(2.1)--酶与酶工程

酶学与酶⼯程重点总结第⼆章酶学基础⼀、酶的活性中⼼(active center，active site)（⼀）活性中⼼和必需基团1、与酶活性显⽰有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域，叫酶的活性中⼼，⼜叫活性部位。

2、活性中⼼可分为结合部位和催化部位。

3、结合部位决定酶的专⼀性，催化部位决定酶所催化反应的性质。

4、酶结构概述（1）活性中⼼是⼀个三维实体。

（2）是有⼀些⼀级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有的还包含辅酶或辅基的某⼀部分基团。

（3）在酶分⼦表⾯呈裂缝状。

（4）酶活性中⼼的催化位点和结合位点可以不⽌⼀个。

（5）酶活性中⼼的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中⼼以外的基团。

5、酶分⼦中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类1．接触残基2．辅助残基3．结构残基4．⾮贡献残基（⼆）酶活性中⼼中的化学基团的鉴别1．⾮特异性共价修饰：某些化学试剂能使蛋⽩质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发⽣变化。

如果某基团修饰后不引起酶活⼒的变化，就可初步认为此基团可能是⾮必需基团；反之，如修饰后引起酶活⼒的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团。

2．亲和标记共价修饰剂是底物的类似物，可专⼀性地引⼊酶的活性中⼼，并具有活泼的化学基团(如卤素)，可与活性中⼼的基团形成稳定的共价键。

因其作⽤机制是利⽤酶对底物类似物的亲和性⽽将酶共价标记的，故称为亲和标记。

3．差别标记在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中⼼的情况下，加⼊共价修饰剂，使后者只修饰活性中⼼以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制剂，暴露活性中⼼，再⽤同位素标记的向⼀修饰剂作⽤于活性中⼼的同类基团；将酶⽔解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸参与活性中⼼。

4．蛋⽩质⼯程这是研究酶必需基闭和活性中⼼的最先进⽅法，即将酶蛋⽩相应的互补DNA(cDNA)定点突变，此突变的cDNA表达出只有⼀个或⼏个氨基酸被置换的酶蛋⽩，再测定其活性，可以知道被置换的氨基酸是否为活⼒所必需。

① 酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或者服务于其它目的地一门应用技术。

② 比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或者 RNA 所拥有的酶活力单位数。

③ 酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。

其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。

④ 酶活国际单位 : 1961 年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件 )下，每分钟内能转化1 μmol 底物或者催化1 μmol 产物形成所需要的酶量为 1 个酶活力单位，即为国际单位(IU)。

⑤ 酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。

酶的研究简史如下：(1)不清晰的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。

(2)酶学的产生： 1777 年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验； 1822 年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化； 19 世纪 30 年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。

1684 年，比利时医生Helment 提出 ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素(酵素)；1833 年，法国化学家 Payen 和Person 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶； 1878 年，德国科学家 K hne 提出 enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”(希腊文)。

(3)酶学的迅速发展(理论研究)： 1926 年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930 年，美国的生物化学家 Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。

I.酶工程发展如下：①1894 年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908 年，德国的Rohm 用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911 年， Wallerstein 从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949 年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出的控制子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971 年各国科学家开始使用“酶工程”这一位词。

1.酶1.1酶的基本概念酶的化学本质是蛋白质，这一点是被生物化学所证明了的，研究酶的化学本质，可用研究蛋白质的方法进行研究。

一般情况下，一个结构完整的酶包括蛋白质和非蛋白质两部分，蛋白质部分称为辅基酶蛋白，非蛋白质部分称为辅助因子，辅基酶蛋白和辅助因子构成一个全酶。

辅助因子的化学本质因不同的酶而不同，它可以是小分子量的有机化合物，也可以是无机矿物质离子。

酶是一种生物催化剂，在催化活性上与无机催化剂类似，酶在催化反应时，其本身不发生化学改变，只是催化反应的进行，此外，酶在催化反应时，仅改变反应速度，并不改变反应的平衡。

酶催化反应的动力学机理是降低反应的活化能。

酶作为生物催化剂，其催化反应的专一性远远超过无机催化剂，根据酶的专一化程度，可分为绝对专一性和相对专一性。

绝对专一性：是指一种酶只能催化一种底物进行一种反应，底物的分子结构、空间构型及构象的不同都表现出专一性。

相对专一性：是指一种能够催化一类结构相似的物质进行相同类型的反应，主要是对某一化学键的专一性。

例如，胰蛋白酶(Trypsin EC 3.4.31.4)催化含有赖氨酸或精氨酸羰基的肽键的水解反应，凡是具有含赖氨酸或精氨酸羰基酰胺键的底物都能被此酶催化水解。

1.2酶的结构和功能构成酶活性中心的氨基酸在一级结构上，呈分散状态，这些氨基酸是通过酶蛋白的二、三、四级结构使得其在空间上彼此集中，构成一个特定的与酶活性表达有关区域，这个特定区域即酶的活性中心(active center)，换句话说，酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并催化反应的特定基团或特定区域。

酶活性中心包括两部分，其一是底物结合部位，其二是催化部位。

必需基团参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象。

必需基团是指酶分子中某些基团若经化学修饰后（氧化、烷化、酰化、还原等）使其结构改变，则酶分子丧失活性。

活性部位的基团都是必需基团，必需基团包括活性中心基团和其外的对维持酶活性空间构象所必需的一些基团。

一、1.酶工程：酶的生产，改性与应用的技术过程。

(生产:通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程;改性:通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程;应用:通过酶的催化作用获得人们所需物质或除去不良物质的技术过程)2固定化酶的活力测定①固定化酶:与水不溶性载体结合,在一定空间范围内起催化作用的酶.②测定方法:振荡测定法;酶柱测定法;连续测定法③评价:酶柱进行固定化时并非所有的酶都成为固定化酶，总有一部分酶没有与载体结合，所以需要测定酶结合效率或酶活力回收率以确定固定效果.当固定化方法对酶的活力无明显影响时,酶结合效率与酶活力回收率数值相近.然而固定化载体和固定化方法往往对酶的活力有一定影响，两者数值往往有较大差异.所以常通过测定酶结合效率来表示固定化效果。

3酶的生产方法①生物合成法(微生物,动物,植物):筛选诱变,细胞融合,基因重组等获得优良菌体-细胞培养(人工控制生物反应器)-代谢产物(细胞内物质新陈代谢)-分离纯化得到所需酶②提取分离法:动植物细胞,组织,器官细胞或微生物细胞-酶(提取分离纯化技术)-分离纯化得到所需酶③化学合成法4酶工程发展概况:初期:从动植微生物中提取并应用(受原料技术限制,大规模生产受限)-微生物液体深层发酵生产细菌α-淀粉酶-操纵子学说阐明合成机制,人工控制提高效率-动植物细胞培养技术-酶的改性二、1酶的发酵生产:经预先设计,通过人工操作,利用微生物生命活动获得所需酶的技术过程2优良产酶微生物应具备的条件:酶产量高;产酶稳定性好;容易培养和管理;利于酶的分离和纯化;安全可靠无毒性3培养发酵类型①固体培养发酵②液体深层发酵:液体培养基经灭菌,冷却接种产酶细胞,在一定条件下发酵产酶③固定化微生物细胞发酵:特点a细胞密度大,产酶能力高b发酵稳定性好可多次使用c细胞固定在载体上,流失较少,可在高稀释条件下连续发酵d发酵液中含菌体较少,利于分离纯化,提高产品质量④固定化原生质体发酵(特点)a去除细胞壁利于胞内物质分泌到细胞外b原来存在于细胞间的物质如碱性磷酸酶等游离到细胞外变为胞外产物c载体保护稳定性好,连续或重复使用4酶生物合成模式:①同步合成型:酶的生物合成与细胞生长同步进行②延续合成型:酶的合成在细胞的生长阶段开始,在细胞生长进入平衡期后还可以延续合成一段较长时间③中期合成型:酶的合成在细胞生长一段时间后才开始,而在细胞生长进入平衡期后,酶的生物合成也随之停止④滞后合成型:在细胞生长一段时间后或进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累5发酵工艺条件及控制:①ph产酶最适ph不同于生长最适ph,随细胞生长代谢产物积累等会改变ph,改变培养基ph往往可以调整各种酶的产量比例②温度:产酶最适温度一般<生长最适温度;新陈代谢及热量扩散使培养基处于一平衡温度③溶解氧:调节方法:调节通气量,氧分压,气液接触时间,气液接触面积,改变培养基性质6提高酶产量的措施:添加诱导物如酶的作用底物,催化反应产物,作用底物类似物b控制阻遏物浓度(产酶阻遏,分解代谢物阻遏)c添加表面活性剂:与细胞膜作用,提高通透性,利于胞外酶的分泌d添加产酶促进剂促进产酶7酶发酵动力学的相关概念:①发酵动力学:研究发酵过程中细胞生长速率,产物生成速率,基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科②稀释率:单位时间内流加的培养液与发酵容器总发酵液体积之比③细胞生长得率系数:细胞浓度变化量与基质浓度降低量的比值④产物生成得率系数:产物浓度变化量与基质浓度降低量的比值⑤细胞维持系数:单位时间内基质浓度变化量与细胞浓度的比值8固定化微生物细胞发酵产酶①固定化细胞:采用各种方法固定在载体上,在一定空间范围内进行生长繁殖和新陈代谢的细胞②固定化细胞产酶特点:a提高产酶率b反复使用或连续使用较长时间c基因工程菌质粒稳定不易丢失(载体的保护作用使质粒结构稳定性和分裂稳定性提高)d发酵稳定性好e缩短发酵周期,提高设备利用率f产品易分离纯化(固定化细胞不溶于水,完成后易与发酵液分离,且发酵液中所含游离细胞少,利于产品分离纯化,提高产品纯度和质量)g适于用胞外酶等胞外产物的生产9、固定化微生物细胞发酵产酶的条件及控制:a固定化细胞的预培养b溶解氧的供应c温度控制d培养基组分的控制三、动植物细胞培养产酶1.培养细胞:动物:悬浮培养,贴壁培养,微载体培养等;植物:固体培养,液体浅层培养,液体悬浮培养2.动物细胞产酶产物:疫苗,激素,多肽生长因子,酶,单克隆抗体,非抗体免疫调节剂3.特点:a主要用于各种功能蛋白质和多肽的生产b生长较慢c添加抗生素防止微生物污染d无细胞壁,严格控制生长条件e多数细胞具依赖性,易采用贴壁培养,部分可采用悬浮培养f培养基成分复杂,一般要添加血清或其代用品,产品分离过程复杂g细胞培养代数有限,定时分离4.动物细胞培养过程:将种质细胞用胰蛋白酶消化处理-分散成悬液细胞-接入适宜培养液中-反应器(人工控制条件)中进行悬浮培养或贴壁培养-培养完成,收集培养液分离纯化得到产物5.条件控制:a温度36.5℃+-0.25bph(7.0-7.6)c渗透压(700-850kpa)d溶解氧(不足受抑制,过多产生毒害)四、酶的提取与分离纯化1.细胞破碎方法:机械破碎法(捣碎,研磨,匀浆);物理破碎法(温度差,压力差,超声波);化学破碎法(添加有机溶剂,表面活性剂);酶促破碎法(自溶法,外加酶制剂法)2.提取方法:a盐溶液提取b酸溶液提取c碱溶液提取d有机溶剂提取3.影响提取的因素: 温度;ph;提取液体积4.沉淀分离法:a盐析法b等电点沉淀法(两性电解质在等电点时溶解度最低及不同的两性电解质有不同等电点特性)c有机溶剂沉淀法d复合沉淀法(在酶液中加入某些物质使之与酶形成复合物而沉淀)e选择变性沉淀法(选择一定条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀而不影响所需酶)5.过滤与膜分离的方法:①非膜过滤:采用高分子膜以外的材料过滤介质(粗滤d>2um)微滤d=0.2-2um②膜过滤:一定孔径的高分子薄膜a加压膜分离:微滤,超滤,反渗透b电场膜分离:电渗析,离子交换膜电渗析c扩散膜分离:透析6.萃取:利用物质在两相中溶解度不同而使其分离的技术a有机溶剂萃取:水相+有机溶剂相b双水相萃取:互不相容的两个水相7.结晶:溶质以晶体形式从溶液中析出的过程8.结晶法:a盐析结晶法b有机溶剂结晶法c透析平衡结晶法d等电点结晶法五、酶分子修饰1.金属离子置换修饰:把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的催化特性发生改变的修饰方法2.过程:将酶分离纯化除去杂质,获得具一定纯度的酶液-加入一定量的金属螯合剂与酶分子中的金属离子形成螯合物,再通过透析超滤等方法除去螯合物-加入一定量的另一种金属离子并除去多余置换离子3.金属离子置换修饰的作用①了解各种金属离子在酶催化过程中的作用,阐明金属离子对酶催化作用的影响②提高酶的催化效率③提高酶的稳定性④改变酶的动力学特征4.大分子结合修饰的作用:a提高酶的催化效率b提高酶的稳定性c降低或消除酶蛋白的抗原性5.酶分子修饰的应用:①酶学研究方面的应用:活性中心研究,空间结构研究,作用机制研究②医药方面的应用:降低或消除酶的抗原性,提高医药用酶的稳定性六、酶固定化1.酶固定化:采用各种方法将酶固定在水不溶性载体上,制备成固定化酶的过程.固定在水不溶性载体上并在一定的空间范围内进行催化作用的酶称固定化酶2.固定化方法:①吸附法:活性炭,氧化铝,硅藻土,硅胶等②包埋发:将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中,使酶固定化的方法(凝胶包埋法,半透膜包埋法)③结合法:选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法④交联法3.固定化酶的特性:①稳定性a对热稳定性提高b保存稳定性好c对蛋白酶抵抗性提高,不易被蛋白酶水解d对变性剂的耐受性提高②最适温度一般较游离酶变化不大③最适ph:载体性质与产物对最适ph值均有影响④底物特异性:小分子底物一般无变化,大小分子底物均可的特异性有改变4.细胞固定化方法:a吸附法b包埋法5.微生物细胞固定化特点:①保持细胞的完整结构和天然状态,可以进行正常的生长繁殖②保持细胞内原有体系,可按原来代谢途径进行,并进行有效的代谢调节控制③发酵稳定性好,可反复使用或连续使用很长一段时间④细胞密度提高,产率提高⑤载体保护可提高基因工程菌的质粒稳定性6.固定化微生物细胞的应用:①生产各种产物(只用于生产能分泌到细胞外的产物:酒精类，aa,有机酸,酶和辅酶,抗生素)②制造微生物传感器:呼吸活性测定型和电极活性测定型7.固定化动物细胞的特点:a提高存活率b提高产率c反复使用或连续使用较长时间d易于与产物分开,利用产物分离纯化,提高产品质量8.动物细胞固定化方法:吸附法包埋法六、酶反应器1.类型(依其结构)a搅拌罐式:设备简单易操作,酶与底物混合较均匀,传质阻力小,反应较完全,反应条件易调节控制b 填充床式:设备简单操作方便,单位体积反应床的固定化酶密度大,可提高酶催化速度,在工业生产中普遍使用c流化床d 鼓泡式e膜反应器和喷射式等2.酶反应器的操作条件:温度,ph,底物浓度,酶浓度,反应液的混合与流动3.酶反应器的操作注意事项:①控制好各种条件②保持酶反应器的操作稳定性③防止酶的变性失活④防止微生物污染七、酶的应用1.酶在医药方面的应用a进行疾病的诊断(根据体内酶的活性变化诊断疾病)b进行疾病的预防和治疗(用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病)c制造各种药物2.酶在淀粉类食品生产方面的应用:α-淀粉酶-糊精,麦芽糊精; α-淀粉酶、糖化酶-淀粉水解糖,G; α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶-饴糖、麦芽糖、啤酒酿造;支链淀粉酶-直链淀粉；糖化酶、支链淀粉酶-G。

《酶及酶工程》教学大纲Enzyme and Enzyme Engineering课程编码：27A11419 学分： 4.0课程类别：专业必修课计划学时：80 其中讲课：48 实验或实践：32适用专业：生物技术推荐教材：郭勇主编，《酶工程原理与技术》第二版，高等教育出版社，2010年。

参考书目：付加芳编，《酶及酶工程实验》，济南大学出版，2015年。

郭勇主编，《酶工程》第三版，科学出版社，2009年。

课程的教学目的与任务学生通过该课程的学习，应熟悉从应用目的出发研究酶，掌握酶工程的基本原理、酶的生产方法、酶的提取与分离纯化、酶的改造方法、非水相酶催化、酶反应器以及酶的应用，根据需要通过人工操作，掌握酶的生产与应用的技术过程。

进一步了解酶在各行各业中实际应用的最新发展和发展趋势，在以后的毕业环节和工作中能够自觉地应用这些技术方法来指导自己的工作。

本课程实验部分是为《酶及酶工程》课所开的实验。

通过本实验，应使学生掌握酶基本的分离纯化、纯度及分子量测定方法，同时了解凝胶包埋固定脲酶的处理方法及活力、Km值的测定方法，掌握各个因素对脲酶活力的影响测定方法。

通过系统的实验训练，培养学生的独立实验、观察问题、分析问题和解决问题的能力。

课程的基本要求通过本课程的学习要求学生了解酶及工程的发展概况、应用领域及研究内容；掌握酶的生产及分离纯化、酶和细胞的固定化、酶分子的修饰和改造的理论基础；熟悉工业酶生产常用菌种的产酶特性；熟悉工业酶发酵的工业流程、培养条件的优化调控以及提高酶产量所采取的措施；了解固定化细胞、动、植物细胞发酵产酶的特点及工艺条件控制；掌握酶的结晶、浓缩与干燥的原理与常用方法；掌握酶和菌体固定的原理、方法，以及固定化酶的性质。

掌握和了解微生物、植物、动物细胞和原生质的固定方法及应用。

对酶反应器有一定的认识，并掌握酶反应器的设计原理和操作要点；了解酶的动力学和酶在轻工、食品、医药工业、化工、环境保护等领域的应用以及酶应用的最新发展。