拮抗型抗hTNF-α单克隆抗体的筛选和活性鉴定

人用单克隆抗体制品生产及检定考虑要点（FDA，CBER，1994）前言生物制品评价和研究中心（CBER）正在修订1987年的“人用单克隆抗体的生产和检定考虑要点（PTC）”。

该最新修订本的目的是向开发单克隆抗体制品的发起人和研究人员提供帮助，包括研究性新药（IND）和产品许可证申请时应提交的资料。

此文件取代了1987年的文件，并反映了在多次国内、国际会议上讨论过的值得重视的经验，这些会议包括：1．FDA疫苗和相关生物制品咨委会于1990年8月召开的“生物制品潜在逆转录病毒污染”讨论会。

2．由国际生物标准化学会（IABS）发起并于1990年11月在伦敦召开的“生物制品安全性的病毒学方面会议”。

3．由FDA、IABS、NIH、国家疫苗规划办公室、HHS和WHO发起，于1991年3月在Bethesda召开的“传代细胞系当前所面临的问题”的国际性会议。

4．由FDA和NIH联合发起，于1992年1月在Bethesda召开的”单克隆抗体的临床前安全性试验工作会议”。

单克隆抗体和其他生物制品一样都有可供参考的法规（21 CFR部分200～299和600～680）。

与CBER制定的其他考虑要点一样，单克隆抗体考虑要点亦不试图包容所有问题。

当特殊制品产生特殊的未包括在“考虑要点”中的问题时，则应根据具体情况进行评估。

本文及相应的法规本对生产和生产设施进行讨论，发起人应与治疗药物研究和评审办公室及生产企业许可证发放和产品监督办公室磋商。

某些单克隆抗体可由CDER负责主要审查工作，或由CDRH与CBER联合复审，各中心的管辖权依据1991年10月CBER和CDER及CBER和CDRH的内部协议执行。

本考虑要点适合于按此协议联合复审的单克隆抗体。

主档案在研究性新药申请初始阶段不需要全部完成本文中讨论的所有资料，而应在临床开发阶段，由适当的中心以对话方式指导下，使资料不断完善。

在某些情况下，在同一设施内以相同的方法制备及检定的单克隆抗体时，资料应归于单一主档案（Master File）中。

单克隆抗体制备过程中筛选杂交瘤细胞的原理和方法单克隆抗体制备过程中，有两次筛选过程，第一次是选出杂交瘤细胞(用选择培养基）,第二次是进一步选出能产生我们需要的抗体的杂交瘤细胞.第一次筛选的原理和方法：细胞融合后,杂交瘤细胞的选择性培养是第一次筛选的关键。

普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中家次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。

其一居室细胞中的DNA合成油两条途径：一条途径是生物合成途径(“D途径”)，即由氨基酸及其其他小分子化合物合成氨基酸，为DNA分子的合成提供原料。

再此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基蝶呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的D途径。

另一条途径是应急途径（“S途径”），她是利用次黄嘌呤——鸟嘌呤磷酸核苷转移酶和胸腺嘧啶核苷激酶催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。

因此，在HAT培养液中，未融合的效应B 细胞核两个效应B细胞融合的D途径被氨基蝶呤阻断,随S途径正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10天左右会死亡。

对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶缺陷型细胞,因此自身没有S途径，且D途径又被氨基蝶呤阻断，所有在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡.只有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的S途径，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性,因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖.第二次筛选的原理和方法：在单克隆抗体的生产过程中,由于效应B细胞的特异性是不同的，经HAT培养液第一次筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体存在差异，必须对杂交瘤细胞进行第二次筛选，选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。

二次筛选通常采用有限稀释克隆细胞的方法，将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔的细胞培养板上，是每孔细胞不超过一个，通过培养让其增殖，然后检测各孔上清液中的细胞分泌的抗体，上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。

抗人甲胎蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测技术的建立孙一帆;杨全利;黄建芳;赵凤芝;向军俭【摘要】目的：制备、筛选多株具有商用价值的可配对的高特异性、高亲和力的抗人甲胎蛋白（hAFP）单克隆抗体，初步建立双抗体夹心 ELISA 检测方法。

方法通过经典的淋巴细胞杂交瘤技术筛选分泌抗 hAFP单抗的杂交瘤细胞株；对筛选所得单抗的特性进行鉴定分析；双抗体夹心 ELISA 法筛选最佳配对抗体；初步建立DAS-ELISA 检测方法并检测血样，绘制其标准检测曲线并与进口试剂盒比较。

结果共获得12株稳定分泌抗 hAFP 单抗的杂交瘤细胞株，其中 Ab 1~Ab 55株单抗的腹水效价均高于600万， Ab 5的效价高达3000万；特异性鉴定结果表明Ab 1~Ab 5均能够特异识别天然 hAFP 分子，但 Ab 5与人血清白蛋白（HSA）存在较强交叉反应；抗体配对实验共筛选出5对（Ab 1/HRP-Ab 2、Ab 1/HRP-Ab 4、Ab 3/HRP-Ab 2、Ab 3/HRP-Ab 4和 Ab 4/HRP-Ab 1）能够满足 hAFP 检测要求且无交叉反应的配对抗体，最终确定 Ab 1+ Ab 3/HRP-Ab 2和 Ab1+Ab 3/HRP-Ab 4为最佳配对组合；利用最佳配对抗体组合建立标准检测曲线，其线性检测范围为5~250 ng/ml，最低检测限2 ng/ml，检测上限400 ng/ml，优于进口试剂盒的线性范围5~200 ng/ml 和最低检测限5 ng/ml；样检结果显示自制试剂盒的阳性血清检测准确率99.2%（119/120例），阴性血清准确率100%（40/40例）。

结论筛选获得的4株高亲和力、高特异性抗 hAFP 单抗均可应用于 DAS-ELISA 试剂盒的研制，Ab 1和 Ab 3适合作为捕获抗体，Ab 2和 Ab 4适合作检测抗体；自制试剂盒的线性检测范围和最低检测限均优于进口试剂盒，表明具有商用价值。

2024北京昌平高三（上）期末生物2024.1本试卷共10页，100分。

考试时长90分钟。

考生务必将答案答在答题卡上，在试卷上作答无效。

考试结束后，将答题卡交回。

第一部分选择题（每小题2分，共30分）下列各题均有四个选项，其中只有一个是符合题意要求的。

1. 在高中生物学实验中，关于酒精使用不正确的是（）A. 脂肪鉴定时滴加酒精以利于苏丹Ⅲ染色B. 无水乙醇可用于提取叶绿体中的色素C. 观察植物细胞有丝分裂需用盐酸与酒精的混合液解离D. 采集的土壤小动物可放入70%的酒精溶液中保存2. 盐碱地中含大量的NaCl、Na2CO3等钠盐，会威胁海水稻的生存。

同时一些病原菌也会感染水稻植株，影响正常生长。

下图为海水稻抵抗逆境的生理过程示意图，相关叙述不正确的是（）A. H2O可以通过自由扩散和协助扩散两种方式进入海水稻细胞B. 海水稻细胞通过胞吐方式分泌抗菌蛋白抵御病原菌的侵染C. 液泡逆浓度梯度吸收Na+增大细胞液的浓度以适应高浓度环境D. H+以协助扩散的方式从细胞质基质运入液泡或运出细胞3. 下图为ATP合成酶功能示意图，相关叙述不正确的是（）A. A TP合成酶在核糖体上合成B. A TP合成酶发挥功能不依赖生物膜C. A TP合成酶具有催化和运输的作用D. 合成ATP的过程伴随着能量的转化4. 生态系统的碳通量与该生态系统的净生产力（吸收并储存CO2的能力）相关，数值越小说明净生产力越强。

某农田的碳通量随玉米生长时间变化情况如下图。

相关叙述中正确的是（）A. 140天时玉米的光合作用强度大于呼吸作用强度B. 150天后碳通量变化原因是玉米叶面积迅速增加C. 210天后碳通量变化原因是玉米开花结果D. 玉米生长季碳通量变化受当地气候变化的影响5. 团头鲂（♀，2n=48）和翘嘴鲌（♂，2n=48）进行属间杂交，两个物种的杂交后代可育。

下图为F1鲂鲌的精原细胞减数分裂Ⅰ中期的显微图像，相关叙述错误的是（）A. 此细胞前期发生染色体联会B. 此细胞含有姐妹染色单体C. 此细胞含有96条染色体D. 两个物种没有生殖隔离6. 同义密码子指共同编码一种氨基酸的密码子，基因对同义密码子的使用存在偏好性，即优先使用其中一些密码子。