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#论著#文章编号:1007-8738(2009)02-0150-05Daudi 细胞系特异性Fab 噬菌体抗体库的构建、筛选与初步鉴定申咏梅1,2*,杨晓春3,董宁征4,白 霞4(苏州大学附属第二医院:1放免中心,2检验教研室,3磁共振室,江苏苏州215004;4江苏省血液研究所,苏州大学附属第一医院,江苏苏州215006)收稿日期:2008-06-30; 接受日期:2008-09-08基金项目:国家自然科学基金资助项目(30400111);江苏省自然科学基金资助项目(BK2004041)作者简介:申咏梅(1969-),女,重庆人,副教授,医学博士Te:l 0512-********;E-m ai:l szs y m@yahoo .co *Corres pond i ng authorG enerati on ,screeni ng and prelim i naryi dentification of specific Fab phage an -ti body li brary agai nst D audi cell strai nSHE N Yong-m ei 1,2*,YANG X iao -chun 3,DONG N ing-zheng 4,BAI X ia41R adi o i m munoassay Cente r ,2D epart m ent of C linical L abo rato ry ,3D epart m ent o f M agnetic R esonance ,Second A ffiliated H osp ita,lSoocho w U niversity ,Suzhou 215004;4Ji ang su Institutie o fH em a -to l ogy ,F irst A ffiliated H ospita ,lSoochow U n i ve rsity ,Suzhou215006,Ch i na[Abstract] A I M:To gene ra t e and screen the specificFab p hage an ti b ody library aga inst human Daud i ce ll stra in in B-ly mphoma and i d en tify t he positive c l o nes .M ETH-OD S :BA LB /c m ice we re m i mun ized w it h Daud i ce lls ,and an tisera we re titra ted by EL I SA .Fo llo w ing t he demonstra -tion o f su fficien t an tibody tit e r ,to t a l RNA was extract ed from sp l e n ic ly mphocytes o f the m i m unized m i c e and RT -PCR w as used to am p lify J ligh t cha in and Fd fragmen ts o f heavy chain .A ft e r re strictive d igestion w ith S a c I/Xba I and X ho I/S pe ,I the J ligh t cha in and the Fd fragm ents were succes -sive ly inse rt ed in t o the p hagem id vector pComb 3H -SS and then e l e ctropo ra t ed in t o E.co li XL 1-B l u e .The spe cific Fab phage antibody li b ra ry aga inst Daud i ce ll stra i n in hu man B-l y m pho m a was constructed by in f ec tion o f he l p e r phage VC -SM 13.Fo llo w ing six rounds of b iopanning w ith Daud i ce lls ,the antigen b inding acti v ities o f rando m clone s we re t ested by EL I S A to se lect the positive c l o nes ,wh ich we re further DNA sequenced ,expre ssed i n E.co li X L 1-B lue and i d en t -i fi e d byW estern b lo.t RE SULTS :The Fab phage an tibody l -i b ra ry w it h 3.13@107size was construct ed and f our positive c lones wh ich spec ifica lly recogn ized Daudi ce ll stra in w ere -i so l a t ed .In am i n o ac i d seq uences ,the var i a b le heavy do -m ains (V H )we re found to be 80%-94%and va riab l e ligh tdom a i n s (V L )88%-95%homo logous w ith respective m u -r i n e ge r m line genes in GenBank .Fu rthe r mo re ,so lub l e Fab antibod ies o f t he po sitive clone s we re successfu ll y ex -p ressed in E.c o l i XL 1-B l u e and t he reactivity w ith t he memb rane p ro t e ins o f Daud i ce lls wa s demonstra t ed by W estern b l o .t CONCLUSI ON :Fab phage an ti b ody library is succe ssfu lly constructed and specific an tibod ies aga instmemb rane antigens in Daud i ce lls are ob ta ined ,wh ich pro -vides an expe rm i en t a l f ounda tion for the further i n ve stiga tion o f B -ly m phoma m i munotherapy .[K ey w ords]B-ly mphoma ;Fab ;Phage anti b ody li b ra ry ;Daud i ce ll stra i n ;pComb 3H -SS vector[摘要] 目的:构建针对B 细胞淋巴瘤D aud i 细胞系噬菌体抗体库,从中筛选特异性抗体,并对所筛选出的阳性克隆进行鉴定。
人抗体Fab段天然抗体库的建立作者：韦晓明, 苏明权杨安钢, 温伟红, 郝晓柯【摘要】目的: 提取健康人外周血淋巴细胞的mRNA, 利用反转录PCR方法, 建立一个大容量的人抗体Fab段的天然抗体库。
方法: 收集健康者外周血, 提取淋巴细胞, 以淋巴细胞mRNA为模板, 扩增人抗体Fab段, 连入载体pComb3内, 利用电转化的方法, 构建噬菌体抗体库。
结果: 最终建立了重链库为1.73×107, 轻链库为8.52×104的天然抗体库, 并利用酶切鉴定计算出实际库容为重链库 1.21×107, 轻链库4.26×104, 所以理论上所建天然噬菌体抗体库总的库容量可以达到5.15×1011。
结论: 成功构建了一个大容量的完全人源化的天然抗体库。
【关键词】天然抗体库; Fab; 反转录PCR自1975年单克隆抗体(mAb)问世以来［1］, mAb已广泛应用于临床疾病的诊断、防治及基础理论研究等领域, 取得了令人鼓舞的结果。
但鼠源性抗体用于人体防治会产生人抗鼠抗体（human anti mouse antibody, HAMA）, 它不仅使治疗用mAb迅速失去效用, 而且会引起过敏反应。
为此这些年来, 人们一直致力于鼠源mAb的人源化的工作。
噬菌体抗体库是近十几年来发展的一种新的技术［2, 3］, 它使mAb的应用得到了进一步的推广, 而且被广泛应用于mAb人源化, 抗体亲和力提高等技术中。
本研究中我们使用电转化的方法建立了大容量的人抗体Fab段天然抗体库, 从而为进一步的抗体人源化工作打下良好的基础。
1 材料和方法1.1 材料淋巴细胞分离液购自TBD生物技术中心; TRIzol reagent、反转录试剂盒购自Promega公司; DEPC购自Sigma公司; 引物合成由大连宝生物公司合成; mRNA纯化试剂盒、 Taq DNA聚合酶购自Invitrogen; DNA凝胶纯化试剂盒购自上海华舜公司; 蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司; E.coli XL1Blue菌株为本室保存; 载体pCOMB3由杨洁硕士馈赠。
二结果与分析（一）总ＲＮＡ的提取提取人外周血淋巴细胞总ＥＮＡ，经１％琼脂糖凝胶电泳后可见２８Ｓ和１８Ｓ两条清晰条带（图４），表明提取的总Ｐ，ＮＡ完整性较好，可作为模板进行转录。
图４淋巴细胞提取总ＲＮＡＦｉｇ．４日ｅ曲ｏｐｈｏｒｅ５ｉｓｏｆｔｏｔａｌＲＮＡ白ｏｍｌｙｍｐｈｏｃｙｔｃｓＭ：ＤＬＭａｒｋｅｒ（ＤＬ２０００）（二）ＰＣＲ扩增重链（Ｆｄ）和轻链（、＿，ＣＬ）基因以ｃＤＮＡ第一链为模板，以轻链和重链Ｆｄ段特异性引物的不同组合进行ＰＣＲ扩增轻链基因和Ｆｄ，１％琼脂糖凝胶上电泳显示，纯化的轻链和Ｆｄ段扩增产物于７００ｂｐ左右处可见较亮的特异性条带（图５，６）。
图５纯化的轻链基因ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．５ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔｃｈａｉｎＭ：ＤＬＭａｒｋｅｒｆＤ屯２０００）Ｌｉ∞ｌ－７：Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ±７００ｂｐｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄ圈６纯化的重链侧）基因ＰＣＲ扩增产物Ｆｉｇ．６ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｄｆｓａｇｍｅｎｔＭ：ＤＬＭａｌｋｅｒ（ＤＬ２０００、Ｌｉｎｅｌ－８：Ｐｒｏｄｕｃｔｏｆ士７０曲ｐｉｓｅｘｐｅｃｔｅｄ（三）噬粒ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ的鉴定自转化了ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ的大肠杆菌ＸＬｌ－Ｂｌｕｅ中提取质粒，以ＳｐｅＩ和ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ和Ｓａｃｌ分别双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳显示分别释放出３００ｂｐ和１２００ｂｐ外源片断（图７）。
圈７提取的噬粒ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ醇切电泳Ｆｉｇ．７ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｍｉｓｏｆｐＣｏｍｂ３ＸＳＳｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍ轧１－ＢｌｕｅＭＩ：ＤＬＭａｒｋｅｔ（ＤＬｌ５０００）Ｍ２：ＤＬＭａｚｋｃｒ（ＤＥ２０００）Ｌｉｎｅｌ－３：Ｄｏｕｂｌｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＳａｃＩａｎｄＸｂａＩＩＪｎｅ４－６：Ｄｏｕｂｌｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＳｐｃＩａｎｄＸｈｏＩ（四）轻链插入的鉴定随机挑取ＬＢ—Ａ（Ａｍｐｌ００／“ｇ／ｍ１）平板上１０个转化菌落，分别提取质粒后以ＸｂａＩ和Ｓａｄ双酶切，１％琼脂糖凝胶电泳显示，其中８个释放出７００ｂｐ左右的片段（图８），即相应质粒中有轻链基因片段，插入率为８０％。
生物技术制药复习知识点第一章绪论1.生物制药的研究内容包括基因工程制药, 细胞工程制药, 酶工程制药和发酵工程制药。
2.生物技术制药, 是采用现代生物技术人为地创造一些条件, 借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
3.生物技术药物, 是采用DNA 重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。
4.生物药物, 指包括生物制品在内的生物体的初级和次级代谢产物或生物体的某一组成部分, 甚至整个生物体用作诊断和治疗的医药品。
5.现代生物药物四种类型: ①应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂。
②基因药物, 如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。
③来自动植物和微生物的天然生物药物。
④合成与部分合成的生物药物。
6.生物药物按功能用途分为三类: 治疗药物, 预防药物和诊断药物。
7.生物技术药物的特性：分子结构复杂, 具种属特异性, 治疗针对性强、疗效高, 稳定性差, 基因稳定性, 免疫原性、重复给药会产生抗体, 体内半衰期短, 受体效应, 多效性和网络效应, 质量控制的特殊性, 生产系统的复杂性。
8.生物技术制药特征：高技术, 高投入, 长周期, 高风险, 高收益。
9.基因诊断: 指采用分子生物学的方法在DNA水平或RNA水平对基因的结构和功能进行分析从而对特定的疾病进行诊断。
第二章基因工程制药1.利用基因工程技术生产药品的优点: （1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等）, 为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质, 以便对其生理、生化和结构进行深入的研究, 从而扩大这些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处, 可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物, 扩大药物筛选来源。
Rh抗原Fab抗体库的构建与筛选作者：陈琦, 张嘉敏, 张海燕, 朱自严, 李厚达【摘要】目的: 构建抗体库并筛选Rh抗原的Fab抗体。
方法: 收集5份血清中抗Rh抗体效价在1∶256～512的人淋巴细胞, 提取RNA, 用多对引物PCR扩增VH、 Vκ、 Vλ基因, 并分别从pComb3xTT和pComb3xλ噬粒中扩增CH1、 Cκ、 Cλ, 通过重叠PCR, 构建重链Fd 基因及完整的kappa、 Lamda轻链, 并进一步重叠PCR, 获得Fab抗体片段。
Fab经酶切、连接并电转化到噬菌体抗体表达载体pComb3xSS 中, 构建获得抗Rh的Fab抗体库, 经4轮Rh(-)/ Rh(+)红细胞阴/阳淘筛, 获得的阳性克隆分别进行血凝试验、 Western blot分析及测序鉴定。
结果: 构建获得总库容为7.4×106的Fab抗体库, 并从中筛选得到1株能特异结合Rh抗原的Fab抗体。
结论: 应用基因工程抗体技术, 成功获得了1株能与Rh(+)红细胞特异凝集的Fab抗体, 为制备能用于临床的特异性强、效价高, 并具有自主知识产权的Rh抗体打下基础。
【关键词】 Rh血型; 基因工程抗体; 噬菌体抗体库; Fab [Abstract] AIM: To Construct Fab antibody against Rh antigen. METHODS: The variable regions of light and heavy chains were amplified by RT PCR from the PBMCs of volunteers with high titer (1∶256512 by inditect agglutation) antibody to Rh antigen. Meanwhile, the genes of constant regions of light and heavy chains were isolated from pComb3xTT and pComb3xλ phagmidcarrying the templates respectively. Vκ light chain and Fd heavy chain were linked by the first splicing overlapping extension PCR (SOE), and a full length Fab gene was created by the second SOE. The Fab gene was ligated to phagmid pComb3HxSS and transformed to E.coli XL1Blue by electroporation. The obtained human Fab phage antibody library was panned using Rh(-)/Rh(+) RBC four times. the phage antibodies against Rh antigen were highly enriched. Indirect agglutation test, western blot analysis and sequencing analysis were performed to detect the specificity of Fab against Rh. RESULTS: The repertoire of human phage display Fab library was 7.4×106. After panning, A Fab clone which could bind to Rh antigen specifically was obtained. CONCLUSION: A Fab antibody that specifically aggulated Rh(+) RBC is obtained, this makes it possible to produce Rh antibody with high quantity and effection in our country.[Keywords]Rh antibody; genetic engineering antibody; phage display antibody library; FabRh血型是人类29个血型系统中最复杂、最富有多态性的一种, 该血型根据红细胞表面是否有Rh抗原分为Rh(+)和Rh(-)两种。
人天然Fab噬菌体抗体库的构建的开题报告引言：细菌感染在临床上具有很高的发病率和死亡率。
抗菌素是治疗细菌感染的主要手段之一。
但是由于抗菌素的滥用和不规范使用，细菌耐药性的加剧已成为一个全球性的问题。
因此，寻找和开发新的治疗细菌感染的策略变得越来越重要。
噬菌体治疗作为一种新型的治疗细菌感染的策略已经引起了人们的广泛关注。
噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，它可以侵入并破坏细菌细胞。
噬菌体可以选择性地针对特定的细菌感染，也可以在治疗过程中避免破坏宿主人类细胞。
因此，噬菌体治疗被认为是一种安全、高效和选择性的治疗细菌感染的策略。
噬菌体抗体库可以被用来筛选能够靶向特定细菌噬菌体的免疫球蛋白，从而加速噬菌体治疗的发展。
本文将探讨如何构建一种人天然Fab噬菌体抗体库。
二、研究目的：本研究的目的是构建一种人天然Fab噬菌体抗体库，用于筛选能够靶向特定细菌噬菌体的人源抗体。
三、研究内容：1.收集人源Fab序列及相关信息：人源Fab是由人类B细胞产生的可变区域和不可变区域组成的免疫球蛋白分子。
收集人源Fab序列及相关信息，对后续的抗体库构建和筛选具有重要意义。
2.选取噬菌体为靶点：噬菌体针对细菌的特异性使其在抗菌治疗中具有独特的优势，因此选择噬菌体作为抗体库中的靶点。
3.克隆Fab基因并插入表达载体：将收集到的人源Fab序列克隆到可表达的载体中，获得免疫球蛋白的表达单元。
4.筛选出具有特异性的抗体：将构建好的抗体库进行筛选，筛选出能够特异性结合噬菌体的抗体。
四、研究意义：本研究的意义在于构建一种能够加速噬菌体治疗的方法，为寻找和开发新的治疗细菌感染的策略提供了新思路和方法。
人源性抗核抗体Fab片段抗体库的构建筛选及鉴定的开题报告一、背景人类免疫球蛋白是一种在机体免疫防御过程中起重要作用的蛋白质，主要由四个多肽链组成：两个重链和两个轻链。
重链和轻链各自有不同的区域，其中即含有可与外来抗原结合形成免疫复合物的抗原结合部位（Fab片段），也称为抗原识别部位，同时重链和轻链之间的连接区域（Fc片段）可结合多种配体，包括细胞受体、补体蛋白等。
Fab片段与抗原的结合是通过氨基酸残基，如互补决定区（CDR）等进行特异性配对，因此将其提取并经过相应筛选后可对细胞表面的分子进行高效特异性识别，被广泛应用于临床诊断、药物开发等领域。
本研究旨在构建人源性抗核抗体Fab片段抗体库，并通过鉴定、筛选，获取能与抗核抗体特异结合的Fab片段抗体，为进一步研究自身免疫性疾病等相关领域提供有力支持。
二、研究内容及方法1.构建人源性抗核抗体Fab片段抗体库本实验将以人源性抗核抗体为模板，采用RT-PCR技术将其Fab片段DNA序列克隆到质粒载体中，将质粒从E.coli菌株中提取，再经过限制酶切和琼脂糖凝胶电泳等方法进行鉴定。
最后将合格的Fab片段DNA序列基因克隆到噬菌体抗体库质粒中构建成Fab片段抗体库。
2.进行Fab片段抗体筛选将构建好的Fab片段抗体库与靶抗原结合，经过洗涤、脱离、重复上述步骤，以免疫学实验技术如ELISA、Western blot等方法进行鉴定与筛选，最终获得能够对抗核抗体进行特异性结合的Fab片段抗体。
3.鉴定和验证Fab片段抗体对筛选出来的Fab片段抗体进行功能验证，在体内和体外中都可以使用，检测目标分子的表达水平和分布情况，验证其特异性和亲和力。
三、研究意义本研究将建立人源性抗核抗体Fab片段抗体库，厘清自身免疫性疾病的发生机理，有效提高诊断准确率，为药物研发提供新的靶标和研究思路，使得人类免疫球蛋白的应用领域更加广泛。
人抗体Fab段天然抗体库的建立作者：韦晓明, 苏明权杨安钢, 温伟红, 郝晓柯
【摘要】目的: 提取健康人外周血淋巴细胞的mRNA, 利用反转录PCR方法, 建立一个大容量的人抗体Fab段的天然抗体库。
方法: 收集健康者外周血, 提取淋巴细胞, 以淋巴细胞mRNA为模板, 扩增人抗体Fab段, 连入载体pComb3内, 利用电转化的方法, 构建噬菌体抗体库。
结果: 最终建立了重链库为1.73×107, 轻链库为8.52×104的天然抗体库, 并利用酶切鉴定计算出实际库容为重链库 1.21×107, 轻链库4.26×104, 所以理论上所建天然噬菌体抗体库总的库容量可以达到5.15×1011。
结论: 成功构建了一个大容量的完全人源化的天然抗体库。
【关键词】天然抗体库; Fab; 反转录PCR
自1975年单克隆抗体(mAb)问世以来［1］, mAb已广泛应用于临床疾病的诊断、防治及基础理论研究等领域, 取得了令人鼓舞的结果。
但鼠源性抗体用于人体防治会产生人抗鼠抗体（human anti mouse antibody, HAMA）, 它不仅使治疗用mAb迅速失去效用, 而且会引起过敏反应。
为此这些年来, 人们一直致力于鼠源mAb的人源化的工作。
噬菌体抗体库是近十几年来发展的一种新的技术［2, 3］, 它
使mAb的应用得到了进一步的推广, 而且被广泛应用于mAb人源化, 抗体亲和力提高等技术中。
本研究中我们使用电转化的方法建立了大容量的人抗体Fab段天然抗体库, 从而为进一步的抗体人源化工作打下良好的基础。
1 材料和方法
1.1 材料淋巴细胞分离液购自TBD生物技术中心; TRIzol reagent、反转录试剂盒购自Promega公司; DEPC购自Sigma公司; 引物合成由大连宝生物公司合成; mRNA纯化试剂盒、 Taq DNA聚合酶购自Invitrogen; DNA凝胶纯化试剂盒购自上海华舜公司; 蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司; E.coli XL1Blue菌株为本室保存; 载体pCOMB3由杨洁硕士馈赠。
LB（蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl: 10 g/L, pH7.0）、 GYT（丙三醇100 mL/L、酵母提取物1.25 g/L、蛋白胨
2.5 g/L, pH7.0）、 SOC（蛋白胨20 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 0.5 g/L、 2.5 mmol/L KCl、 10 mmol/L MgCl2、 20 mmol/L 葡萄糖, pH7.0）等培养基为本室配置。
PCR仪购自PE公司; 电泳仪购自BIO RAD公司; 台式高速离心机购自上海安亭科学仪器厂; 高速冷冻离心机购自湖南仪表仪器总厂离心机厂; 紫外分光光度仪购自Beckman公司; BIO RAD gene pulser II 电脉冲基因转移仪购自BIO RAD公司。
引物设计［2］: Fd5′引物: 5′SAG GTG CAG CTC GAG SAG TCT GGG3′; 5′SAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG3′。
Fd3′引物: 5′GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG3′; 5′CTC GAC ACT AGT TTT GCG CTC AAC TGT CTT 3′; 5′TGT GTG ACT AGT GTC ACC AAG TGG GGT TTT3′; 5′GCA TGA ACT AGT TGG GGG ACC ATA TTT GGA3′。
κ链5′引物: 5′GAM ATY GAG CTC ACS CAG TCT CCA3′。
κ链3′引物: 5′GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCA AG3′; 5′GCG CCG TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG ATC TCA G3′。
λ链5′端引物: 5′CAS TYT GAG CTC ACK CAR CCG CCC TC3′。
λ链3′端引物: 5′GAG GGA TCT AGA TTA TGA ACA TTC TGT AGG3′。
S=C or G; M=C or A; Y=C or T; K=G or T; R=A or G。
1.2 方法
1.2.1 淋巴细胞分离 2 300名志愿者（2003/2004年本院健康体检者）抽取外周血1 150 mL, 与淋巴细胞分离液以1∶1的比例混合, 离心分离中层淋巴细胞。
1.2.2 RNA提取使用1010细胞/L TRIzol比例裂解淋巴细胞, 提取总RNA。
然后根据mRNA纯化试剂盒提供的方法从中提取mRNA。
