ELISA-从技术细节到数据分析演示
ELISA：全称叫酶联免疫吸附试验，其原理就是：测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应，用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与溶液中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应结合在固相载体上，加入酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的量与标本中要检测的目标物质的量直接相关，故可根据颜色的深浅进行定性或定量分析。
试剂、仪器：包括3个必要试剂和其他的试剂、仪器
3个必要试剂：
（1）固相的抗原或抗体
常用的固相载体是聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质的性能，并且抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。将抗原或抗体固定在聚苯乙烯的过程即‘包被’，2者通过物理吸附相结合。
（2）酶标记的抗原或抗体
制备结合物时所用纯度较高的lgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。
（3）酶反应的底物
其他的试剂、仪器： 操作步骤：用于检测未知抗原的双抗体夹心法（eg：ELISA双抗体夹心法测定培养上清中IFN-γ水平）
1）包被：取空白 96 孔板，按 COA 用 PBS 稀释捕获抗体，每孔
100μl捕获抗体工作液，室温过夜；
2）洗板：每孔 350μl洗液，洗板 3 次；
3）封闭：加入封闭液 200 μL/孔封闭 ELISA 板，室温孵育 1h；
4）洗板：甩去板中的封闭液体，加入洗液 350μL/孔，洗板 3 次；
6）加样：取出包被封闭好的 96 孔板，分别加入 100μl标准品或稀释好的样品，标准品做复孔，室温孵育 2h；
7）洗板：每孔 350μl洗液，洗板 3 次；
8）加酶标抗体：按 COA 用稀释液稀释检测抗体，每孔 100μl检测抗体工作液，室温孵育 2h；
9）洗板：每孔 350μl洗液，洗板 3 次；
10）加入底物：每孔 100μl显色液，室温避光孵育 20min，连续观察颜色变化；
11）加终止液：每孔 50μl终止液，轻柔混匀； 12）读板：检测根据酶标仪器操作方法，上机检测 OD值，通过计算获得所测物质的浓度。
猪瘟抗体阻断ELISA检测试剂盒技术参数
产品名称 猪瘟抗体阻断ELISA检测试剂盒 单价 2500.00元（人民币）
规格 5板/盒 储存条件及有效期 2~8℃保存；有效期为12个月
产品成分 1、包被板 5×96孔
2、酶标结合物（1号液） 55mL
3、洗涤液10×（2号液） 250mL
4、底物液（3号液） 30mL
5、显色液（4号液） 30mL
6、样品稀释液（5号液） 50mL
7、终止液（6号液） 30mL
8、阳性对照品 2mL
9、阴性对照品 3mL
10、封板膜 15片
11、说明书 1份
检测样品类型 猪血清或血浆
试剂类型 即取即用型
检测靶物 可检测出猪瘟病毒抗体，与BVDV/BDV无交叉反应
软件支持 免费提供软件供分析数据
结果判断 阻断率PI≥40%，判为猪瘟抗体阳性；PI＜40%，判为猪瘟抗体阴性
性能指标 感染后11天可检测到血清阳性、敏感性99%，与中和抗体试验相当；特异性100%，与BVDV/BDV无交叉反应
猪蓝耳病抗体检测试剂盒技术参数
产品名称 猪蓝耳病抗体检测试剂盒 单价 13000.00元（人民币）
规格 5板/盒 储存条件及有效期 2~8℃保存；有效期为12个月
产品成分 1、包被板 5×96孔
2、酶标结合物（1号液） 55mL
3、洗涤液10×（2号液） 250mL
4、底物液（3号液） 30mL
5、显色液（4号液） 30mL
6、样品稀释液（5号液） 50mL
7、终止液（6号液） 30mL
8、阳性对照品 2mL
9、阴性对照品 3mL
10、封板膜 15片
11、说明书 1份
检测样品类型 口腔黏液
试剂类型 即取即用型
检测靶物 能够最早监测免疫或感染，可检测出美洲株、欧洲株、第三种病毒LENA以及高致病性蓝耳病毒株
软件支持 免费提供软件供分析数据
结果判断 S/P≥0.4，判为猪蓝耳病抗体阳性；S/P＜0.4，判为猪蓝耳病抗体阴性。
畜产品安全2019年3月下
摘 要：随着当代人民物质生活水平的提高，人们食品安全意识越来越强，食品安全检测也成为了人们关注的重点。为了提高食品检测的准确性、科学性与安全性，本文简要介绍了ELISA技术，同时探究了ELISA技术在食品安全检测中的应用。关键词：ELISA技术；食品安全检测；技术应用
食品安全问题是关乎国计民生的大事，不但会影响国民的身体健康与生命安全，对国家整体经济发展亦有所制约，ELISA技术属于免疫分析检测法，具有可靠性高、灵敏度高、操作简便等优势，目前广泛应用于农药残留、食品添加剂、畜产品微生物与生物毒素等项目的检测中，该技术的应用对于保障食品安全具有重要意义。1 ELISA技术概述ELISA技术，即enzyme linked immunosorbent assay，汉译为酶联免疫吸附技术。ELISA是20世纪60年代在组织化学与免疫荧光相结合的基础上被开发出来的新技术，ELISA技术是现阶段发展最快、使用范围最广的酶免疫技术。ELISA技术应用原理是把可溶性抗原或者抗体吸附到固相表面，同时保证抗原或者抗体的免疫活性，只有这样才能在化学反应后，仅通过固相洗涤，就能实现分离抗原或者抗体的目标，操作十分简便。2 ELISA技术在食品安全检测中的应用分析2.1 应用于检测食品添加剂与违禁用剂使用ELISA技术检测包装食品添加剂是否违规的相关研究日益增加。具体而言，应用ELISA技术检测食品用剂包括下述几方面，一是检测食品中是否添加了苏丹红1号，直接将苏丹红1号作用于抗原，链接桥选择Sudan-C3-OVA中的OVA，然后将OVA与HRP相连，形成Sudan-C3-OVA-HRP，然后将单抗作为基础运用ELISA技术能够直接检测出苏丹红1号是否存在；二是采用黄原胶抗体，结合ELISA技术检测黄原胶。研究者通过对比检测多组烧烤酱与沙拉酱发现，黄原胶每组检测差异小于10%。另外，在应用ELISA技术方面还研究了检测食品中罂粟碱的可能性，发现引进样品稀释法进行检测具有良好的效果。由此可见，ELISA技术在检测食品用剂方面具有广阔的应用前景。2.2 应用于检测畜产品微生物与生物毒素（1）检测畜产品微生物在保障食品安全方面，人们逐渐认识到了微生物的重要性，并逐步加强了对微生物的检测，畜产品极易被微生物污染。在检测实践中，应用EILSA技术检测畜产品微生物含量，通常能够检测出致病菌与一般污染，例如，某检测中心在监管鱼虾贝类养殖产业的过程中发现市场中大量鱼虾贝类产品都具有存在沙门氏菌污染的情况。对于这一现象，该检测中心使用了ELISA技术，希望能够防范鱼虾贝类产品与杆菌交叉反应。检测人员在实际工作中往往会受到多种因素影响，例如，复杂的检测环境，比方说检测大肠杆菌，在一般条件下难以培养出大肠杆菌，若改变条件进行培养有可能使其复苏，这会损害人体健康，因此，在检测该类微生物时要求较高且难度较大，一般技术难以满足检测需求，此时为了达到安全、高效、准确的检测目的，检测人员也可以采用ELISA技术，在短时间内通过固相载体吸附抗原实现对产品的检测，此法更科学安全有效。（2）检测畜产品生物毒素畜产品中含有生物毒素的根源在于食物链的作用，生物毒素对人体生命健康的威胁较大。使用ELISA技术能够发现致病生物毒素，例如，真菌毒素、藻类堵塞等。ELISA技术在检测生物毒素方面应用研究较为完善，技术应用效果良好，在检测工作中需要根据检测毒素的种类选取有针对的ELISA试剂盒。例如，检测黄曲霉素，黄曲霉素是畜产品中最为普遍的生物毒素，对人体危害较大，选择ELISA技术检测该毒素，早在1998年的检测实验中就得出仅需要2h左右就可以准确判断出产品内是否含有该毒素。该检测结论为后续ELISA技术在检测生物毒素方面的应用奠定了良好的基础。3 应用于检测转基因食品在检测转基因食品方面，目前美国FDA已经开发出使用双夹心ELISA技术检测转基因玉米产品。以检测转基因玉米为例，ELISA试剂盒具有检测Cry9C蛋白的功能，应用ELISA技术将CP4-EPSPS与抗体相结合，可得出检测结果。在检测大豆转基因方面，13个欧盟成员国与瑞典总计37个实验室表明，检测大豆转基因的准确度高达99%。ELISA分析检测技术较传统分析检测技术灵敏度更高、特异性更强，且对设备要求不高、检测成本低、自动化程度高。但是ELISA技术从学科角度看，其综合性较强，需要多种学科支持，在部分领域还存在问题。第一，由于待检测物质含量低、存在交叉反应，许多物质需要和OVA、BSA等物质结合后才拥有免疫原性，且并非所有物质都能够制出抗体，ELISA技术受到检测物质本身的制约；第二，ELISA技术自身不足，制备特殊抗体难度大，例如，制备单克隆抗体需要大量时间，且在反应条件、反应时间、酶标板等方面要求较高。另外，应用ELISA技术检测成分有限，对试剂要求高，检测人员必须认识到pH值、溶剂等因素对ELISA技术的影响。4 总结ELISA技术准确性、安全性均较高，只需要使用少量有机试剂就能够获得高品质的检测结果。ELISA技术在食品安全检测中的有效运用能够准确、高效地检测出食品中含有的危害物质，进而提示相关人员采取有效方式进行处理，保证在食品流入市场前，解决危害人体安全的所有因素。参考文献[1] 张佩，吴飞燕，史威威，等.ELISA技术在畜产品安全检测中的应用[J].当代畜牧，2017，（32）：9-10.试论ELISA技术在食品安全检测中的应用
二兰 坠垒 呈箜墨 童！ 垫 堕墨窒旦二二旦 ：奎兰 ！旦 塑：篁 中图分类号：￥５３２；￥４３２．４ １ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７２—３６３５（２００６）０６—０３３９—０４ ＮＣＭ—ＥＬ ｌ ＳＡ检测马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ） 技术的研究及应用 吕典秋 一，李学湛 ，吕文河 ，于德才 ，李 辉ｓ （Ｉ．黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，黑龙江哈尔滨Ｉ ５００８６； ２．东北农业大学，黑龙江哈尔滨１ ５００３０；３．黑龙江省 农业科学院谷物品质研究中心，黑龙江哈尔滨１５００８６） 摘要：血清学方法是病毒检测的主要手段。本试验通过对马铃薯Ｙ病毒（ＰｖＹ）的提纯。免疫家兔制备ＰｖＹ 抗血清，并提取ＰＹＶ免疫球蛋白ＩｇＧ作为ＮＣＭ—ＥＬＩＳＡ反应为一抗，以市售羊抗兔抗血清为二抗，在硝酸纤维素 膜（ＮＣＭ）上进行ＮＣＭ—ＥＬＩＳＡ反应检测ＰＶＹ，建立ＰＶＹ ＮＣＭ—ＥＬＩＳＡ检测反应体系。试验结果显示，ＮＣＭ—ＥＬＩＳＡ 一具有反应特异性强，灵敏度高的优点，检测植物叶片样品的最高稀释度可达到ｌ：２５０。通过对田间４０份样品的 ＮＣＭ－ＥＬＩＳＡ和ＤＡＳ—ＥＬＩＳＡ检测比较，其检测结果吻合率达到１００％。由于ＮＣＭ—ＥＬＩＳＡ方法可以将样品点在硝酸 纤维素膜上，并且可贮存几个星期或将膜送到其他实验室进行检测，因此具有操作简单，使用方便，检测成本低 等优点。 关键词：硝酸纤维素膜一酶联免疫分析；马铃薯Ｙ病毒；检测 马铃薯Ｙ病毒主要由蚜虫以非持久性方式进 行传播…，其减产幅度可达５０％～８０％ｔ 。当和 ＰＶＸ、ＰＶＡ病毒复合侵染时，常能造成较大的减 产［３】。依病毒株系不同，其症状差异较大。根据其 在马铃薯、烟草和其它寄主上症状严重程度，可分 为三个株系ＰＶＹ。，ＰＶＹ 和ＰＶＹＮ【４】。利用ＣＦ ＲＴ— ＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＲＴ—ＰＣＲ ａｓｓａｙ）技术 可以快速、准确地进行不同株系的鉴定ｉｓ】。植物病 毒的诊断主要通过症状观察、指示植物接种鉴定、 血清鉴定、电镜观察等方法进行诊断【 圳。早在 １９８３年Ｖｅｔｔｅｎ等 就利用ＥＬＩＳＡ技术成功地检测 到自然状态下和打破休眠薯块中的ＰＶＹ和ＰＶＡ病 毒。目前，在生产上检测马铃薯病毒的方法主要有 Ｉｎｄｉｒｅｃｔ—ＥＬＩＳＡ、ＤＡＳ—ＥＬＩＳＡ和ＮＣＭ—ＥＬＩＳＡ等。 其中，ＮＣＭ—ＥＬＩＳＡ是一种利用硝酸纤维素膜取代 微量滴定板的间接酶联免疫分析方法。 收稿日期：２００６—０３－０８ 作者简介：吕典秋（１９７３一），男，助理研究员，现为东北农业 大学在读博士研究生，主要从事植物病毒分子生物学研究。 通讯作者：ｗｈｌｕ＠ｍａｉｌ＿ｎｅａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ １ 材料与方法 １．１植物材料 ２００５年７月，采自哈尔滨市南岗区马铃薯生 产基地的马铃薯植株叶片样品，品种为早大白。 １．２抗原及抗血清 将密度梯度离心纯化的ＰＶＹ病毒，进行免疫 家兔制备抗血清。阳性对照和ＤＡＳ—ＥＬＩＳＡ试剂盒 来自国际马铃薯中心（ＣＩＰ）。 １．３试剂 ＮＢＴ、ＢＣＩＰ、羊抗兔酶标抗体、硝酸纤维素膜 均购自Ｓｉｇａｍａ公司，其它试剂为国产分析纯试剂。 １．４免疫球蛋白ＩｇＧ的制备和纯化 利用硫酸铵沉淀方法进行［９］。向３０ ｍＬ离心管 中加人１ ｍＬ粗抗血清，再加人９ ｍＬ蒸馏水，小心 搅拌，加人１０ ｍＬ饱和硫酸铵，室温放置４５ ｍｉｎ。 ４℃，１０ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心１５ ｍｉｎ，弃去上清，将沉 淀重新悬浮于１ ｍＬ透析缓冲液（５ ｍＭ ＰＢＳ，ｐＨ＝ ７＿４）中。４℃透析，更换３次透析液，每次５００ ｍＬ。
