隆获得1个全长为6 357 bp的曲靖分离物PMMoV-QJ的全基因组序列。

将PMMoV-QJ的全基因组序列与国内外已经报道的10个PMMoV分离物进行同源性分析比对，其同源性为99.42%～99.81%。

基于全基因序列的系统发育分析表明，PMMoV-QJ与韩国分离物亲缘关系密切。

本研究明确了该分离物的亲缘关系，从分子水平鉴定该分离物，为后续滇重楼病毒病的预防提供理论依据。

关键词：滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）;辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）;鉴定;序列分析Abstract： Paris polyphylla var. yunnanensis is a perennial herb， and its medicinal part is underground rhizomes. It is an important chinese medicinal material. In order to clarify the viral pathogens infecting the Paris polyphylla， the transmission electron microscopy， DAS-ELISA and RT-PCR techniques were performed on the Paris polyphylla collected from Qujing， Yunnan province. Baculovirus particles were observed under transmission electron microscopy and were （200～300）nm ×（20～36）nm in size. The results of DAS-ELISA on 7 samples collected showed that 5 of them were positive. A whole genome sequence of a 6 357 bp Qujing isolate （PMMoV-QJ， accession number MK784568） was cloned by RT-PCR amplification. The homologous sequence of PMMoV-QJ were analyzed by homology with 10 PMMoV isolates reported at home and abroad， and the homology was between 99.42% and 99.81%. Phylogenetic analysis based on the whole gene sequence showed that PMMoV-QJ was closely related to Korean isolates.This study clarifies the genetic relationship of the isolate， and identifies the isolate from the molecular level， which provides a theoretical basis for the prevention of the subsequent viral disease.Key words： Paris polyphylla var. yunnanensis; pepper mild mottle virus（PMMoV）; identification; sequence analysis滇重樓（Paris polyphylla var.yunnanensis）又称独角莲，属延龄草科重楼属（Paris）多年生草本植物，其药用部位为地下根状茎，分布于亚欧大陆温带和热带地区，在中国主要集中在西南地区，其中以云南省滇中、滇东和滇东北、滇西和滇西北为主[1]。

ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究（可编辑）ACC脱氨酶基因的检测和有ACC脱氨酶细菌的应用研究洳专:、硕士学位论文指导教师塞土里亘熬拯’,独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得浙婆太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

日学位论文作者签名: 签字目期: 年月学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解有关保留、使用学位论文的规定,浙江太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。

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保密的学位论文在解密后适用本授权书导师签名:学位论文作者签字日期:?乃年厂月巧日签字日期:易学位论文作者毕业后去向:电话:工作单位:通讯地址: 邮编:致谢这篇论文是在导师安千里副教授的悉心指导和热情关怀下完成的。

回顾攻读硕士学位的这三年的时间,安老师对我的学和生活给予了极大的关怀和帮助。

他为我的研究工作创造了良好的条件,从论文的选题、实验设计、实验进展、开题报告、读书报告到论文的撰写与修改,无不凝聚了安老师辛勤的汗水和心血。

安老师为人平易近人,豁达开朗,治学严谨,具有高尚的人格情操。

对待学术工作更是兢兢业业,一点业不马虎。

这种精神使我终生受益,时刻鞭策和激励着我。

在这三年的时间当中,我的各方面能力都得到了提高。

我相信安老师对我的积极影响将会一直陪伴着我。

值此论文完成之际,谨向我的导师安千里表示由衷的敬意和谢意同时,我还要感谢生物所的各位老师的教导和帮助,尤其是梁五生副教授和毛碧增副教授。

感谢我的德育导师谢艳老师和刘小红老师,你们在我攻读学位期间对我提供了诸多帮助和关照,是我顺利完成学业的坚强后盾。

ACC氧化酶基因PCR 扩增体系优化研究摘要乙烯作为植物的五大类激素之一，在植物的生长发育过程中发挥着重要作用，而乙烯在植物体内的生物合成主要是由ACC氧化酶和ACC合成酶这2个限速酶来控制的，因而通过调节这两种酶的表达能有效地控制乙烯的合成量，从而获得所需要的植物新种质。

本实验采用DP103质粒小提试剂盒（离心柱型）提取质粒的方法，从大肠杆菌中提取得到含有ACC氧化酶基因的重组质粒（PGEM-T），并采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测其目的基因的获得；同时对目的基因进行PCR扩增，并通过对参与PCR基因扩增反应程序中退火温度和循环次数不同的梯度设置，即：退火温度分别设置为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，循环次数分别设置为：10次、20次、30次、40次、50次，进行单因子检测，观测各因子在不同条件下多扩增结果的影响，并利用琼脂糖凝胶电泳的方法筛选出最优扩增条件。

实验结果表明重组质粒上700 bp ACC氧化酶基因在PCR基因扩增退火温度50℃，循环次数30次时电泳条带清晰无拖尾现象；重组质粒上600 bp ACC 氧化酶基因在PCR基因扩增退火温度20℃、30℃、40℃，循环次数30次、40次其电泳条带清晰均无拖尾现象，且均无明显差别。

关键词：ACC氧化酶，质粒提取，PCR，退火温度，循环次数ACC Oxidase Gene PCR Amplification System at TheExperimental Study of OptimizeABSTRACTAs one of five plant hormones, ethylene plays an important role in the process of plant growth and development. The biosynthesis of plant ethylene is mainly controled by ACC oxidase and ACC synthase 2 rate-limiting enzymes. So it is effective in controlling the synthesis of ethylene by regulating the expression of these two enzymes, which is necessary for new plant germplasm. In this experiment recombinant plasmid which included ACC oxidase gene was extracted from E. coli with the method of Kit. and the two kinds of target genius were evaluated with the method of agarose gel electrophoresis. At the same time, the target gene was carried out PCR amplification at the different annealing temperature and cycle numberthe set, that was the annealing temperature set to 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, and the cycle number was 10, 20, 30, 40 and 50 times, respectively. Then we observated the effect of one factor on the results of multi-amplified in different conditions. The optimal amplification conditions were screened with the method of agarose condensate gel electrophoresis. The experimental results showed that electrophoretic bands of the recombinant plasmid of 700 bp ACC oxidase gene were clear without tailing phenomenon, which was in the PCR gene amplification under the conditions of annealing temperature 50 ℃and the cycles 30 times. While electrophoresis bands of the recombinant plasmid of 600 bp ACC oxidase gene were clear without tailing phenomenon in the PCR gene amplification under the conditions of annealing temperature 20 ℃,30 ℃, 40 ℃; and the cycles cycles 30 times, 40 times, which were no significant differences.KEY WORDS: ACC oxidase, Plasmid, PCR, annealing temperature, cycles符号说明缩略词中文ACC 1-氨基环丙烷-1-羧酸ACS ACC合成酶ACO ACC氧化酶SAM S-腺苷蛋氨酸PCR 聚合酶链式反应ddH2O 去离子水Amp 氨苄青霉素Tris 三羟甲基氨基甲烷dNTP 三磷酸脱氧核苷buffer 缓冲液bp 碱基对GV 核酸染料Marker DNA分子量标准物EDTA 乙二胺四乙酸目录摘要 (I)ABSTRACT (II)符号说明 (III)目录...................................................................................................................................... I V 第一章文献综述.. (1)1.1 ACO基因的克隆 (1)1.2 ACO基因的表达 (2)1.2.1 激素及其他制剂的诱导 (2)1.2.2 环境胁迫的诱导 (2)1.2.3 不同发育阶段的诱导 (2)1.3 PCR技术综述 (3)1.3.1 PCR 技术的原理 (3)1.3.2 PCR技术的成分 (3)1.3.3 PCR 反应程序参数 (5)1.4 研究的目的和意义 (5)第二章实验部分 (7)2.1 实验材料、试剂和仪器 (7)2.1.1 实验材料 (7)2.1.2 实验药品及试剂 (7)2.1.3 实验仪器 (8)2.2 实验方法 (8)2.2.1 增殖细菌和扩增质粒 (8)2.2.2 提取质粒 (9)2.2.3 琼糖凝胶电泳检测 (9)2.2.4 PCR基因扩增 (10)2.3 结果 (11)2.3.1 不同退火温度下的扩增效果 (11)2.3.2 不同循环次数下的扩增效果 (13)2.4 讨论 (14)2.5 结论 (15)参考文献 (17)致谢 (20)英文翻译 (21)第一章文献综述乙烯是一种植物气体激素，对植物种子萌发、生长发育、衰老果实成熟等有广泛的影响，同时与逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、病原菌入侵等方面有关；并参与植物细胞的程序性死亡，促进花凋谢和DNA降解。

辣椒基因组SSR引物的开发及品种纯度分子鉴定辣椒是一种重要的蔬菜和调味品，具有丰富的营养价值和特殊的风味。

辣椒的种植品种繁多，对于种植者和消费者来说，了解辣椒的品种纯度非常重要。

随着分子生物学技术的发展，利用分子标记技术可以进行辣椒品种纯度的鉴定。

在辣椒基因组中，SSR（简单序列重复）被广泛用于基因组学研究和种质资源鉴定。

本文将介绍辣椒基因组SSR引物的开发及其在品种纯度分子鉴定中的应用。

辣椒基因组的SSR引物的开发。

SSR是指连续重复出现的2-6个核苷酸单元序列，具有高度多态性和稳定性，被广泛应用于种质资源鉴定和遗传多样性研究。

在辣椒基因组中，通过基因组测序和生物信息学分析，可以筛选出含有SSR序列的DNA片段，并设计引物进行扩增。

基因组SSR的开发需要考虑引物的选择和设计，引物的长度一般为18-25个核苷酸，GC含量为40%~60%，并在引物的5'端添加标记序列。

通过引物设计软件和基因组数据库的分析，可以快速筛选出合适的SSR引物。

还可以通过引物的杂交性和扩增特异性的PCR试验对SSR引物进行验证。

品种纯度分子鉴定中的SSR引物的应用。

品种纯度的鉴定是指确定种子或苗木中的种植品种是否纯种，即无杂交种或杂交种的掺杂。

传统的品种纯度鉴定方法一般是通过观察品种的形态特征和生物学性状，但这种方法存在主观性和不准确性的问题。

利用分子标记技术，特别是SSR标记，可以提高品种纯度鉴定的准确性和可重复性。

通过PCR反应扩增SSR位点，通过凝胶电泳的分析，可以得到品种特异的DNA条带，从而鉴定品种的纯度。

通过引入内参品种和杂交掺杂品种进行PCR反应，可以对辣椒的纯度进行定量的评估。

可以通过与已知品种DNA的比对，确认未知样品的品种。

辣椒基因组SSR引物的开发及其在品种纯度分子鉴定中的应用，为辣椒种植者和消费者提供了一种准确、可靠的品种鉴定方法，可以用于指导辣椒的种植和市场销售。

SSR引物的开发也为辣椒基因组学研究和品种改良提供了重要的工具和平台。

湖南农业大学学报(自然科学版)2023，49(5)：558–566．DOI：10.13331/ki.jhau.2023.05.009Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)引用格式：杨光彬，王瑾，陈恺琳，单庆云，崔苏菲，熊程，邹学校，刘峰．辣椒MADS–box基因家族的鉴定及表达分析[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2023，49(5)：558–566．YANG G B，WANG J，CHEN K L，SHAN Q Y，CUI S F，XIONG C，ZOU X X，LIU F．Identification andexpression analysis of the MADS-box gene family in Capsicum annuum[J]．Journal of Hunan AgriculturalUniversity(Natural Sciences)，2023，49(5)：558–566．投稿网址：辣椒MADS–box基因家族的鉴定及表达分析杨光彬1，王瑾3,6，陈恺琳3，单庆云3，崔苏菲3，熊程2,3,4,5，邹学校2,3,4,5，刘峰2,3,4,5*(1.湖南大学隆平分院，湖南长沙410125；2.岭南现代农业实验室，广东广州510642；3.湖南农业大学园艺学院，湖南长沙410128；4.园艺作物种质创新与新品种选育教育部工程研究中心，湖南长沙410128；5.蔬菜生物学湖南省重点实验室，湖南长沙410128；6.南京农业大学园艺学院，江苏南京210095)摘要：利用辣椒的全基因组数据鉴定到104个MADS–box基因，对它们的理化性质、染色体定位、系统进化关系、蛋白保守基序和组织表达水平进行分析。

结果表明：辣椒MADS–box基因家族各成员在染色体上的分布不均，理化性质差异较大，104个家族成员编码的氨基酸长度为100~567 aa，蛋白相对分子质量为11 203.9~ 63 559.7，蛋白理论等电点(PI)为4.63~10.46，系统进化树分析结果表明，辣椒MADS–box基因家族可分为2大类，与拟南芥和番茄的进化关系类似；组织表达水平分析结果表明，CaMADSs主要在花、果实和种子中表达，在叶片中表达量相对较低，推测MADS–box基因可能参与调控果实的发育和成熟。

转基因植物的检测与鉴定宫雪超于丽杰高金秋哈尔滨师范大学环境与生命科学院黑龙江哈尔滨摘要对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围转基因植物的检测和鉴定方法转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述关键词转基因植物检测鉴定评价中图分类法文献标识码文章编号植物转基因实验因受体系统的限制外源基因的转化频率较低为了达到转化目的必然要获得大量的转化材料如何在数以千万计的转化植株或细胞中快速有效地检测出转基因阳性植株或细胞外源基因是否整合到植物染色体上整合的方式如何整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题就成为重要的研究课题根据外源基因表达的不同水平对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行整合水平转录水平和翻译水平本文从外源基因表达的不同水平阐述转基因植物的检测与鉴定外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功首先是对报告基因进行检测必要时再进行目的基因的检测检测目的基因需要采用分子杂交方法报告基因报告基因必须具有两大特点一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在二是便于检测目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因现在常用的报告基因主要有基因基因冠瘿碱合成酶基因H基因基因基因荧光素酶基因二氢叶酸还原酶基因等近年来绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用并显示出较其他几个报告基因更大的优越性基因的检测基因具有以下优点①适用于各种生物的基因转化②检测方法简便无需底物酶辅因子等物质只要有紫外光或蓝光照射其表达产物就可以发出绿色荧光这对转化细胞的检测极为有利③便于活体检测十分有利于活体内基因表达调控的研究④检测时可获得直观信息有利于转基因植物安全性问题的研究及防范若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时很容易通过光照获得直观信息基因的检测基因也是广泛用作转基因植物细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中基因应用的最多基因端与其他结构形成的融合基因能正常表达所产生的融合蛋白仍具有活性这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件这是它的一大优点但是需要注意的是有一些植物在胚胎状态时能产生内源活性在转基因和代的子叶花粉和胚珠中检测到活性随着组织的成熟衰老表达逐渐停止在实验过程中要设定严格的阴性对照活性的检测方法有很多包括组织化学法色谱法荧光法等其中植物切片组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法转基因植株的检测聚合酶链式反应是首选的转基因产品检测方法技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段可以检测到每克样品含有～的转化基因成分对转基因产品大分子量检测的灵敏度可以达到样品含量的因为的高度特异性及检测所需的模板量仅为以内所以为外源基因整合的检测提供了便利条件尤其是在转化材料少又需及早检测的时候现在已经利用该技术对欧美杨番茄辣椒葡萄豆瓣菜小麦等转基因植物进行鉴定是转基因植物鉴定中最简单最常用的方法检测具有用量少操作简单成本低耗时少不需要同位素等优点但检测也存在缺点由于扩增十分灵敏有时会出现假阳性扩增因此检测只能作为初步结果杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是杂交只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物年第期牡丹江师范学院学报自然科学版总第期收稿日期利用杂交~可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置~拷贝数以及转基因植株世代外源基因的稳定性]分子杂交是进行核酸序列分析~重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段~它具有灵敏性高~特异性强的特点~是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号~准确度高~但杂交程序复杂~成本高~且对实验技术条件要求较高根据杂交时所用的方法~核酸分子杂交又可分为印迹杂交<>~斑点<>杂交或狭缝<>杂交和细胞原位<>杂交等现在已在水稻]~玉米~大白菜]~豆瓣菜]~马铃薯~杏~烟草等植物中得到广泛应用外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是杂交~它以和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达杂交杂交和杂交相比~更接近性状表现~更具有现实意义~被广泛用于转基因植物的检测~]~现已用于杨树~豆瓣菜~马铃薯~草莓~烟草等转基因植物的检测中但提取条件严格~在材料内含量不如高~不适于大批量样品的检测检测<>也是检测外源在植物体内转录表达的一种方法如果从细胞总提取物中得到特异的扩增条带~则表明外源基因实现了转录此法简单~快速~但对外源基因转录的最后决定~还需与杂交的实验结果结合外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的杂交杂交是集蛋白质电泳~印迹和免疫测定为一体的检测方法它具有很高的灵敏性~可以从植物细胞总蛋白中检出的特异蛋白质~若是提纯的蛋白质~可检出～杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果~可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达~表达的浓度大小及大致的分子量能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录~翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现一般来讲~杂交的结果与性状表现有直接关系~]检测<酶联免疫吸附法>是一种利用免疫学原理检测抗原~抗体的技术由于酶的放大作用~使测定的灵敏度极高~可检测出的目的物~同时酶反应还具有很强的特异性除了可溶性抗原<抗体>之外~还可以检测含表面抗原的细胞该方法已用于辣椒~水稻~烟草~番茄~]等转化植株的鉴定工作中的检测虽然很灵敏~但容易出现本底过高的问题~应予以充分的注意蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于的改进方法或者~用于转基因植物表达量的检测]先将特异性抗体吸附在膜上~将膜蘸入样品溶液~蛋白质随着液相扩散~遇到抗体~发生抗原抗体反应~通过阴性对照筛选阳性结果~给出转基因成分含量的大致范围此方法操作简单~费用低~耗时少<～>原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交<>~使用放射性同位素标记~放射自显影检出该方法灵敏性强~对于单拷贝的序列检出非常有效原位杂交可以分为三个层次:①染色体原位杂交~可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式~还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性~外源基因表达的影响~以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;②组织细胞原位杂交~对特定的基因表达的进行组织细胞分布的空间定位~获得外源基因在植物组织细胞内表达情况<是否表达~表达位置~表达量等>;③外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位~指利用外源基因表达蛋白的抗体~通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布该方法也是研究转基因植物中外源基因功能~外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段检测方法的评估用提取方法对目的基因进行检测方法简便~适合大批量样品的分析~又能检测目的基因的完整性~是早期检测的较好方法]~~杂交分别从整合~转录~翻译水平检测外源基因~是检测外源基因最经典~最可靠的方法虽然现在出现了一些像~等功能类似~方便快捷的检测技术~然而由于其技术本身的原因~还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴年第期牡丹江师范学院学报!自然科学版"# !总第期"定上的权威地位随着科学技术的发展 各种新的检测方法也在不断涌现 例如生物传感器筛选法 远红外线光谱法 定量 实时基因芯片等 每种检测方法都有其自身的优点和不足 应该根据不同的检测目的和要求 选择合适的方法 在实际工作中把几种方法结合运用 可获得外源基因不同表达水平的信息 是准确检测转基因植物产品的合理策略参考文献王学聘 卞祖娴 张晋华 等 欧美杨转基因植物的 检测 林业科学 朱新产 导入外源 对小麦基因表达的影响 西北植物学报 刘建强 孙仲序 赵春芝 转基因植物鉴定方法的研究概况 山东林业科技 李乃坚 袁四清 卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 广东农业学报毛慧珠 唐惕 曹湘玲 等 抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 中国科学 辑编辑 琳莉收稿日期 基金项目 黑龙江发展高新技术产业专项资金无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛黑龙江省农业科学院绥化研究所 黑龙江绥化摘要 研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种 不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响 结果表明 无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳 无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种以早大白最佳 关键词 无基质 马铃薯 脱毒小薯 中图分类法 文献标识码 文章编号在马铃薯良种繁育体系中 原种的生产是关键环节 其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产 无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法 其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际 使马铃薯根际获得充分的养分 促进马铃薯块茎的生长 马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段 提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题 为此 本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不年第 期牡丹江师范学院学报 自然科学版总第 期转基因植物的检测与鉴定作者：宫雪超， 于丽杰， 高金秋， GONG Xuechao， YU Lijie， GAO Jinqiu作者单位：哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江,哈尔滨,150025刊名：牡丹江师范学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF MUDANJING TEACHERS' COLLEGE(NATURAL SCIENCES EDITION)年，卷(期)：2007(1)被引用次数：3次1.Datta S K;A Petew 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辣椒CaMAPK7启动子顺式作用元件及其表达分析杨明星;申磊;文嘉瑜;唐倩;石兰平;刘艳艳;杨晟;胡炯;刘彩玲【摘要】促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生长、发育和适应环境中起着十分重要的作用,但对该家族多数成员的表达调控机制认识仍十分有限.前期实验已分离获得辣椒一个MAPK家族成员CaMA PK7,并发现该基因的表达受病原菌、高温等逆境的诱导,但其表达调控机制仍不清楚.本研究进一步分离了CaMA PK7的启动子序列(pCaMAPK7),发现其TATA框位于-165 bp与-170 bp之间,此外还发现W-box,HSE,TCA,LTR,ERE等多种与生物及非生物逆境胁迫应答相关的顺式作用元件.通过构建该启动子与报告基因GUS融合表达载体pCaMA PK7::GUS,利用农杆菌介导的本氏烟草叶片瞬间表达系统分析发现pCaMA PK7可应答青枯菌接种及水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、油菜素内酯(BR)、脱落酸(ABA)和乙烯(ET)等外源激素处理,表明CaMA PK7应答青枯菌、外源激素处理主要是通过该启动子介导的转录调节实现的.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2015(036)004【总页数】7页(P673-679)【关键词】辣椒;启动子;烟草瞬间表达系统【作者】杨明星;申磊;文嘉瑜;唐倩;石兰平;刘艳艳;杨晟;胡炯;刘彩玲【作者单位】福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州350002;福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002;福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002;福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002;福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002;福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学生命科学学院,福建福州 350002;福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002;福建农林大学作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室,福建福州 350002;福建农林大学作物科学学院,福建福州 350002【正文语种】中文【中图分类】S641doi10.3969/j.issn.1000-2561.2015.04.007MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）联结一般由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成，广泛存在于真核生物中，参与介导细胞的生长、发育、分裂、分化及凋亡等多种生物学过程的调节，并与生长素、脱落酸、乙烯和细胞分裂素等信号通路有关，在植物生长、发育和适应生物胁迫及非生物胁迫的信号传导中起重要的调节作用，但其表达调节和作用机制仍不清楚。

第14卷第09期 南方农业 2020年3月Vol.14 No.09 South China Agriculture Mar. 2020近年来，辣椒、草莓的种植面积越来越大，已成为我国主要的经济作物。

辣椒是人们餐桌上较为普遍的食材，其种植面积仅次于大白菜；草莓因果实色泽亮丽、营养价值较高，而备受栽培者和消费者的喜爱[1-4]。

但随着辣椒的连年种植及种植面积的逐年增多，辣椒病害发生也越发严重，其中由镰刀菌引起的辣椒枯萎病是辣椒生产栽培中最典型的病害之一。

我国辣椒枯萎病发病率一般为15%～30%，个别地区严重时高达70%～80%，造成巨大经济损失。

随着草莓种植面积的不断扩大，品种的不断更新，频繁地调种、引种以及连作也导致了草莓枯萎病蔓延。

再加上草莓灰霉病、白粉病、蛇眼病、炭疽病、红中柱根腐病、根结线虫病、病毒病和革腐病等不断发生且越发严重，给栽培者带来较大的经济损失[5-7]。

目前，国内外关于辣椒枯萎病、草莓枯萎病致病菌的报道有很多。

对由尖孢镰刀菌引起的辣椒枯萎病、草莓枯萎病的防治方法一般仍以化学防治为主，常用恶霉灵、多菌灵和甲基托布津和代森锰锌等杀菌剂进行灌根防治，但因连年使用这些药剂，防治效果逐年降低，甚至达到无法控制的程度[8-9]。

由于该病害很难通过植物抗病防御及抗性育种的方法防治，因此研究选用化学杀菌剂氟硅唑、吡唑醚菌酯和氰烯菌酯对辣椒枯萎病和草莓枯萎病进行了药剂实验。

据报道，氰烯菌酯对小麦赤霉病及水稻恶苗病均有良好的防治效果，但对辣椒枯萎病的防治是否有效果还未见报道；氟硅唑、吡唑醚菌酯在番茄颈腐病与根腐病的防治上有较好的防治效果[7]，但对草莓枯萎病的防治是否有效鲜有报道。

1 材料与方法1.1 实验材料实验品种为淮安红椒、红颜草莓。

供试杀菌剂为氟硅唑、吡醚菌酯和氰烯菌酯，由江苏农药研究所提供。

药剂存放于0～4 ℃环境中。

1.2 尖孢镰刀菌专化型的分离纯化与鉴定从植株根际土壤中分别采取辣椒与草莓土样10 g ，各采取5组土样。

辣椒基因组SSR引物的开发及品种纯度分子鉴定随着分子生物学和生物技术的发展，分子标记技术成为种质资源鉴定和育种工作中的一种重要手段。

SSR（Simple Sequence Repeat，简单重复序列）是一种功能强大、信息量大、重复性好的分子标记，在植物种质资源鉴定和亲缘关系研究中得到了广泛应用。

本研究旨在开发辣椒基因组SSR引物，并利用这些引物对辣椒品种进行纯度分子鉴定，为辣椒品种的鉴定和育种工作提供理论依据和实践指导。

（一）辣椒基因组DNA提取选取辣椒不同品种的幼叶进行基因组DNA提取，采用CTAB法或商业DNA提取试剂盒进行提取。

通过紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，保证提取的DNA质量优良。

（二）辣椒基因组SSR引物的筛选利用计算机软件对辣椒基因组进行全面扫描，寻找其中的SSR位点。

依据SSR位点周围序列设计引物，要求引物长度在18-22碱基之间，GC含量在40%-60%之间，Tm值在55-65℃之间。

通过聚合酶链反应（PCR）对引物进行验证，筛选出稳定、特异、重复性好的SSR引物。

选取几个已知的辣椒品种进行SSR引物的验证，检测引物扩增的效果和多态性。

通过琼脂糖凝胶电泳分析引物扩增片段的长度和数量，评估引物的多态性。

最终确定一批稳定、具有多态性的辣椒基因组SSR引物。

二、辣椒品种纯度分子鉴定（一）PCR扩增反应体系的建立根据已确定的SSR引物序列，建立PCR扩增反应体系。

优化反应条件，包括引物浓度、模板DNA浓度、Mg2+浓度、引物退火温度和循环数等因素，以保证PCR扩增的效果。

（二）PCR扩增反应的进行选取不同辣椒品种的DNA作为模板，利用已建立的PCR扩增反应体系进行扩增。

通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，观察不同品种之间的差异。

（三）数据分析对PCR扩增产物的数据进行分析，根据扩增片段的长度和数量，对不同辣椒品种进行聚类分析，评估它们之间的亲缘关系和差异程度。

通过以上研究方法，可以开发出一批稳定、具有多态性的辣椒基因组SSR引物，并建立起一套快速、准确的辣椒品种纯度分子鉴定方法。