酶循环法及其在酶法分析中的应

浅析现代化生物工程中酶技术的研究与应用人类生命物体的基本特征之一就是不断地进行新陈代谢，新陈代谢是由许多有机化学反应组成的，如动植物的消化反应和各种物质的合成与分解等。

这些反应在体内进行地很快，原因是有生命的动植物体内存在着的一种生物催化剂一酶的作用。

酶制剂是在1833年由法国化学家佩思和珀索发现的，他们从麦芽提取液的酒精沉淀物中得到一种对热不稳定，而且能加速淀粉转变成糖的物质，称之为淀粉酶制剂。

1926年隆姆首次从刀豆中提纯得到脲酶结晶。

生物化工行业经过70多年的发展，对酶的分子结构，酶作用的机理及酶系统的自我调节已形成了一个完整的工业体系。

整个行业也出现了一些新的发展态势，在阐明生命活动的规律，探索工业、农业、畜牧业、医药及对疾病的诊断、治疗均有重要的意义。

新陈代谢包含了一些重要的有机化学，对于生命周期的循环起着重要的保障作用。

作为常见的生物催化剂，酶的存在有利于加快新陈代谢速度，从根本上保证了相关化学反应的持续进行。

最初的淀粉酶主要是从麦芽提取液中得到的。

此后随着现代生物工程技术的不断发展，研究工作者对于各种生物酶的结构和特性有了更加深入的了解，为这些酶应用范围的扩大奠定了坚实的基础。

1.1生物酶的主要特点生物酶本质上是一种蛋白质，主要产生于某些机体活细胞，在实际的应用中具有良好的催化效果。

常见的酶促反应主要是指生物酶参与的反应，对相关物质代谢速度的加快带来了一定的保障作用。

生物酶的主要特点包括:(1)高效的催化效率。

相对而言，酶的催化效率远远高于一般的催化剂，最大为1013倍;(2)稳定性差。

作为机体活细胞的蛋白质，生物酶很容易受到各种存在因素的影响，导致蛋白质现象的出现，从而使酶失去了活性。

这些内容客观地反映了生物酶稳定性差的特性;(3)专一性非常强。

一般的催化剂在实际的应用中可能会有多种选择。

而生物酶只针对一种化合物发挥自身的催化作用，具有高度的专一性;(4)酶活力可以随时调节。

蛋白酶在存在的过程中有着良好的特性，不同类型蛋白酶通过一定的机制实现彼此间的有效结合，才能具有更好的催化活力。

R1+S+R2 孵育时间 150sec
比色杯光径
1.0cm
R1+S+R2 反应时间 1-3min
操作步骤：
标本
10
试剂 1（R1）
180
混匀，置 37℃孵育 3-5 分钟
试剂 2（R1）
50
混匀，置 37℃孵育 150 秒，在测定波长下检测 1-3 分钟吸光度变化，计算△A/min
全自动生化分析仪自身自带的程序参数输入法，上述的基本参数需要结合全自动分析仪自有的程
同型半胱氨酸-甲基转移酶催化下与 S-腺苷同型半胱氨酸（SAM）反应生成甲硫氨酸和 S-腺苷同 型半胱氨酸（SAH）。SAH 被 SHA-水解酶水解形成腺苷和 Hcy。生成的 Hcy 进入 Hcy-甲基转移 酶催化的催化反应，形成循环反应。这个循环反应导致了检测信号的明显放大。形成的腺苷立即 脱氢转化为次黄苷和氨，氨进一步在谷氨酸脱氢酶催化下和 NADH 反应，将 NADH 转化变为 NAD。在 340.nm 处检测 NADH 减少造成的吸光度下降量与样品同中性半胱氨酸的浓度成比例。
高蛋白饮食，可导致 HCY 升高。血清样本检测结果常比抗凝血浆检测结果高 5-10%。
检测方法：
1、试剂配制：本试剂为液体，可直接使用。
2、测定条件：
主波长
340nm
标本
10 uL
副波长
405nm
R1
180 uL
反应温度
37℃
R2

50 uL
反应方向
向下
R1+S 孵育时间
3-5min
反应方法
两点速率法
检测意义： 本试剂通过测定人血清同型半胱氨酸的浓度，辅助相关疾病的诊断。同型半胱氨酸主要作为

电化学分析在生物科学中的应用电化学分析是指应用电化学原理和技术对各种物质进行定性、定量分析的方法。

在生物科学领域，电化学分析已经成为了不可或缺的分析手段之一。

在此，我们将探讨电化学分析在生物科学中的应用。

一、电位滴定法电位滴定法是电化学分析中最常用的一种方法。

该方法利用电极电位变化来测量被测物质的浓度和化学特性。

在生物科学中，电位滴定法常常用于测定血液pH值及肌酸酐和肌酸含量等。

此外，该方法也可以用于分析脂质代谢物的含量，并且精度较高，操作简单方便。

二、循环伏安法循环伏安法是一种测定电极反应动力学和溶液中电极过程的电化学分析方法。

此方法在生化学领域中广泛应用，例如在酶学研究中，循环伏安法可以用于确定电极反应机理、测定酶催化反应中的电化学参数以及测定酶活性等。

此外，在蛋白质电化学研究中，也可以利用循环伏安法测定蛋白质的电化学性质和氧化还原峰等。

三、电导法电导法是通过导电介质中电流的流动情况来对其进行分析的方法。

在生物科学领域，电导法广泛应用于红细胞、血浆、组织液和细胞液中电解质的分析。

此外，电导法还可以用于测定酸碱平衡和生物体内的水分含量等。

四、计时安培法计时安培法是测定电解液中溶质或痕量元素含量的一种电化学分析方法。

该方法需使用特殊电极，在恒定电流下进行测量，可以精准测定多种元素的含量，包括金属元素、溶解态无机阴离子等。

在生物科学研究中，计时安培法可以用于检测生物体内的微量元素的含量及其代谢过程中的变化，从而对疾病诊断和治疗提供重要参考。

五、微量元素测试法微量元素测试法是指对生物体内微量元素进行定量测定的方法。

微量元素在生物体内的含量虽然很少，但对生命活动具有重要作用。

在生物科学研究中，微量元素测试法可以用于研究不同生物体内微量元素含量的差异，探索微量元素参与生命活动的作用机理，以及为生命科学研究提供更深入的数据支持。

总之，电化学分析在生物科学中具有广泛的应用前景，可以用于测定生命体内的各种生物活性物质及其化学组成、化学性质，为生命科学研究提供有力的支持和帮助。

１ ． ８ ７ 、 ２ ． ８ ｏ ， 精 密 度 良好 ； Ｈｃ ｙ水 平 ２ ． ０ ０ ￣４ ０ ． ０ ０／ ， ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， 检 测 线 性 良好 （ ｒ 一０ ． ９ ９ ７ ３ ） ； 比对试 验 ： 与 西 门 子 ＡＤ ． ＶＩ ，Ａ Ｃ ｅ ｎ ｔ ａ ｕ ｒ
Ｘ Ｐ检 测 系统 比 较 ， Ｈｃ ｙ 检 测 结 果 相 关 性 良好 （ ｒ 一０ ． ９ ７ ０ ８ ， 一 ４ ０ ） ， 两 种 检 测 方 法 检 测 结 果 均 值 比 较 差 异 无 统 计 学 意 义 ＜ Ｐ ＞ ０ ． ０ ５ ） ； 平均回收率为 ９ ５ ． ２ ～１ ０ ３ ． １ ； 肿 瘤 患 者 血 清 Ｈｃ ｙ水 平 较 健 康 对 照 组 明 显 升 高 ， 差异有统计学意义（ Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） 。
ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｃ ｌ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｖ ａ ｌ ｕ ｅ ｏ ｆ Ｈｃ ｙ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ． Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ Ｔｈ ｅ ｐ ｒ ｅ ｃ ｉ ｓ ｉ ｏ ｎ， ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｉ ｓ ｏ ｎ ｔ ｅ ｓ ｔ ， ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｙ
应 用 美 国， ６床 实验 室标 准 化 协 会 的标 准化 评 价 方 案 评 价 循 环 酶 法 测 定 血 清 Ｈｃ １ ｙ的 精 密 度 、 比对试验 、 回收试 验、 线性 范 围
等 。 同 时检 测 ８ ０ ６例 肿 瘤 患者 ， ６ ７例 健 康 体 检 者 （ 健 康对照组） 血 清 Ｈｅ ｙ水 平 。墩 据 分 析 采 用 方 差 分 析 、 两独 立 样 本 检 验 、 相 关 性 分 析 等 。 结 果 精 密 度 ： 循 环 酶 法 测 定 血 清 Ｈｃ ｙ低 、 高 水 平 的 批 内 变 异 系数 （ Ｃ Ｖ ） 分别为 ２ ． ６ ９ 、 ３ ． ３ ５ ， 日 间 ＣＶ ， 分 别 为

同型半胱氨酸测定试剂盒(酶循环法)的检测评价郭芳; 应英; 李梅; 于丽丽【期刊名称】《《中国医疗器械信息》》【年(卷),期】2019(025)017【总页数】3页(P13-14,23)【关键词】同型半胱氨酸; 试剂盒; 酶循环法; 检测【作者】郭芳; 应英; 李梅; 于丽丽【作者单位】辽宁省医疗器械检验检测院辽宁沈阳 110179【正文语种】中文【中图分类】TH776同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是蛋氨酸的中间代谢产物，其依附于血管内壁[1]。

近些年的研究发现，Hcy与动脉粥样硬化和心血管疾病的危险性成正相关，被认为是动脉粥样硬化导致的心血管疾病最显著的独立危险因素，同时，Hcy 水平升高将刺激血管壁并可能引起动脉血管损伤，导致形成炎症和管壁斑块[2]。

目前国内外普遍将Hcy作为常规检测项目，用于判断动脉粥样硬化和心脑血管疾病的危险性[3]。

Hcy的检测方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫吸附法等。

近年来，由于具有快速、简便、灵敏度高、自动化程度高等特点，酶循环法发展迅速，已逐渐成为各级各类实验室常用的检测方法[4]。

本文按照YY/T 1258-2015《同型半胱氨酸测定试剂（盒）（酶循环法）》和企业产品技术要求，对同型半胱氨酸测定试剂盒（酶循环法）进行检测评价，对检测过程中遇到的问题进行分析讨论。

1.材料与方法1.1 仪器与材料日立7100全自动生化分析仪；同型半胱氨酸测定试剂盒（酶循环法）（国内某生物科技公司）；质控品：心肌多项标志物检测用质控品（RANDOX，货号：CQ3100，批号：453728）。

1.2 方法生化分析仪基本参数设置见表1。

校准程序：使用两个水平校准品，进行2点校准，采用线性校准模式。

表1. 生化分析仪基本参数设置测定模式反应方向测定温度波长反应时间样本量试剂R1 试剂R2速率法负反应37°C 340nm 10min 13μL 240μL 60μL表2. Hcy测定试剂盒的线性范围检测结果理论值(μmol/L) 在效期批过期批实测均值(μmol/L) 绝对偏差(μmol/L) 相对偏差(%) 实测均值(μmol/L) 绝对偏差μmol/L 相对偏差(%)4.2 3.9 -0.2 - 4.5 -0.1 -12.1 12.1 - 0.4 12.3 - -1.020.0 20.1 - 0.7 20.2 - -0.627.8 28.0 - 0.5 28.8 - 2.035.7 35.8 - 0.2 36.3 - 0.443.6 43.4 - -0.5 43.7 - -0.9表3. Hcy测定试剂盒的测量精密度检测结果批间差均值(μmol/L) 标准差(μmol/L) 变异系数(CV) 均值(μmol/L) 批间相对极差在效期批水平1 9.5 0.21 2.2% 9.5 2.8%水平2 18.9 0.43 2.3% - -过期批水平1 9.7 0.28 2.8% - -水平2 19.5 0.16 0.8% - -批次样本重复性表4. Hcy测定试剂盒的准确度检测结果批次样本浓度(μmol/L) 样本体积(μL) 纯品浓度(μmol/L) 纯品体积(μL) 实测均值(μmol/L) 回收率在效期批 7.4 0.8 140.08 7.9 92.1%7.4 0.8 28 0.08 9.2 98.5%过期批 7.4 0.8 14 0.08 8.4 100.2%7.40.8 28 0.08 9.9 109.0%2.结果2.1 外观试剂R1为无色澄清液体，R2为浅黄色澄清液体，无沉淀及絮状悬浮物。

一. 名词解释1．生物酶工程又称高级酶工程它是酶学与现代分子生物学技术相结合的产物。

2．蛋白质工程蛋白质工程就是运用蛋白质结构功能和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质。

3.多核糖体把细胞放在极其温和的条件下处理，就能得到几个到几十个核糖体在一条mRNA上结合起来的形态4.固定化酶水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。

在催化反应中以固相状态作用于底物5.酶反应器以酶或固定化酶为催化剂进行酶促反应的装置。

6．酶工程又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术7.生物传感器对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。

8. motif (模体)指的是蛋白质分子结构中介于二级结构与三级结构之间的一个结构层次，又称超二级结构9. domain功能域生物大分子中具有特异结构和独立功能的区域,特别指蛋白质中这样的区域10.PDB蛋白质数据库（Protein Data Bank,PDB）是一个生物大分子，11. DNA shuffling体外同源重组技术。

通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。

12.生物催化剂是指生物反指应过程中起催化作用的游离或固定化细胞各游离或固定化酶的总称13.必需基团有的基团既在结合中起作用，又在催化中起作用，所以常将活性部位的功能基团统称为必需基团(essential group)14.活性中心。

酶的活性中心是酶与底物结合并发挥其催化作用的部位。

15.有性PCR dna改组16.DNA改组通过改变单个基因原有的核苷酸序列创造新基因，并赋予产物以新功能。

17.免疫传感器偶联抗原/抗体分子的生物敏感膜与信号转换器组成的，基于抗原抗体特异性免疫反应的一种生物传感器。

18.易错PCR是从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。

2014-7-16
第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
酶循环法
体液中某些微量物质的准确测定 利用酶的底物特异性来放大靶物质来 测定 传统的酶反应只能按靶物质的量生成 相应的产物量 酶循环法则可在一定的反应时间内通 过靶物质的重复反应来增加产物的量 而提高灵敏度
2014-7-16 第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
测定方法
取样测定法
在酶反应开始后不同时间，从 反应系统中取出一定量的反应液 基于底物和产物在物 并停止其反应，再根据产物和底 理化学性质上的不同， 物的性质差别，选用适当的检测 在反应过程中对反应系 方法进行定量分析，求得单位时 统进行直接连续检测 间内酶促反应的变化量 准确性和测定效率都 添加酶变性剂 ：5％的三氯醋 较好 酸、 3％的高氯酸或其它酸、碱、 醇类
⑤不需要考虑反 应是否进行完全
2014-7-16
第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
动力学分析法
注意问题---被测物是底物：[S]＜Km ，v=k＊[S] 被测物是辅酶：另一底物浓度足够高 被测物是活化剂：要求低浓度 被测物是抑制剂
不可逆：线性关系，由绝对量决定 可逆：低浓度
2014-7-16 第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
酶法测定血清磷脂
三联酶终点法 利用磷脂酶、胆碱氧化酶、过氧化物 酶，水解，测定产物吸光度 测定
2014-7-16
第十三章 生化药物和基因工程药 物分析概论----酶法
酶传感器
将酶法分析与固定化酶以及自动化测 定技术结合在一起，构建成酶传感器 酶传感器一般由固定化酶和电化学装 置（电极）组合构建而成，又称为酶 电极 葡萄糖酶传感器最为成熟

优点：



不需要特殊复杂的设备和仪器 灵敏度高 重复性好 对健康无害
应用前景



食品卫生 环境污染生化 指标 临床医学
“瘦肉精”快速检测新技术 ——竞争酶标免疫法
“瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的 作用于β —肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气 肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5—10倍时， 可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦 肉精”。
应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。
终点法要操作中应注意：
(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于1级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用员。 (2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。
底物？ pH？ 温度？ 样品？
二、测定中应注意的问题 1.初速度
底物浓度对酶速的影响
浓度选择： a） [s]>=100Km； b） 有时不宜采用高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等)则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。
作用于待测酶产物的其它酶；
（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。
三、酶标免疫分析法
Enzyme Immunoassay (EIA)
在70年代初，从放射免疫分析发展起 来的一种称为“酶标免疫”的分析方法， 它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能 力有机地结合在一起，建立的一种高度特 异、灵敏的分析方法。
放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)是用放射 性同位素标记抗原Ag*，该抗原与未标记抗原Ag竞 争结合抗体(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应 生成的Ag*-Ab复合物与Ag的量呈负相关。Ag*-Ab的 生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知 浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度， 这种分析方法称为放射免疫分析。

酶循环法及其在酶法分析中的应用
杨昌国;许叶
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2001(19)5
【摘要】@@ 由于酶法测定的特异性好,检测简便,反应温和,无污染,且灵敏度较高(10～100 μmol/L),已能满足体液中大部分物质的测定,因此在临床化学测定中已广为应用.随着临床化学的发展,体液中某些微量物质的准确测定逐渐显得重要.酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质(被测物)的测定方法.此法仅循环靶物质,减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰,因此不需要对样品进行预处理或对靶物质的提取,而且该法不需要专门的设备,是一种前景广阔的测定技术.日本旭化成(Asahi Chemical)公司发展了这一技术,笔者参考旭化成公司的有关资料[1～3],将这一技术介绍给国内同道.
【总页数】2页(P310-311)
【作者】杨昌国;许叶
【作者单位】宁波市医学科学研究所;宁波市医学科学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R461.1
【相关文献】
1.同型半胱氨酸循环酶法自动分析仪测定及临床应用 [J], 李美珠;李启欣;梁指荣;陈社安
2.循环酶法检测血清同型半胱氨酸方法学评价及其在肿瘤诊断中的应用 [J], 赵锐;戴雯;徐万州;梅四清;崔艳;姜树朋;李艳
3.应用循环酶法对血液同型半胱氨酸的测定及临床应用分析 [J], 戴婉如;陈韡;蓝兰;王钦利
4.胶体金法与酶联免疫法在HIV筛查中的应用价值分析 [J], 张永红
5.饲料分析中酶活力的测定和酶法分析的应用 [J], 陈茂彬
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单选题1、下列不属于酶分析法要求的条件是1/79A.待测物质应是酶的底物B.待测物质是酶的抑制剂C.待测物质是活化剂D.待测物质是酶底物复合物正确答案：D试题解析：底物复合物是酶与底物相结合产生的中间产物。

所以答案为D。

2、酶终点法测量样品中待测物质的含量不可以通过间接测量哪类物质的含量来获得2/79A.产物的含量B.底物复合物的含量C.底物残余量D.物的产量正确答案：B试题解析：终点法的原理：利用酶的生物催化反应，使待测物质发生转化，然后测定产物产量或底物产量或底物残余量，通过定量分析，从而明确待测物质的含量。

所以答案为B。

3、下列不属于终点法进行药物分析的注意事项是3/79A.反应产物的促进性B.酶促反应的平衡性C.反应液中加入的酶量和酶促反应时间D.酶对底物的特异性正确答案：A试题解析：采用终点法进行生物药物分析的注意事项:(1)酶对底物的特异性；(2)酶促反应的平衡性；(3)反应液中加入的酶量和酶促反应时间；(4)反应产物的抑制。

所以答案为A。

4、下列属于酶免疫测定法中常用的标记物是4/79A.胰蛋白酶B.甲状腺素C.辣根过氧化物酶D.H2O2-邻联甲苯胺正确答案：C试题解析：在酶免疫测定法中最常用的标记物：辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)。

所以答案为C。

5、单酶反应测定法无须测量下列哪种物质的含量5/79A.底物B.产物C.辅酶D.中间产物正确答案：D试题解析：单酶反应定量法需测量底物减少量、产物增加量和辅酶变化量。

所以答案为D。

6、还原性辅酶I和还原性辅酶II的特征性吸收峰为6/79A.360nmC.340nmD.260nm正确答案：C试题解析：还原型辅酶I（NADH）和还原型辅酶II（NADPH）在340nm处有特征性吸收峰。

所以答案为C。

7、下列不可用作酶指示剂的是7/79A.NADB.NADPC.氧化型色素DD.氧化型色素H正确答案：D试题解析：除NAD或NADP为辅酶的脱氢酶类被广泛用作指示剂以外，还有些酶可用作指示剂。

组合检验：科学合理的检验项目组合可以向临床医师提供比较全面的检验信息，缩短检验申请时间，提高实验室的工作效率和临床的诊疗效率。

分为“固定组合”和“随机组合”两种形式。

实验室应在充分征求临床意见的基础上，合理设计“固定组合”，提高临床实验室诊断的价值。

【作用】1、提高疾病诊断敏感度：如将γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)、甲胎蛋白(AFP)组合在一起检测，可提高原发性肝癌的诊断敏感度。

许多实验室将几个不同的“项目组合”成一个大的“体检系列”来筛查某些疾病，用于健康监督。

2、了解某器官不同功能状态：如将蛋白质、胆红素、丙氨酸氨基转移酶( ALT)和门冬氨酸氨基转移酶( AST)等项目组合成“肝功能”系列，可以了解肝脏的蛋白质合成功能、胆红素的排泄和转化功能、以及肝细胞损伤程度。

3、快速了解患者多方信息：如生化分析仪的急诊分析模块将总蛋白、清蛋白、葡萄糖、尿素、肌酐、钾、钠、氯、钙、镁、磷、总CO2等组合在一起形成了“急诊系列”组合。

4、适应现代临床医学需要：如血气分析仪一次可以分析三个参数，即氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）和pH，再由此计算出其它气体及酸碱平衡诊断指标。

急诊检验：实验室为了配合临床危急、重症患者的诊断和抢救而实施的一种特需检验。

检验者在接到“急诊检验”标本后必须快速、准确地发出报告，一般要求从接受标本开始至检验结果发出最长不得超过2h。

“急诊检验”的结果无论正常还是异常都必须快速用报告单的形式报告。

【PS】国家规定的生化检验急诊项目有：血清钾/钠/氯/钙离子、肌酐、尿素氮、血气分析、血清淀粉酶、血糖、肌酸激酶、肌酸激酶同功酶、肌钙蛋白I、乳酸脱氢酶、肝肾功能、心肌酶谱等。

危急值：某些检测结果出现了可能危及患者生命的数值。

也被称为紧急（panic）或者警告（alert）值。

当这种试验结果出现时，说明患者可能正处于有生命危险的边缘状态，此时如能给予及时、有效的治疗，患者生命可以得到挽救；否则，将可能危及患者安全及生命。

总胆汁酸(TBA)测定试剂盒（酶循环法）说明书【产品名称】总胆汁酸(TBA)测定试剂盒（酶循环法）【包装规格】a)试剂1：2×45mL 试剂2：2×15mL b)试剂1：4×60mL 试剂2：4×20mL c)试剂1：2×60mL试剂2：2×20mL【预期用途】用于体外定量测定人体血清中总胆汁酸的含量。

血清中TBA 水平升高见于急性病毒性肝炎、肝硬化、胆汁淤积性胆管炎、慢性活动性肝炎、酒精性肝炎、阻塞性黄疸、肝囊性纤维变性[1]。

【检验原理】胆汁酸被3α-HSD 及THIO-NAD 特异性的氧化，生成3-酮类固及还原型硫代辅酶Ⅰ（THIO －NADH ）。

此外，生成的3－酮类固醇在3α羟基类固醇脱氢酶及还原型硫代辅酶Ⅰ（THIO －NADH ）存在下，生成胆汁酸及氧化型硫代辅酶Ⅰ（THIO －NAD ）。

如上述，据循环酶而放大微量的胆汁酸量，测定在单位时间内生成的还原型硫代辅酶Ⅰ在405nm 处的吸光度变化，可求得样本中总胆汁酸的含量。

【主要组成成分】试剂1主要组分磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液100mmol/L 氧化型硫代辅酶Ⅰ(THIO-NAD)950mg/L还原型辅酶(NADH)6g/L 聚氧乙烯油醇醚适量试剂2主要组分Tris 缓冲液100mmol/L 3α－羟基类固醇脱氢酶(3α－HSDH)12.5KU/L聚氧乙烯油醇醚适量注：不同批号试剂盒中各组分未经试验不可互换。

【储存条件及有效期】贮存于2～8℃，有效期为18个月，生产日期、有效期见标签。

【适用仪器】艾威德AS-420/AS-660/AS-1200；日立HITACHI 7020型/7060型/7180型/7600型/LABOSPECT 008AS 型；贝克曼AU400/AU480/AU640/AU680/AU2700/AU5400/AU5800/AU5811/AU5821；佳能TBA-FX8/TBA-120FR /TBA-2000FR ；罗氏cobas 8000c 702/cobas 8000c 701/cobas 8000c 502；西门子SIEMENS ADVIA 1800/ADVIA 2400；雅培ABBOTT ARCHITECT c8000/ARCHITECT c16000/ARCHITECT ci8200；西森美康SYSMEX BM6010/C ；科华KHB 卓越310/卓越330/卓越400/卓越450/ZY-1200/ZY-1280；迪瑞CS-240/CS-T300/CS-300B/CS-380/CS-400A/CS-400B/CS-600A/CS-600B/CS-800A/CS-800B/CS-1200/CS-1200ISE/CS-1300B/CS-1400；迈瑞MINDRAY BS-220/BS-330/BS-350E/BS-380/BS-390/BS-400/BS-430/BS-600/BS-800/BS-2000M ；颐兰贝ES-200/ES-380/ES-480；赛诺迈德SUNMATIK-9050型；雷杜Chemray 420；英诺华D280；特康TC6010L ；锦瑞GS400；普康6066。

例2
胰蛋白酶效价测定 本品系自牛、羊、猪的膜中提取的蛋白水解酶。按干燥 品计算，每1mg的效价不得少于2500单位。
胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸 的羧基组成的肽键，酰胺键及酯键。其水解速率为酯键＞酰 胺键＞肽键。也可水解间位经基苯甲酸酶及脂肪酸酶，以及 变性蛋白如酶蛋白、血红蛋白。 可选用酪蛋白或含有碱性氨基酸的酰胺、酶等作为底物。 目前均采用专属性较高的 N-苯甲酰酰－L精氨酸乙酯（BAEE）作为本品的底物。
利于反应。
米氏常数Ｋm对于酶是特征性的。每一种酶对于它的一种底物只有一个 米氏常数。
米氏常数的求法 双 倒 数 方 程 和 双 倒 数 曲 线
1.0
0.8
0.6
1/v
0.4
0.2
0.0 -4 -2 0 2 4
-1
6
8
10
1/[S](1/mmol.L )
双倒数作图法
4.1.4 酶法分析注意点
酶分析法是一种以酶为分析工具（或试剂）的分析方法。分析 的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶的抑制剂。 酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的 酶量必须一定．被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最 适。

4.1.5 酶法分析的发展的历史
过氧化氢：过氧化物酶。140年以前，麦芽提取物为酶 源，以愈创木酚为共底物或指示剂测定。
蔗糖：转化酶。100余年以前，酶母提取液为酶源。
尿素：尿酶。1914年。 临床实验：转氨酶。1958年，诊断肝病和心脏病。 20世纪50年代以前，近60种物质能借助于酶法分析。 进展：取决于能否以合理的价格提供纯酶、底物和辅助 因子。
E + P
根据中间产物学说，在稳态时，ES的生成速度 与其分解速度相等。有以下关系式：

平衡法测定代谢物的基本原理
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第二十五章 临床酶法分析的原理和方法
（三）平衡法的影响因素
1.酶量应足够才能在t时间内达到平衡。 2.St越小测定误差越小。 3.测定管与标准管基质效应越小，误差越小。 4.标准管与测定管酶量、平衡时间t一致时误差越小。 5.酶量不足，平衡时间延长，线性范围缩窄。
酶法分析
酶循环 测定法
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测定酶激活剂 、酶抑制剂
过氧化物酶 指示系统酶 偶联法
第二十五章 临床酶法分析的原理和方法
一、平衡法测定的理论基础
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第二十五章 临床酶法分析的原理和方法
（一）平衡法的概念
平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应 逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（<1%～5%） 时，指示反应信号逐渐达到稳定（平衡），即通常 所说的终点，但没有终止反应，所以又称为终点法 (end-point method) 。
➢最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶 指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统。
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第二十五章 临床酶法分析的原理和方法
血清葡萄糖-己糖激酶法测定
血清葡萄糖己糖激酶法（HK法）测定，在测定 中，HK是辅助酶，G-6-PD为指示酶，指示酶反 应将NAD+转化为NADH，340 nm吸光度增加量 即与葡萄糖的含量成正比。反应式如下：
+
V max V max
结论：说明达到平衡所需的时间t与Km、Vmax和 [S0]有关，Km越小、Vmax（加入酶量）越大、 [S0]越小（方法的线性范围上限）则达到平衡所需 的时间越短。若[S0]<Vmax ，t则取决于前项。
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第二十五章 临床酶法分析的原理和方法

生物化学考试题含答案一、单选题（共112题，每题1分，共112分）1.我国临床生物化学检验学科的奠基者是()A、陶义训B、刘士豪C、张铁生D、吴宪正确答案：D2.下列有关酶循环法的叙述不正确的是（）A、测定中所选择酶的Km 值要小B、该法使反应产物增加，提高了检测灵敏度C、是利用底物和辅酶的循环反应，使酶促反应产物不断扩增以利于测定的方法D、灵敏度与循环反应速度无关正确答案：D3.不能反映肝内或肝外胆汁淤积的试验是（2016年初级师）A、血清γ-GTB、血清AST及其同工酶C、血清总胆红素测定D、血清直接胆红素测定E、血清间接胆红素测定正确答案：B4.关于糖化Hb描述，错误的是（）A、糖化Hb的浓度与红细胞寿命有关B、不受每天葡萄糖波动的影响C、在反映血糖控制效果上比糖化血清蛋白敏感D、反映的是过去6～8周的平均血糖浓度正确答案：C5.血浆白蛋白下降见于很多病理情况，但除外（）A、急性肝炎早期B、吸收功能紊乱C、肾病综合征D、手术后正确答案：A6.胆红素进入肝细胞后即被细胞内的受体结合，以利于结合胆红素的形成，该受体是（）A、G蛋白和Z蛋白B、Y蛋白与Z蛋白C、白蛋白和α1球蛋白D、葡萄糖醛酸和葡萄糖正确答案：B7.临床常规测定血清总蛋白宜选用的方法是（）A、邻苯三酚红钼法B、双缩脲法C、酚试剂法D、凯氏定氮法正确答案：B8.急性肝炎引起的血中胆红素增加属于（2018中级师）A、肝细胞性黄疸B、核黄疸C、溶血性黄疸D、梗阻性黄疸E、体质性黄疸正确答案：A9.血中胆红素主要运输形式是（）A、胆素B、胆红素-Y蛋白C、胆绿素D、胆红素-白蛋白E、胆红素葡萄糖醛酸酯正确答案：D10.患者男，16岁。

哮喘发作入院，血气分析：pH7.49，PCO2 28.6mmHg，PO2为71mmlg，AB为20mmol／L，最可能的酸碱失衡类型是（2015／2017／2020年初级师）A、呼吸性酸中毒B、呼吸性碱中毒C、代谢性酸中毒D、代谢性碱中毒E、代谢性酸中毒伴代谢性碱中毒正确答案：B11.ApoB100的生理功能叙述正确的是（）A、是VLDL的结构蛋白B、是LDL受体的配体C、可作为HDL受体的配体D、参与合成装配和分泌富含胆固醇的VLDLE、不能调节LDL从血浆中的清除速率正确答案：B12.下面有关电泳技术的叙述哪项是错误的()A、表面电荷密度高的粒子比表面电荷密度低的粒子移动速度快B、电场强度降低,增加了标本的扩散,电泳区带分辨率增高C、电泳中缓冲液要求化学性能稳定,缓冲容量大,离子移动性好D、电场强度增大,电泳速度加快,产热也增多,蛋白质易变性正确答案：B13.不属于纤维化诊断指标的是（）A、透明质酸B、GGTC、Ш型前胶原D、Ⅳ型胶原E、层黏蛋白正确答案：B14.在血清蛋白电泳中，结合珠蛋白在（）A、β球蛋白区带B、γ-球蛋白区带C、α1球蛋白区带D、α2球蛋白区带正确答案：D15.肾脏远曲小管及集合管对水的重吸收受何种激素支配（2017年初级上）A、抗利尿激素B、ACTHC、类固醇激素D、前列腺素E、肾素正确答案：A16.内源性胆固醇的运输主要有(2020初级师)（）A、HDLB、LDLC、VLDLD、CME、VLDL+LDL正确答案：B17.决定原尿形成过程的因素是（）A、肾小球滤过膜通透性、肾血流量、肾小管功能B、肾小管重吸收功能、有效滤过压、肾血流量C、有效滤过压、肾血流量D、肾小球滤过膜通透性、有效滤过压、肾血流量E、肾小球滤过膜通透性、肾小管功能正确答案：D18.在肝脏中与葡萄糖双醛酸相结合后的胆红素为（2018年初级士）A、结合后较难解离B、溶血性黄疸时血中会大量出现C、间接胆红素D、也叫做结合胆红素E、可从尿中排出正确答案：D19.血清胆汁酸测定时脱氢酶-辅酶循环反应中用到的两种辅酶是（）A、硫代还原型辅酶Ⅰ和氧化型辅酶ⅠB、氧化型辅酶Ⅱ和硫代还原型辅酶ⅠC、硫代还原型辅酶Ⅰ和还原型辅酶ⅠD、硫代氧化型辅酶Ⅰ和还原型辅酶Ⅰ正确答案：D20.血清尿酸测定目的主要是（）A、用于肾病诊断B、有助于分析高尿酸血症病因C、发现高尿酸血症D、有助于分析高尿酸血症分型正确答案：C21.正常糖耐量是指（）A、FPG正常； 2hPG<8 mmol/LB、FPG<7.0 mmol/L；2h PG≥7.8 mmol/LC、FPG≥8 mmol/L； 2hPG＜9 mmol/LD、FPG正常；2hPG≤7.8 mmol/L正确答案：D22.同工酶分析最常用的方法是（）A、电泳法B、热稳定性和抑制法C、免疫化学法D、离子交换层析法正确答案：A23.下列哪项可作为结合酶最常见的辅助因子，且被称为酶的辅基（）A、钾、钠、镁等金属离子B、B族维生素C、小分子有机化学物D、核酸正确答案：A24.血清蛋白质电泳时出现M带的疾病是（）A、病毒性肝炎B、急性心肌梗死C、骨髓异常增生综合征D、多发性骨髓瘤正确答案：D25.肝细胞对胆红素的转化主要发生在（）A、微粒体B、溶酶体C、滑面内质网D、线粒体正确答案：C26.实际碳酸氢盐（AB）=标准碳酸氢盐（SB）且两者均大于正常值提示(2020初级师)A、代谢性酸中毒B、呼吸性酸中毒C、代谢性碱中毒D、呼吸性碱中毒E、无酸碱平衡紊乱正确答案：C27.关于血气分析错误的有(2020初级师)A、可从任何部位采集动、静脉血B、标本要用全血C、动、静脉血氧分压有明显差异D、只能使用动脉血E、玻璃和塑料注射器都可用于血气分析时的标本采集正确答案：D28.干化学分析使用的仪器是()A、分光光度计B、比色计C、反射式分光光度计D、浊度计正确答案：C29.发射光谱分析法是下列哪类测定法的原理()A、免疫比浊法B、离子选择电极法C、火焰光度法D、化学比色法正确答案：C30.不属于α1区带的血浆蛋白质是（）A、AAGB、AFPC、CpD、HDL正确答案：C31.药物在体内经过肝脏等器官进行生物转化，生物转化后的效果是（2017年中级师）A、所有药物活性均升高B、所有药物活性均灭活C、药物的极性升高，有利于转运D、药物的极性升高，有利于排泄E、药物的极性升高，有利于吸收正确答案：D32.下列有关酶活性测定定时法与连续监测法的区别错误的是()A、定时法计算的是平均速度,连续监测法是测最大酶促反应速度B、定时法不能确保选定的测定时段全部处于线性期,而连续监测法可明确找到反应的线性期C、定时法需要终止酶促反应,而连续监测法酶促反应一直进行D、定时法需要恒温设备,而连续监测法对仪器无一定要求正确答案：D33.血清总蛋白增高见于（2013年初级师）（）A、肝硬化B、多发性骨髓瘤C、消化吸收不良D、食物中缺乏蛋白E、严重烧伤正确答案：B34.LDL中存在的主要载脂蛋白是（）A、ApoB48B、ApoB100C、ApoCⅡD、ApoEE、Apo(a)正确答案：B35.普通饮食时尿酸排泄量多少时为尿酸生成过多（）A、＞4.8mmol/24hB、＞4.2mmol/24hC、＞3.5mmol/24hD、＞3.6mmol/24h正确答案：A36.下列各项脂蛋白中，脂质含量最多的脂蛋白是（）A、CMB、LDLC、VLDLD、HDLE、Lp(a)正确答案：A37.维持血浆胶体渗透压主要的蛋白质是（）A、免疫球蛋白B、白蛋白C、纤维蛋白原D、α1-酸性糖蛋白正确答案：B38.给患者注射胰岛素、葡萄糖后，不适宜作血清测定，因为此时体内钾代谢的变化(2020初级师)A、血钾增高B、胞内钾溢出到细胞外C、无改变D、尿钾增高E、细胞外钾进入细胞内正确答案：E39.某患者血气分析结果为：pH7.12，PaCO2 25mmHg，HCO318mmol／L。

生物药物分析练习题一、名词解释：生物药物分析：应用微生物学、分子生物学、免疫学、生物化学、有机化学、数学、分析化学、生化工程等学科的理论及其技术成就，检测和研究各种生物药物质量的一门综合性学科。

生物药物：指的是生物体生命活动过程中产生的，或者通过生物技术加工的，用作疾病的诊断、预防、治疗的初级和次级代谢产物，包括微生物药物、基因工程药物、动植物细胞组织制备的生化药物。

药品标准：是指国家对药品的质量规格及其检验方法所做的技术规定，是药品的生产、流通、使用及检验、监督管理部门共同遵守的法定依据。

药典：一个国家记载药品标准，规格的法典，一般由国家药品监督管理局主持编撰颁布实施，具有法定约束力。

基因工程药物：是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，经过一系列基因操作，最后将该基因放入可以大量产生的受体细胞中去，在受体细胞不断繁殖的过程中，大规模生产预防和治疗这些疾病的蛋白质。

药物杂质：药物中存在的无治疗作用或影响药物的稳定性和疗效，甚至对人体健康有害的物质。

面积归一法：计算各杂质峰面积及其总和，并求出占总峰面积的百分率以测定杂质含量。

内消法：是指将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积及相对校正因子，按相应公式和方法即可求得被测组分在样品中的百分含量。

外消法：用已知不同含量的标样系列等量进行分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线。

定量分析样品时，在测校正曲线相同条件下进同等样量的等测样品，从色谱图上测出峰高或峰面积，在从校正曲线查出样品的含量。

微生物限度检查法：系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。

放射性免疫测定法：利用免疫学上的抗原-抗体高度特异性反应与放射性同位素测量技术的高度灵敏性相结合的超微量分析方法。

酶免疫测定法：利用抗原和抗体的免疫学反应和酶的高效催化作用来测定抗原或抗体含量的技术。

2.2.2 pH值

H+能对酶反应产生多种影响：①可能改变酶活 性中心的解离状况，升高或降低酶的活性；② 可能破坏酶的结构与构象导致失效；③可能作 用反应系统的其它组成成分影响酶反应，甚至 改变可逆反应进行的方向。如：乳酸脱氢酶反 应在pH 7时向乳酸生成方向进行，而pH l0时则 倾向于丙酮酸的形成。
2.3 测定方法 测定方法有取样法和连续法。 取样法：在酶反应开始再根据产物和底物在化学性质 上的差别进行分析，求得单位时间内酶促反应 变化量的方法。 连续法：基于底物和产物在物理化学性质上的 不同，在反应过程中对反应系统进行直接、连 续观察的方法。
如加样量、温度、反应时间等都要求比较准确。最适反应条件(如 温度、pH等)的确定很重要，一个熟练的酶学工作者，会考虑各种 因素，设计的实验比较合理，而且重现性好；未经过专门训练的人， 往往容易出错。
1.3 酶分析法的意义

酶的应用大致可分为四个方面：
(1)用以制造某些产品； (2)用以去除某些物质；
2.2 反应条件的确定 选择反应条件的基本要求是，所有待测定的酶 分子都应能正常地发挥作用。 也就是说，反应系统中除了待测定的酶浓度是 影响反应速度的唯一因素外，其它因素都应处 于最适条件。
2.2.1 底物
①底物(包括人工合成底物)最好在物理化学性质上 和产物不同。 有些酶作用的底物和产物本身就有这种特点， 如脱氢酶用的NAD(P)+和NAD(P)H； 有的则需加工成色源或荧光源底物，在酶作用 后产物产生颜色或荧光。如磷酸酯酶测定可用 对硝基苯磷酸。
2.2.5 样品


许多待测样品常常包含各种干扰因素，如可能 存在着作用同一底物或产物的其它酶。因此测 定前应检测系统中是否杂有这些干扰因素。 同时采用不同的测定方法和同时检测底物和产 物的变化量，然后观察测得的结果是否一致。 通过这些比较分析，确定是否存在干扰。