2014检测及部1

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2014检测及部位
2014年1月-2014年5月
完成海洛因复吸大鼠海马、VTA GRP78、CRT的变化及针刺调节作用的研究
2014年6月-2014年11月
完成针刺百会、大椎穴对海洛因复吸大鼠海马跨膜感受蛋白、转录因子影响的研究
2014年12月
完成年度研究计划总结
3. 海洛因复吸大鼠分子伴侣和折叠蛋白的变化及针刺调节作用的研究
蛋白质的正确折叠需要内质网中蛋白质分子的参与。

其中主要有分子伴侣和折叠蛋白:热休克蛋白家族(HSP)的糖调节蛋白(GRP78)、钙网织蛋白(CRT)等。

GRP78是内质网应激的标志性分子伴侣蛋白、也是钙离子结合蛋白和细胞为适应应激状态所产生的应激蛋白。

CRT能将未折叠蛋白定位于内质网管腔内,并协助其折叠,也是内质网驻存的重要Ca2+结合蛋白,参与维持细胞Ca2+稳态、调节细胞凋亡。

GRP78、CRT伴侣蛋白能快速与转运入内质网管腔的新合成蛋白结合,参与新蛋白的折叠、寡聚化、成熟等翻译后修饰过程,帮助未折叠蛋白形成具有活性的功能性蛋白,转移至高尔基体,防止未折叠/错误折叠蛋白质的输出,具有促进细胞生存的作用。

运用分子生物学技术,观察海洛因复吸大鼠海马、VTA分子伴侣和折叠蛋白的变化,对UPR通路的部分主要关键基因GRP78、CRT加以验证性的
5、针刺百会、大椎穴对海洛因复吸大鼠跨膜感受蛋白分子影响的研究
内质网膜上的IRE1、PERK、ATF6蛋白分子是感受内质网内应激信号的跨膜感受蛋白,与内质网腔内GRP78结合形成复合物,且处于无活性状态。

当细胞内未折叠蛋白累积时,细胞启动UPR,分别通过IRE1,ATF6以及PERK通路调控下游基因的表达。

GRP78分子转而结合内质网中不断增多的新生未折叠蛋白,从而导致IRE1、PERK、ATF6从其GRP78复合物中解离出来,形成Elf2a磷酸化、JNK激活、XBP-1剪切,继而通过CHOP、JNK通路诱导细胞凋亡。

IRE1是一种跨膜丝/苏氨酸受体蛋白激酶,具有核酸内切酶活性,内质网应激关键标志分子。

PERK (蛋白激酶R样ER激酶)是重要的ER跨膜蛋白,ERS时GRP78与PERK的解离激活PERK,诱导激活型转录因子4 (ATF4)转录及其下游靶分子CHOP表达,促进细胞凋亡。

ATF6是定位于内质网膜的Ⅱ型跨膜蛋白, UPR信号转导通路转录因子,它的过表达可以激活UPR,引起内质网应激。

XBP-1蛋白是UPR信号转导通路中另一个重要的转录因子,剪切后的XBP1mRNA 可编码新的XBP1蛋白,该蛋白是具有活性的转录因子,能促进自身基因的转录及内质网应激相关的其他靶基因(包括GRP94和GRP78等)的转录。

XBP-1蛋白缺失会造成内质网内蛋白负荷增加,从而介导凋亡途径。

运用分子生物学技术,对未折叠蛋白反应通路的部分主要关键基因,加以验证性的检测分析,观察海洛因复吸大鼠海马、VTA 的IRE1、ATF6、PERK、XBP-1、Elf2a表达、阐述针刺干预海洛因脑损伤的分子机制。

部位海马CA1-4区的最大层面、VTA(右侧脑组织)
检测
RT-PCR、Western blot方法检测
GRP78(Bip)、CRTm蛋白表达及GRP78(Bip)、CRTmRNA的表达。

免疫组化、RT-PCR方法IRE1、ATF6、PERK、XBP-1、Elf2a的检测
PERK Elf2a CHOP 凋亡
激活的PERK 磷酸化elF2,抑制一般蛋白质的合成;引起细胞周期阻滞;增加Bip 蛋白的表达。

CHOP 通路是调节内质网应激诱导细胞凋亡的主要通路。

CHOP 在正常情况下CHOP主要存在于细胞质中,含量很低。

在细胞处于应激状态下CHOP的表达量大大增加并聚集在细胞核内;过量表达的CHOP能促进细胞凋亡。

IRE1 JNK 凋亡
IRE1 募集TRAF2、ASK 和JIK 蛋白形成三聚体,激活JNK,随后激活c-jun,并抑制Bcl-2,诱导细胞凋亡;能促进XBP1 切割成XBP1S。

ATF6 XBP-1 凋亡
ATF6 与Bip 蛋白解离后,转移至高尔基体,被S1P和S2P切割后激活,进入细胞核,激活UPR相关基因的表达。

在内质网应激的情况下,跨膜蛋白IRE1/ERN1、PERK/PEK、ATF6 在转录和翻译水平介导三条不同的信号通路。

GRP78(Bip) GRP78也称为BiP(免疫球蛋白重链结合蛋白)
CRT钙网织蛋白
XBP-1 X盒结合蛋白1
过表达XBP1不仅能逆转药物引起的细胞周期阻滞和细胞凋亡[47],也能激活细胞内IGF1/Akt 途径,减少细胞凋亡[48]。

ATF6 内质网II型跨膜蛋白
IRE1 是一个内质网Ⅰ型跨膜糖蛋白是一种核糖核酸酶,在细胞内具有激酶活性和RNA酶活性
PERK 是一个内质网Ⅰ型跨膜蛋白,属于Elf2a蛋白激酶家族成员
Elf2a(S51A)
Elf2a的磷酸化可以上调ATF4的表达,ATF4能上调CHOP的表达。