慢病毒介导的Sox9基因在兔骨髓间充质干细胞的过表达促进软骨损伤修复

骨髓间充质干细胞复合脱钙骨基质修复兔膝关节全层软骨缺损的实验李强;孙正义;王栓科;刘文忠;张钦【期刊名称】《第四军医大学学报》【年(卷),期】2004(25)15【摘要】目的:研究骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)复合脱钙骨基质(deminerized bone matrix, DBM)修复兔膝关节全层软骨缺损的疗效. 方法:MSCs取自4～6 mo龄2.5～3.5 kg的青紫兰兔,体外分离培养后种植于DBM 支架上体外培养,再移植于兔膝关节全层软骨缺损模型处. 实验动物选用健康的青紫兰兔36只,随机分成A, B, C 3个处理组各12只,A处理组(MSCs/DBM)双侧股骨髁间窝软骨缺损处植入DBM吸附体外分离培养的自体MSCs复合物;B处理组(DBM)单纯植入DBM;C处理组(对照)不作任何植入. 分别于术后4, 8和12 wk各处死4只兔子,取材进行大体、组织学及免疫组化染色观察,根据关节软骨组织学计分标准进行评分,数据输入SPSS 10.0软件统计分析,比较各组的评分差异是否具有统计学意义. 结果:MSCs复合DBM所修复组织为透明软骨样修复;而单纯DBM移植组和对照组为纤维性修复. 对术后12 wk大体及组织学形态进行评分. 按完全随机设计进行方差分析和SNK-q检验,结果显示,SMCs/DBM组明显优于DBM植入组和对照组(P<0.05);DBM组优于对照组(P<0.05). 结论:运用软骨组织工程的原理,以DBM为支架材料的自体MSCs移植是一种修复软骨缺损的行之有效的方法.【总页数】4页(P1375-1378)【作者】李强;孙正义;王栓科;刘文忠;张钦【作者单位】兰州医学院第二医院骨科研究所,甘肃,兰州,730030;兰州医学院第二医院骨科研究所,甘肃,兰州,730030;兰州医学院第二医院骨科研究所,甘肃,兰州,730030;兰州医学院第二医院骨科研究所,甘肃,兰州,730030;兰州医学院第二医院骨科研究所,甘肃,兰州,730030【正文语种】中文【中图分类】R322【相关文献】1.纤维蛋白凝胶和脱钙骨基质支架材料复合软骨细胞修复兔膝关节软骨缺损的实验研究 [J], 何劼;杨翔;岳鹏举;王冠宇;郭亭;赵建宁2.自体骨髓间充质干细胞藻酸钙载体复合物对兔膝关节软骨缺损修复影响的实验研究 [J], 于灏;辛畅泰3.自体骨髓间充质干细胞藻酸钙载体复合物对兔膝关节软骨缺损修复影响的实验研究 [J], 于灏;辛畅泰4.温敏性高黏度几丁聚糖水凝胶复合脱钙骨基质修复兔膝全层软骨缺损的初步研究[J], 井波;王志强;李宝兴;程志山;康悦;李琪佳5.自体骨髓间充质干细胞复合胶原膜修复兔膝关节全层软骨缺损的实验研究 [J], 林建华;王日雄;陈雷;修忠标;吴朝阳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Sox9促进间充质干细胞向软骨分化的研究进展软骨损伤修复是目前临床治疗的难点之一，组织工程学的应用为解决这一难题提供了方向。

利用sox9基因转染给间充质干细胞（MSCs）使后者向软骨分化，而获得稳定的软骨细胞及软骨组织，为软骨损伤修复提供的丰富的软骨来源。

Sox9能激活软骨细胞外基质基因col2a1、col11a2、COMP、蛋白聚糖基因的轉录因子使其过表达，而胶原蛋白I、胶原蛋白II、蛋白聚糖、糖胺多糖等软骨组织特异性蛋白生成也增加。

sox9通过抑制Wnt/β-catenin通路及核心结合蛋白因子2的活性，增加甲状旁腺激素相关肽的表达，抑制软骨细胞过度生长及骨化，从而维持软骨形态及功能。

在sox9的机制研究中发现生长因子、sox5和sox6、机械应力、锌指蛋白145、MicroRNAs等参与sox9的表达及调控。

目前研究者主要利用病毒或非病毒载体系统将sox9基因转染给间充质干细胞，促进MSCs 向软骨分化来获得软骨来源。

在体外的动物实验中SOX9基因转染后的MSCs 发生了软骨细胞方向的分化，部分动物体内实验证实转染后的间充质干细胞形成了新的软骨组织。

这些实验结果提示sox9基因具有应用于软骨修复的组织工程的潜力及优势，是未来软骨工程学的发展方向之一。

标签：sox9基因；间充质干细胞；软骨；分化软骨组织具有高度分化、细胞含量少、营养供给少等特点。

软骨组织一旦发生损害，往往难以完全修复，故软骨损伤或缺失的修复成为临床治疗的难点之一。

目前临床上常用的治疗方式主要包括药物治疗及软骨自体移植，但往往只能达到缓解症状的目的[1]。

利用组织工程学方法修复软骨损伤成为目前研究热点之一。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是目前应用最为广泛的组织工程细胞。

它具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能，且取材方便，易于培养，自体移植无明显免疫排斥反应，因而被认为是组织工程理想的种子细胞[2，3]。

调控脂肪间充质干细胞成软骨分化基因Sox-9和低氧诱导因子1α的表达张传辉;李建军;杨军【摘要】背景：有学者采用基因转染的方法诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化，使种子细胞能够稳定合成和分泌特定的细胞因子，从而达到长期稳定刺激种子细胞增殖、分化和软骨形成的目的。

<br> 目的：观察胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间充质干细胞低氧诱导因子1α和Sox-9表达的影响。

<br>方法：①取成年新西兰大耳白兔颈后部皮下脂肪组织，分离、培养兔脂肪间充质干细胞，免疫荧光法鉴定后在脂质体介导下应用pcDNA3.1-IGF-1基因转染脂肪间充质干细胞，G418筛选，获得稳定转染的细胞株；②实验分为3组：正常传代培养的脂肪间充质干细胞；转染pcDNA3.1的脂肪间充质干细胞；转染pcDNA3.1-IGF-1的脂肪间充质干细胞。

③RT-PCR及Western blot法检测转染后细胞中胰岛素样生长因子1的表达，MTT法绘制细胞增殖曲线，Dil荧光染料标记后计数细胞增殖效率，免疫荧光法分析转染后细胞低氧诱导因子1α和Sox-9的表达情况，DMMB定量测定总糖胺聚糖含量。

<br> 结果与结论：①成功构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株，RT-PCR及Western blot检测证实转染后的细胞株在mRNA水平上获得胰岛素样生长因子1的表达，并且成功翻译为蛋白；②MTT 提示转染后细胞增殖活性增强；③胰岛素样生长因子1基因转染显著提高Dil标记脂肪间充质干细胞的增殖效率；④转染后细胞的低氧诱导因子1α和Sox-9表达阳性；⑤胰岛素样生长因子1基因转染组糖胺聚糖含量明显高于其他2组(P<0.01)。

⑥结果说明，胰岛素样生长因子1基因转染能够能够有效促进脂肪间充质干细胞增殖，促使阳性表达低氧诱导因子1α和成软骨分化调控基因Sox-9，并有效促进细胞分泌软骨细胞外基质糖胺聚糖。

绿色荧光蛋白标记SOX9基因慢病毒载体的构建及在兔骨髓间充质干细胞中的表达刘伟;王杰;幸永明;赵宏;龚德军【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2017(021)001【摘要】目的：构建绿色荧光蛋白标记的 SOX9基因慢病毒载体，转染兔骨髓间充质干细胞，观察 SOX9基因的表达情况。

方法双酶切从 GeneArt提供的含SOX9基因序列的质粒13ABIV6C＿1366933并克隆到 pLenti6．3＿MCS＿IRES2-EGFP载体，获得含 SOX9基因的质粒 pLMIG-13GS0345-1，通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的SOX9基因慢病毒载体（Lenti-SOX9-GFP），将Lenti-SOX9-GFP转染兔骨髓间充质干细胞后观察SOX9基因的表达情况。

结果测序结果显示质粒 pLMIG-13GS0345-1中的插入序列与基因库中 SOX9（NM ＿000346）基因序列完全一致，成功构建 Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体。

Lenti-SOX9-GFP转染兔骨髓间充质干细胞后可观察到绿色荧光蛋白的表达，RT-PCR与 Western Blot检测结果证明 Lenti-SOX9-GFP转染目的细胞后可在 mRNA及蛋白水平成功表达SOX9。

结论本实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带 SOX9基因的 Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体，并在兔骨髓间充质干细胞中成功表达，为下一步研究提供前期实验基础。

【总页数】6页(P140-145)【作者】刘伟;王杰;幸永明;赵宏;龚德军【作者单位】解放军第 113 医院骨科，浙江宁波 315040;解放军第 113 医院骨科，浙江宁波 315040;解放军第 113 医院骨科，浙江宁波 315040;解放军第113 医院骨科，浙江宁波 315040;第二军医大学附属长海医院胸心外科实验室，上海 200433【正文语种】中文【中图分类】Q813【相关文献】1.携带增强绿色荧光蛋白基因慢病毒载体标记兔滑膜间充质干细胞 [J], 陈常辉;余方圆2.网素蛋白1和增强绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体构建和鉴定及在结直肠癌细胞SW480中表达 [J], 何佳;邓峰美;林友胜;刘漪沦3.sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达 [J], 刘伟;王杰;幸永明;李纯志;陈昌伟;赵宏;龚德军;4.sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达 [J], 刘伟;王杰;幸永明;李纯志;陈昌伟;赵宏;龚德军5.绿色荧光蛋白基因腺病毒载体转染兔骨髓间充质干细胞的实验 [J], 黄锐;王宇;李坤;梅继文;姜晓丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第 50 卷第 1 期2024年 1 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.50 No.1Jan.2024DOI：10.13481/j.1671‑587X.20240109关节腔内注射脂肪干细胞对颞下颌关节骨关节炎模型兔关节软骨破坏的修复作用及其机制何静1,2, 孙高1, 李男男1, 帕丽孜·阿不力克木1, 吴国民1（1. 吉林大学口腔医院口腔颌面外一科与口腔整形美容外科，吉林长春130021；2. 吉林大学口腔医院　吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林长春130021）［摘要］目的目的：探讨关节腔内注射脂肪干细胞（ADSCs）对颞下颌关节骨关节炎（TMJOA）模型兔关节软骨破坏的修复作用，并阐明其可能的作用机制。

方法方法：27只兔随机分为对照组、模型组和ADSCs组。

提取兔ADSCs进行培养，采用碘乙酸钠（MIA）注射法制备兔TMJOA模型。

ADSCs组TMJOA模型兔颞下颌关节腔内连续2次注射1.0×106 mL－1ADSCs，对照组和模型组兔颞下颌关节腔内注射等量生理盐水，8周后取各组兔颞下颌关节行显微CT（Micro-CT）扫描，分析各组兔髁突组织的骨体积分数（BV/TV）、骨表面积/骨体积比（BS/BV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁间距（Tb.Sp）和骨小梁数（Tb.N），HE染色观察各组兔髁突组织病理形态表现，免疫组织化学染色法检测各组兔髁突组织中SRY相关高迁移率族盒基因9（SOX9）、基质金属蛋白酶13（MMP-13）和血管内皮生长因子（VEGF）的定位情况和蛋白表达水平，Western blotting法检测各组兔髁突组织中SOX9、MMP-13和VEGF蛋白表达水平。

结果结果：Micro-CT扫描，与对照组比较，模型组兔髁突组织的BV/TV、Tb.Th 和Tb.N明显降低（P<0.05），BS/BV和Tb.Sp明显升高（P<0.05）；与模型组比较，ADSCs组兔髁突组织的BV/TV、Tb.Th 和Tb.N明显升高（P<0.05），BS/BV和Tb.Sp 明显降低（P<0.05）。

动物医学进展，２０２０，４１（１２）：６８ ７３ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ过表达ＳＯＸ９改良软骨组织工程种子细胞的可行性研究　收稿日期：２０１９ １２ ０４　作者简介：胡　澜（１９９５－），女（回族），河南省三门峡市人，硕士研究生，主要从事骨关节炎的研究。

通讯作者胡　澜，祝子涵，吴俊楠，徐　瑶，肖建华（东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨１５００３０） 摘　要：自体软骨细胞是软骨组织工程最佳种子细胞，但存在细胞外基质合成能力的局限性。

为了获得合成细胞外基质能力更强的种子细胞，构建了ｐｃＤＮＡ３．１（＋） ＳＯＸ９哺乳动物过表达载体质粒，脂质体转染分离培养的大鼠关节软骨细胞。

免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＳＯＸ９过表达效率，实时荧光定量ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＣｏｌｌａｇｅｎⅡ（Ⅱ型胶原）和Ａｇｇｒｅｃａｎ（蛋白聚糖）ｍＲＮＡ和蛋白的表达，阿利新蓝染色检测细胞外基质合成情况。

结果表明，成功过表达软骨细胞的ＳＯＸ９基因，细胞外基质分泌能力明显增强，过表达ＳＯＸ９基因能够促进细胞外基质分泌，通过转染过表达ＳＯＸ９来改良软骨种子细胞具有可行性。

关键词：ＳＯＸ９基因；ｐｃＤＮＡ３．１（＋）哺乳动物过表达载体；种子细胞；细胞外基质中图分类号：Ｓ８５４．５＋６；Ｓ８５８．９１文献标识码：Ａ文章编号：１００７ ５０３８（２０２０）１２ ００６８ ０６ 关节软骨损伤是临床常见的关节疾病，而关节软骨损伤后难以自我修复或被纤维组织填充，甚至会演变为严重的退行性骨关节炎［１ ２］。

随着动物诊疗方法的进步，动物福利不断提升，对动物软骨缺损和骨关节的治疗和研究已经在国内外广泛开展。

当前改善动物的骨关节炎的方法以保护和抗炎为主，通过使用Ｏｍｒｇａ ３脂肪酸、软骨素和戊聚糖多硫酸盐等关节保护剂改善关节功能［３］；使用类固醇或非类固醇类药物能够达到抗炎效果［４］，但长期使用会损害关节软骨，加重关节损伤。

膝关节腔内注射Sox9转染骨髓间充质干细胞修复膝关节骨关节炎卓群豪;张伟娜;李舰;王红卫;郑峰;应彬彬【摘要】BACKGROUND:Bone marrow mesenchymal stem cel s are considered to have good proliferation and&nbsp;differentiation potentials. Sox9 is a transcription factor that is essential for chondrogenesis and has been termed as a“master regulator”of the chondrocyte phenotype. OBJECTIVE:To study the therapeutic effects of Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cel s on knee osteoarthritis. METHODS:The bone marrow mesenchymal stem cel s were transfected with Lenti-Sox9-EGFP in vitro. The model of murine knee osteoarthritis was established by cutting off the anterior cruciate ligament. Thirty model mice were randomly divided into three groups, as normal saline group, bone mesenchymal stem cel group and Sox9-transfected bone mesenchymal stem cel group. 0.1 mL of normal saline, 0.1 mL of normal saline containing non-transfected bone marrow mesenchymal cel s (non-transfected group), or 0.1 mL of normal saline containing Sox9-transfected bone marrow mesenchymal cel s (Sox9-transfected group) was injected into the knee joint cavity of mice in the corresponding group, respectively. After 4, 8, 12 weeks, the repair of articular cartilage lesions was evaluated by toluidine blue and immunohistochemical staining. RESULTS AND CONCLUSION:The lesions of articular cartilage were more serious in the normal saline group, compared with the other two groups, and the difference became moreobvious over time. Damaged articular cartilage was improved in the non-transfected group, but the improvement was less than that in the Sox9-transfected group. Immunohistochemistry staining revealed that in theSox9-transfected group, the positive type II col agen expression was stronger than that in the other two groups, but this positive expression was decreased over time in al the three groups. These results suggest that Sox9-transfected bone marrow mesenchymal stem cel s promote the repair of damaged cartilage in mice with knee osteoarthritis.%背景：相关研究认为，骨髓间充质干细胞具有良好的增殖及分化能力，Sox9转录因子在软骨形成及维持软骨细胞表型方面起关键作用。