太子参不定根组织培养的研究

太子参不定根组织培养的研究[摘要] 目的：对太子参不定根的培养条件进行系统的优化。

方法：利用组织培养技术结合紫外分光光度法，考察了接种量、蔗糖浓度、无机盐浓度、培养天数、逐级扩大培养以及不同角度鼓泡式反应器对太子参不定根生长的影响，并对不定根中皂苷、多糖和氨基酸等成分进行含量测定。

结果：每1 l培养基接种的不定根鲜重为6 g时，太子参不定根的干重增殖倍数达到最大值；随着蔗糖浓度的升高，太子参不定根干重增殖倍数呈先升高后降低的趋势；培养基中的无机盐浓度对不定根的生长有较大影响，3/4 ms最有利于不定根的生长；太子参生长呈“s”型曲线，在第28天生物量达到最大。

结论：接种量、蔗糖浓度、无机盐浓度、逐级扩大培养以及反应器角度都会显著影响太子参不定根的生长，不定根中的皂苷和氨基酸含量高于栽培的太子参，而多糖含量低于栽培的太子参。

[关键词] 太子参；不定根；接种量；蔗糖浓度；盐浓度；生长曲线；逐级扩大培养；成分含量[稿件编号] 20121010007[基金项目] 国家“十一五”科技支撑计划专项（2006bai06a16-02）[通信作者] *高文远，tel/fax：（022）87401895，e-mail：pharmgao@ 太子参pseudostellaria heterophylla （miq.） pax为石竹科植物，又名孩儿参、童参，其块根含有皂苷、多糖、氨基酸等活性物质。

其性味甘、微苦，平，归脾、肺经。

具有益气健脾，生津润肺的功能，主要用于脾虚体倦，食欲不振，病后虚弱，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳[1]。

现代药理研究表明其有抗疲劳、抗应激作用，并有促进免疫作用及延长寿命之功能[2]，其中太子参皂苷还具有抗病毒作用[3]。

目前利用植物组织培养技术进行中药资源繁殖，并大规模生产其有效成分已越来越受到人们的重视，但药用植物细胞培养的弊端之一是有效成分的含量不稳定，这主要是由于大多数有效成分均为次生代谢产物，其在细胞阶段合成表现不强，而不定根组织培养技术可以解决这一问题[4]。

目前太子参愈伤和悬浮细胞培养已经有学者进行了研究[5]，而太子参不定根培养迄今为止还没有相关报道，本实验旨在利用组织培养技术快速获得太子参的不定根，为进一步大规模生产其有效成分建立技术平台。

1 材料hpg-280b光照培养箱（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；hny-82型摇床（天津市欧诺仪器仪表有限公司）；mettler toledo delta 320 ph 计（上海梅特勒-托利多仪器公司）；sp-2000 uv型紫外-可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）。

太子参经天津大学高文远教授鉴定为太子参p. heterophylla；人参皂苷rb1对照品（批号110704-200420，中国食品药品检定研究院）。

2 方法2.1 接种量对太子参不定根生长的影响将太子参不定根接入装有100 ml ms液体培养基（含3.0mg·l-1iba，0.5 mg·l-1kt和0.1 mg·l-1 naa）的250 ml三角瓶内，接种量分别为2，4，6，8，10 g·l-1。

灭菌前培养基ph 6.0，摇床转速120 r·min-1，生长周期28 d，每组重复3瓶。

2.2 蔗糖质量浓度对太子参不定根生长的影响将约0.6 g（鲜重）太子参不定根接种到蔗糖质量浓度分别为30，40，50，60 g·l-1的100 ml ms培养基（含3.0 mg·l-1iba，0.5 mg·l-1kt和0.1 mg·l-1 naa）中，灭菌前培养基ph 6.0，摇床转速120 r·min-1，生长周期28 d，每组重复处理3瓶。

2.3 盐浓度对太子参不定根生长的影响将约0.6 g（鲜重）太子参不定根接种到无机盐浓度分别为1/2，3/4，1，3/2 ms的100 ml ms培养基（含3.0 mg·l-1iba，0.5 mg·l-1kt 和0.1 mg·l-1 naa）中，灭菌前培养基ph 6.0，摇床转速120 r·min-1，生长周期28 d，每组重复处理3瓶。

2.4 摇瓶培养中太子参不定根生长曲线的考察将太子参不定根接入100 ml ms培养基（含3.0 mg·l-1iba，0.5 mg·l-1kt和0.1 mg·l-1 naa），接种量6 g·l-1，在太子参不定根整个培养周期中，分别于第0，4，8，12，16，20，24，28，32 d 进行取样，测定其生长量。

灭菌前培养基ph 6.0，摇床转速120r·min-1，每组重复处理3瓶。

2.5 不同角度的反应器对太子参不定根生长的影响将太子参不定根接种至锥角角度分别为60°，90°，120°，180°的3 l鼓泡式反应器中，附加2 l ms液体培养基（含3.0 mg·l-1iba，0.5 mg·l-1kt和0.1 mg·l-1 naa），通气量 0.3（空气体积/培养体积/min），培养温度20 ℃，生长周期28 d，测定生物量。

2.6 逐级扩大培养对太子参不定根生长的影响将太子参不定根分别接种至250 ml三角瓶（100 ml液体培养基）、500 ml三角瓶（200 ml液体培养基）、1 000 ml三角瓶（400 ml液体培养基）摇瓶中和3 l鼓泡式反应器（2 l液体培养基）、5 l 鼓泡式反应器（3 l液体培养基）中，容器内装有ms液体培养基（含3.0 mg·l-1 iba，0.5 mg·l-1 kt和0.1 mg·l-1naa），接种量 0.1%，培养28 d后统计不定根生物量。

2.7 不定根生物量的测定将培养得到的太子参不定根取出，用滤纸吸取表面的培养基，置于天平进行称重即为鲜重。

将称过鲜重的不定根置于烘箱中，在60 ℃下烘24 h，使其干燥至恒重，称其干重，并计算其干重增殖倍数。

干重增殖倍数=（收获不定根干重-接种不定根干重）/接种不定根干重。

2.8 太子参不定根及药材多糖、氨基酸和皂苷活性成分含量测定2.8.1 太子参不定根及药材多糖含量测定分别称取0.2 g干燥粉碎的太子参不定根和药材粉末，置于100 ml具塞三角瓶中，加20 ml 80%乙醇，90 ℃水浴回流1 h，重复1次，趁热抽滤，滤渣用热80%乙醇洗涤。

挥干溶剂后，滤渣连同滤纸置于烧瓶中，加20 ml蒸馏水，100 ℃水浴浸提1 h，趁热过滤，滤渣重复提取1次，合并滤液，离心分离，上清液置于100 ml量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。

参考文献[7]，在480 nm波长下测定吸光度，得到回归方程y=0.006 4x+0.111 4，r2=0.996 5，在10～90 mg·l-1线性关系良好。

多糖质量分数=供试液中太子参多糖质量浓度×多糖稀释因素/ 供试品质量。

2.8.2 太子参不定根及药材氨基酸含量测定分别取太子参不定根和药材0.05 g，加入70%乙醇50 ml，称重，进行超声提取1 h，放冷，补足失重。

分别取甘氨酸2，2.5，3.0，3.5，4.0 ml于25 ml 量瓶中定容，分别取1 ml置于10 ml离心管，依次加磷酸盐缓冲液1 ml，茚三酮溶液1 ml，蒸馏水1 ml，置于沸水浴中加热15 min，取出放冷后在570 nm处测其吸光度，得到回归方程y=10.26x-0.086 8，r2=0.990 8（0.04～0.08 g·l-1）。

分别取样品溶液1 ml，依照上述方法，测其吸光度。

由回归方程计算供试液中氨基酸浓度，太子参氨基酸产量：氨基酸质量分数=供试液中太子参氨基酸质量浓度×氨基酸的稀释因素/供试品质量。

2.8.3 太子参不定根及药材皂苷含量测定称取太子参药材及不定根细粉2.0 g，加10倍量的水后，超声提取30 min，提取2次，提取液浓缩至一定体积，趁热于搅拌下缓慢加入乙醇至含醇量达到70%，静置过夜，抽滤，滤液减压回收乙醇，以30 ml蒸馏水溶解残渣，以60 ml水饱和正丁醇分3次进行萃取，萃取液合并后再以50 ml正丁醇饱和的蒸馏水洗涤1次，正丁醇减压回收，残渣以甲醇溶解并定容至10 ml，即得总皂苷溶液。

称取人参皂苷rb1对照品5.0 mg，置于25 ml量瓶内，加甲醇溶解配成0.2 g·l-1的对照品溶液。

精密吸取对照品溶液400，800，1 000，1 200，1 400，1 600 μl，分别置于具塞试管中，用水浴挥干溶剂，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 ml，高氯酸0.8 ml，混匀，密塞。

于60 ℃水浴中加热15 min后立即流水冷却，加冰醋酸5 ml，摇匀，在560 nm处测定吸收度，得到回归方程y=0.955 7x-0.018 4 ，r2=0.999 7（0.08～0.28 mg），太子参总皂苷产量：皂苷质量分数=供试液中太子参皂苷质量浓度×皂苷的稀释因素/供试品质量。

2.9 统计分析利用spss 11.3软件进行统计学处理，数据以±s表示。

3 结果3.1 接种量对太子参不定根生长的影响考察了不同接种量下太子参不定根的生长情况，接种量在2～10 g·l-1时对太子参不定根生长的影响，见图1。

结果表明，当不定根接种量为6 g·l-1时，太子参不定根的生物量达最大值；接种量过小或过大时均不利于不定根的生长。

实验发现，接种量过小（10g·l-1），接种的不定根褐化现象较为严重，不利于不定根的生长。

因此选择6 g·l-1的接种量进行继代和实验。

图1 接种量对太子参不定根生长的影响fig.1 effects of inoculum on pseudostellaria heterophylla adventitious roots growth3.2 蔗糖质量浓度对太子参不定根生长的影响考察了30，40，50，60 g·l-14个蔗糖质量浓度对太子参不定根生长的影响，见表1。

培养基中的蔗糖质量浓度对太子参不定根的生长有很大影响，蔗糖质量浓度为40 g·l-1时太子参不定根的生长状态最好，其干重增长倍数最大；当蔗糖质量浓度比较低时，太子参不定根的生长状态不佳；而过高浓度的蔗糖对不定根的生长有一定的抑制作用。

3.3 盐浓度对太子参不定根生长的影响考察了1/2，3/4，1，3/2 ms 4个无机盐浓度对太子参不定根生长的影响，见表2。