免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用PPT课件

活性，因此被用来发展为一种简便而迅 速的免疫过氧化物酶法，即用SPA代替 PAP技术中的次级抗体，因SPA可与多种 动物的抗血清反应，而不需因不同种动 物而制备相应的第二抗体。SPA可以结合 大多数IgG分子，可以充当第一抗体和衍 生自不同种属的抗过氧化物酶抗体的桥 接物即SPA-过氧化物酶联法。同时由于 SPA与FC段的高亲和力可以减少非特异性 背景染色。
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PAP法是过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)复合物， 包括辣根过氧化物酶抗体，及辣根过氧化物酶抗原 组成的可溶性复合物为五环状结构，3个分子辣根过 氧化物酶和二个抗体分子组成，极为稳定，比免疫 荧光法敏感100-1000倍，比酶桥法敏感20倍，其原理 是特异性初级抗体（一抗）的Fab段与组织抗原结合， 二抗（桥抗）在一抗与PAP复合物之间形成分子桥联， 此时一抗与PAP中的免疫球蛋必须是同一种属，以使 得衍生自其它种属的二抗，对一抗分子PAP中的FC段 及稳定成份都具有特异性。
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1966年NakaNe和Averameas等建立了免疫酶标技术， 1970年seerNberger等人发展了一种过氧化物酶抗过氧化 物酶(PAP)技术，1975年Kohler和MilsteiN建立了杂交瘤制 备单克隆抗体技术，这些对于外科病理的发展是一个 重大的技术里程碑。随着辣根过氧化物酶代替荧光素 异硫氰酸盐，作为初级抗体的标记物，一种全新的信 号分子得到了应用，在辣根过氧化物酶中加入显色的 底物进行染色，产生一种能被普遍光镜所观察的稳定 显色反应。酶免疫组化法对于病理学家诊断肿瘤、对 其分类、判断预后产生了巨大的影响，同时也扩展了 人们对于各种疾病与肿瘤形成过程的认识，提高了病 理诊断与研究水平。
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免疫酶学技术还包括碱性磷酸酶-抗碱性磷酸 酶(APA-AP)系统[2] 及葡萄糖氧化酶─抗葡萄糖氧化 酶（GAG)系统等，这些技术与PAP技术相似，只 不过是将碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶代替辣根过 氧化物酶而已，据称这两种技术可以减少背景染 色的干扰，因为相应的内源性酶在组织中分布有 限，尤其是APA -AP技术更适用于血液标本染色。
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但在外科病理学中并未得到推广，主要是由于该方 法需要新鲜组织作冰冻切片，并只能获得较少的形态学 特征，这对于传统的根据细胞形态学的特征，有时甚至 是极细微的表现来识别细胞和诊断肿瘤的外科病理学家 来说无疑是一大障碍。尽管荧光抗体技术并未在肿瘤研 究中得到广泛应用，但由于其简便而快速的特点，在肾 小球肾炎、皮肤病的研究中仍发挥着重要的作用。
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生物素是一种低分子量的维生素，可以与一抗 共价结合。亲合素是一种从卵白素中提取的具有4 个生物素结合位点的糖蛋白，这一特性能使之成为 多级免疫酶学系统各成分之间的桥接物。1981年Hsu 等人建立了卵白素-生物素-过氧化物酶(AvidiN BiotiNperoxidase Complex ABC)系统。该方法是通过生物素 相关的次级抗体将一抗连接到卵白素-生物素-过氧 化物酶复合物上，结果产生的复合物是一种点阵样、 三维构造的复合物，有助于将多个辣根过氧化物酶 分子结合于切片中的一个抗原所在的位点上，因此 比PAP法更灵敏，约比PAP法敏感8-40倍，特异性强、 非特异性背景着色低、方法简便、应用广。
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ABC系统通过将链球菌抗生物素蛋白代替抗生物 素蛋白而得到进一步改进，称为链球菌抗生物素蛋白 -生物素系统(StreptavidiN biotiN system SAB)。链球菌抗 生物素蛋白在生理PH环境中为电中性，而不产生非特 异性结合，而抗生物素蛋白在生理PH环境中带正电荷。 应用抗生物素蛋白-生物素法时，内源性生物素能与 抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物直接结合而产生非 特异性或称假阳性染色，避免的方法可先通过切片与 游离抗生物素蛋白反应以去除游离生物素。
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葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal proteiN A SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种 蛋白成分， 单链多肽，分子量为42000， SPA最大的特点是能与不同种属血清中免 疫球蛋白分子稳定FC段结合，此外还能 与其它物质如荧光素、过氧化物酶、铁
蛋白、胶体金等结合，并不影响其生物
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由于免疫酶学技术普遍使用辣根过氧化物酶， 因此组织切片中内源性过氧化物酶一开始就必须用 H2O2或H2O2和甲醇组成的混合物加以灭活，并通过 与桥抗同一种属来源的非免疫稀释血清阻断非特异 性结合，足够的桥抗使所有游离抗原结合位点都能 与PAP复合物连接，并在加入PAP可溶性复合物到组 织切片中反应之前洗去未结合的桥抗，最后使PAP 复合物与底物及显色剂反应， 以产生能被普通光镜 所见到的不溶性棕色产物，以此识别组织切片中抗 原所在的位置。
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一、 免疫组化技术
利用能与特异性抗体结合的酶，在酶-抗体-抗原反 应的位点上诱导通过底物或显色剂而完成的变色 反应。辣根过氧化物酶是免疫酶学的原型，其它 酶系统如葡萄糖氧化酶，碱性磷酸酶也被成功应 用。
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酶桥法：
利用酶联抗体将酶与组织切片中抗原相结合，通 过与适当底物反应（通常是H2O2）以及二氨基联苯胺 (diamiNobeNzidiNe DAB)的显色剂，产生一种不溶性棕 色反应产物。该法已被进一步改进发展为更敏感的 多级桥联法，后者利于增加在抗原部位反应产物的 沉积。
免疫组化技术在病42年BeNNeftt首先提出了“组织学”，同时virchow作 了大量正常和病理组织显微镜研究，于1856年发表了“细 胞病理学”。百余年来组织病理学进展很快，但在应用 和解释形态学标准时仍有困难，单靠组织切片检查有时 并不能作出全面的诊断，随之发展了特殊染色和各种组 化技术，为病理诊断提供了新的参考依据。1941年由cooN 等建立的荧光抗体在组织切片中检测细胞抗原的技术， 首次提供了一种根据细胞抗原及细胞产物来识别细胞的 手段，这种手段在病理的某些领域，尤其是肾脏病、皮 肤病的研究中取得了非常大的成功。