流感病毒的分离技术操作规范
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病毒的特性页数:19
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血管形成测定页数:8
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流感病毒的分离技术操作规范页数:8
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犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析
犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析犬流感病毒（Canine Influenza Virus，CIV）是一种由流感病毒引起的狗类感染疾病，主要包括CIV-H3N8和CIV-H3N2两种亚型。
近年来，犬流感病毒感染在全球范围内呈逐渐增加的趋势，给犬只健康和养殖业生产带来了严重的危害。
对犬流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析具有重要意义。
一、病毒分离鉴定病毒分离鉴定是对犬流感病毒进行病原学研究的基础，主要包括病毒的分离、鉴定和鉴定结果的确认三个步骤。
病毒的分离是首要任务，通常采用病毒感染犬只的呼吸道分泌物、血清或组织样本进行病毒的分离培养；病毒鉴定则主要通过电镜观察病毒颗粒的形态、免疫荧光技术检测病毒抗原等方法进行；鉴定结果的确认则可以通过PCR、RT-PCR和序列分析等分子生物学手段进行。
在实际操作中，病毒的分离鉴定需要在生物安全实验室中进行，避免病毒的传播和扩散。
二、基因序列分析基因序列分析是对犬流感病毒基因组进行序列测定和分析的过程，主要包括基因组测序、序列比对和变异分析三个步骤。
通过PCR或RT-PCR技术对病毒样本进行基因组的扩增和测序，获取病毒基因序列信息；然后，通过序列比对将测定到的基因序列与已知的犬流感病毒参考序列进行比对，找出其相同点和变异位点；通过变异分析对病毒亚型、毒株的演化关系进行推断和分析。
通过基因序列分析，可以更加深入地了解犬流感病毒的遗传变异和演化规律，为疫苗研发和防控策略的制定提供重要参考。
针对犬流感病毒的部分基因序列分析，以下以CIV-H3N8亚型为例进行分析。
1. 基因组测序从临床样本中提取病毒RNA，利用RT-PCR技术对病毒基因组进行扩增和测序。
通过比对已知的CIV-H3N8基因组序列，确定扩增的基因片段在全基因组中的位置，并获取完整的基因序列信息。
2. 序列比对和变异分析将测定到的CIV-H3N8基因序列与已知的CIV-H3N8参考序列进行比对，找出其相同点和变异位点。
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
流感病毒的分离培养
• （二）材料 • 1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合
适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做 病毒分离 • 2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型） • 3、HEPES缓冲液，1M母液 • 4、D-MEM培养基，Hank's液 • 5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G； 10000µg/mL硫酸链霉素
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• (5)将针头弃于合适的生物安全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床
采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。
• 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：
0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：
25mM）
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （2）病毒生长液
• 每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶 的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细 胞分离步骤：
二、流感病毒分离之鸡胚培养法 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块
• 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
膜与鸡胚
• 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做 病毒分离 • 2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型） • 3、HEPES缓冲液，1M母液 • 4、D-MEM培养基，Hank's液 • 5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G； 10000µg/mL硫酸链霉素
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• (5)将针头弃于合适的生物安全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床
采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。
• 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：
0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：
25mM）
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （2）病毒生长液
• 每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶 的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细 胞分离步骤：
二、流感病毒分离之鸡胚培养法 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块
• 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
膜与鸡胚
• 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件
• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）
甲型流感病毒检测方法及技术方案H1N1
甲型（H1N1）流感病毒实验室检测技术方案(试行)广州健仑生物科技有限公司整理本方案旨在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。
一、标本的采集种类和要求1、推荐采集的呼吸道标本种类疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃（冰箱），并马上送至实验室。
（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。
）采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。
（附表1）2、拭子的选择标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）3、临床标本储存要求保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。
有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。
不应保存在-20℃。
4、标本的分装处理标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。
将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。
5、标本的运输疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。
填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。
二、核酸检测基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。
1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。
流感病毒分离鉴定
2、血细胞凝集抑制试验
按表加入材料和试剂
试管
1 待测 2 待测 3 血清对照 4 抗原对照 5 红细胞对照
生理盐水 －
－
0.2
1：5血清 0.2 0.2
0.2
4u病毒液 0.2 0.2
－
0.5％鸡红 0.2 0.2
0.2
细胞
0.2
0.4
－
－
0.2
－
0.2
0.2
结果观察 先观察3支对照管，如抗原对照管出现完全凝集，血清对照和红 细胞对照不发生凝集，再观察试验管。 血凝抑制效价：完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该 血清的抑制效价。 鉴定病毒时，效价应与原免疫血清效价相等或相似，血凝抑制 试验亦可用已知病毒抗原，测定病人血清抗体以进行血清学诊 断，恢复期比初期抗体效价增高4倍以上才有小镊子在无大血管处 撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管 中。
(2)取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。
(3)取10支小试管，按给各管加入生理盐水0.2mL。
(4)取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管 中，混匀后，再吸出0．2mL加入第2个试管中； 混匀后，从第2个试管吸出0．2mL加入第3个试 管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均 为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理 盐水对照管。
边缘不整齐。
“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
禽流感病毒的分离与鉴定技术
禽流感病毒的分离与鉴定技术孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。
如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。
①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。
该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。
禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。
一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。
高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。
①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。
目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。
近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。
文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。
①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。
死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。
由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。
①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。
对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。
内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。
①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。
标准操作规程（SOP）——蔗糖密度梯度离心纯化流感病毒
标准操作规程（SOP）——一、目的流感病毒的浓缩和纯化方式可以分为物理和化学的方法。
如：超速离心法，酸沉淀法，红细胞吸附-释放法，蒸馏水透析法及聚乙二醇浓缩法等。
其中超速离心法最为常用并且纯度较高。
本SOP明确流感病毒蔗糖密度梯度离心纯化的标准操作方法，保证了实验结果的职能却可靠。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行蔗糖密度梯度离心纯化流感病毒。
三、程序（一）生物安全要求H5、H7亚型高致病性禽流感病毒及H2N2亚型流感病毒的操作需要在BSL-3级实验室中进行。
其余流感病毒的操作需要在BSL-2级实验室中进行。
操作人员的生物安全防护要求详见流感中心“生物安全个人防护SOP”（二）材料1．病毒液2．PBS（100mmol/L pH7.2）液3．30%和60%蔗糖溶液4．耗材（注射器，离心管，吸管，实验滤纸）（三）实验步骤1．将待纯化的流感病毒种子株接种鸡胚或者MDCK细胞，收获病毒尿囊液。
具体接种方法参见“流感病毒的鸡胚分离方法SOP”和“MDCK细胞分离流感病毒SOP”。
2．将流感病毒收获的鸡胚尿囊液使用实验滤纸粗滤，以去除蛋壳或者其它沉淀物。
MDCK细胞培养的病毒收获液可以省略此步骤。
3．收集过滤液，使用SIGMA3K18 高速离心及2000rpm离心20min，去沉渣。
4．将上清使用OptimaTM L-80XP 超速离心机30000rpm的转速离心1h，去上清。
加入100mmol/L pH7.2的PBS液数滴浸泡沉淀，置4℃冰箱过夜。
5．制备蔗糖梯度管，用10mL吸管加5mL的60%的蔗糖溶液于管底，在其上小心加入10mL的30%的蔗糖溶液。
在其上缓慢加入20mL病毒悬液。
6．使用OptimaTM L-80XP 超速离心机20000rpm的转速离心1.5h，取出离心管。
使用注射器小心吸取位于30%和60%之间的靠近管底的病毒条带。
7．于所收获的液体加入5倍体积的PBS液，混匀后30000rpm的转速离心1h，去上清。
4 流感病毒标本采集、运输、分离检测及注意事项
将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一 份标本；
在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填 写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一 塑料袋密封；
将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以 柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者 2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密 封。所有容器必须有生物危险标识。
感病毒对热很敏感 • 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别，
采样日期 • 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。
24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 ℃或以下
血清学标本注意事项
• 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清塑料管里， 拧紧；
膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部
的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育
不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
流感病毒操作要求生物安全规程
禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床 标本和已知标准病毒
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同 动物的标本
国家流感中心 张烨
标本种类
临床标本
鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等
血清标本
病人的急性期和恢复期血清双份血清
临床样本的选择
采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待 查病例
流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者， 而缺乏其它的实验室确定诊断依据
采集时间：病人发病后的头三天
RT-PCR 组成成分
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94 温 度 72 （℃）
在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填 写“流感/人禽流感监测病例标本原始登记表”，用另一 塑料袋密封；
将装标本的密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以 柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同一患者 2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密 封。所有容器必须有生物危险标识。
感病毒对热很敏感 • 标本管标识明确：医院名称，标本号，患者姓名，性别，
采样日期 • 标本采集后尽量在24小时内送到实验室进行病毒分离。
24小时内未能进行病毒分离的标本应放-70 ℃或以下
血清学标本注意事项
• 血清学最好采集急性期和恢复期的双份血清塑料管里， 拧紧；
膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限 标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎头部
的位置 如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育
不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
流感病毒操作要求生物安全规程
禁止在同一实验室，同一时间处理接种未知临床 标本和已知标准病毒
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同 动物的标本
国家流感中心 张烨
标本种类
临床标本
鼻拭子、咽拭子、鼻咽吸取物、漱口液等
血清标本
病人的急性期和恢复期血清双份血清
临床样本的选择
采样对象：流感样病例（没有服用过抗病毒药物 ）、人禽流感待 查病例
流感样病例:发热（体温≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者， 而缺乏其它的实验室确定诊断依据
采集时间：病人发病后的头三天
RT-PCR 组成成分
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
94 温 度 72 （℃）
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流感病毒的分离技术操作规范
病毒分离培养是流感样病例病原学监测的基础，是流感病毒检测最常用和最可靠的方法之一。
目前多采用鸡胚和MDCK细胞进行流感病毒分离。
通过鸡胚分离的流感毒株与原始标本的抗原性和基因特性可能会有所不同，而通过MDCK细胞所分离的流感病毒与原始标本相似。
另外由于“0”相毒株的重现，MDCK细胞对“0”相毒株的敏感性远高于鸡胚，所以MDCK细胞已成为流感病毒分离不可缺少的一种宿主系统。
但是目前全球主要使用鸡胚进行流感疫苗生产，MDCK分离的病毒在很多国家尚未批准用于疫苗生产，因此鸡胚分离仍然发挥着举足轻重的作用。
具备流感病毒分离能力的流感监测网络实验室收到哨点医院的常规监测标本后，要求利用状态良好的MDCK细胞和（或）鸡胚进行病毒分离。
若同时进行MDCK细胞和鸡胚分离，为减少工作量，可先用MDCK 细胞对原始标本进行筛选，MDCK细胞病毒分离结果为阳性后，再将另外一份-70℃或以下温度保存的原始标本进行鸡胚双腔接种（羊膜腔和尿囊腔），进行病毒分离。
（-）实验室生物安全级别和生物安全规定
1.流感病毒分离实验室生物安全级别：季节性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二级；高致病性禽流感病毒生物安全三级。
2.流感病毒分离实验室生物安全规定
应当遵守生物安全实验室的有关生物安全的规定。
（二）流感病毒的细胞分离标准操作规程（所列试剂生产厂家及货号仅供参考）
1.试验材料
（1）刚75-90%成片的MDCK细胞，T-25细胞瓶
（2）TPCK处理胰酶（牛胰腺来源VIiI型）（S1GMAT8802）
（3）HEPES缓冲液,IM母液
（4）D-MEM培养基（高糖，含有1-谷氨酰胺），Hank,s 液
（5）青、链霉素母液（10,000U∕m1青霉素
G,10,000μg∕m1硫酸链霉素）
（6）牛血清白蛋白组分V,7.5%溶液
（G1BCOCatNo15260）
（7）处理好的临床标本0.5m1（标本处理参见附件1第一部分）
（8）无菌移液管：Im1和Iom1
2.培养基和试剂的准备（建议：经常检查试剂的有效期）
（1）50Om1D-MEM液中加入：
a）青、链霉素母液5m1（终浓度达：100U∕m1青霉素和100μg∕m1链霉素）
b）牛血清白蛋白组分V12.5m1（终浓度025%）
c）HEPES缓冲液12.5m1（终浓度:25mM）
d）加入7.5%NaHCO310-15m1（终浓度：2-3%）
（2）病毒生长液：再向上述培养液中每50Om1加入0.5m1的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg∕m1）使TPeK-胰酶的浓度为2μg∕m10
3.流感病毒MDCK细胞分离程序
所有有关流感病毒分离的操作都应在相应生物安全级别的实验室中进行，必须遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定，做好个人防护要求。
（1）75〜90%成片细胞的准备
a）用40倍光学显微镜镜观察细胞生长状态。
选择处于对数生长期的MDCK细胞用于病毒的分离。
b）轻轻倒出细胞生长液，用IOm1的无菌移液管吸
6m1pH747.6的HankS液清洗细胞3遍。
（2）接种于细胞培养瓶
a）用无菌的移液管将清洗细胞的HankS液从细胞培养瓶中移出。
b）用无菌的移液管吸取500μ1临床样品置于细胞培养
瓶中，温和摇动数次，使之均匀铺于细胞培养瓶底。
c）将步骤2）中的培养瓶放入35°C,5%Co2培养箱中吸附1〜2h。
d）从培养箱中取出细胞培养瓶，用IOm1的无菌移液管吸取6m1pH7.4-7∙6的HankS液清洗细胞，加入5m1含终浓度2μg∕m1TPCK-胰酶的病毒生长液于细胞培养瓶中。
e）放置于35°C5%CO2培养箱培养。
f）每日观察细胞病变情况（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大成网状，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。
（3）细胞培养物的收获
a）当75%~100%细胞出现病变时进行收获。
即使无细胞病变也应该于第7天收获。
b）进行红细胞凝集试验（HA）,用H1方法进行流感病毒的鉴定（具体方法参见附件1：五、红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验）。
对于HAW8的细胞分离物,进行10-1〜0-3稀释后，再感染细胞继续进行细胞传代，直至HA28时才能利用H1方法进行病毒的鉴定。
经连续传代2次以上，HA<8者，可以用核酸检测方法鉴定分型。
（三）流感病毒鸡胚分离标准操作规程
1.试验材料
(1)9~11日龄鸡胚
(2)照卵灯
(3)70%~75%酒精
(4)一次性注射器
(5)鸡蛋开孔器
(6)蜡、胶水或胶布
(7)IOm1试管和试管架
(8)IOm1移液管
(9)无菌镜子
2.流感病毒鸡胚分离程序
所有有关病毒分离的操作都应遵守生物安全规定，严格执行标准操作规程和废弃物管理规定。
进入生物安全实验室要求遵循生物安全实验室的个人防护要求。
(1)验卵
a)用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊腔的界限、胚胎的位置。
如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。
b)如何判断鸡胚状态
血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块。
胎动：活胚有明显的自然运动，但是大于14天的胎动则不明显；死胚无胎动。
c)绒毛尿囊膜发育界限：血管密布的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的
另一面(卵黄囊)形成明显的界限。
(2)鸡胚接种(照视下双腔接种法)
a）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚,通常每个样本接种3个鸡胚。
b）用70%~75%酒精消毒鸡胚表面，在气室端钻孔，开约6x6mm裂口。
c）注射器装上16号针头，吸200μ1处理过的临床标本。
d）从裂口中滴入无菌的液体石蜡,然后轻轻晃动鸡胚,让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开大约ICm2面积（石蜡层不可将壳膜内层完全覆盖，会导致死胚），此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。
将注射针头缓慢刺入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颗及腿，当进入羊膜腔时,能看到鸡胚随着针头的拨动而动，即可注射100μ1临床标本。
将针头退出至1/2寸长度，将另外100μ1临床标本注入鸡胚尿囊腔。
e）用同一注射器和针头将同一标本依上法接种另外两枚鸡胚。
f）将针头弃于合适的生物安全装置中。
g）用消毒过的医用胶布封口。
h）33〜35℃温箱培养鸡胚2~3天。
一般A型流感病毒培
养2天，B型流感病毒培养3天，临床采样标本通常培养3
天。
鸡胚进行病毒分离培养时，每天检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。
（3）鸡胚尿囊液和羊水的收获
a）鸡胚在收获前应置4℃过夜或至少放置4h。
b）标记15m1无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致。
用70%~75%酒精消毒鸡胚顶部。
c）用无菌镣子撕破鸡胚气室蛋壳，推开鸡胚尿囊膜。
用IOm1吸管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。
用吸管或无菌镣子刺破鸡胚羊膜，吸取羊水放置于另外的管中。
羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并。
d）将鸡胚收获液300OrPm离心5min去除血液和细胞。
进行红细胞凝集试验。
没有红细胞凝集现象的标本，应再进行鸡胚盲传2次（对于相的毒株，需要连续传代多次才能具备在鸡胚中生长的特性）,盲传后HA滴度仍为阴性的标本,可按有关生物安全规定进行处理。
对于HA<8的鸡胚分离物进行10」〜10-3稀释后，继续进行鸡胚传代，HAN8时才能利用H1方法进行病毒的鉴定。
经连续传代2次后HA<8者，可以用核酸检测方法鉴定分型。
（四）注意事项
1.不要在・20℃条件下保存病毒分离物，因为该温度条件下流感病毒极不稳定。
2.流感病毒分离操作严格按照生物安全规程的要求。
禁止在同一实验室，同一时间处理和接种未知临床标本和已知病毒。
禁止在同一实验室，同一时间处理接种采自不同动物的标本；动
物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。