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学生综述性论文题目：发酵过程中染菌的分析、检测及预防姓名：刘莉学号：2008132114专业：生物技术班级：083班课程名称：微生物工程指导教师：燕平梅课程学期：2010至2011学年第一学期发酵过程中染菌的分析、检测及预防姓名：刘莉指导老师：燕平梅（太原师范学院生物系083班学号：2008132114）摘要：通过分析发酵过程中染菌的各种原因，总结检测染菌的方法，并提出染菌后应采取哪些措施及预防染菌的方法。
关键词：发酵；染菌；危害；检查；预防前言：发酵工业生产中，污染杂菌造成发酵失败的事故时常发生，严重影响发酵生产，关于发酵过程是否污染杂菌，如何检测，染了菌后如何处理等等，这些问题的研究是十分有意义的。
内容：1发酵染菌的危害1.1不同种类的杂菌对发酵的影响青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大1.2不同染菌时间对发酵的影响1.2.1种子培养期染菌菌体浓度低、培养基营养丰富1.2.2发酵前期染菌杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成1.2.3发酵中期染菌严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成1.2.4发酵后期染菌如杂菌量不大，可继续发酵。
如污染严重，可采取措施提前放罐1.3不同染菌途径对发酵的影响种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有延续性空气带菌：空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有延续性设备渗漏：这种途径造成染菌的危害性较大1.4染菌对产物提取和产品质量的影响1.4.1对过滤的影响发酵液的粘度加大；菌体大多自溶；由于发酵不彻底，基质的残留浓度加度。
造成过滤时间拉长，影响设备的周转使用，破坏生产平衡；大幅度降低过滤收率。
发酵过程中噬菌体感染问题1 噬菌体噬菌体是侵染细菌的微生物病毒，广泛分布于自然界中。
在生产中见到的噬菌体为蝌蚪形，直径约0.1um，其形态在显微镜下看不见，通过电子显微镜放大9×104倍后才能看见。
故在生产中平时对噬菌体看不见摸不着，无形之中增加了对其了解和预防的难度。
2 噬菌体的主要特性2.1专一的寄生性。
噬菌体只能在专一的宿主细胞中生长繁殖，只能在活的、处于繁殖阶段的细胞中生长繁殖，不能脱离宿生而自行生长繁殖。
如果不同菌株的亲缘关系比较近，那么此菌株也是会感染的，特别是针对长期生产同一产品的发酵工厂要特别注意，在换新菌株之前必须了解其背景。
2.2不耐热性。
游离的噬菌体在45℃条件下10min就可使其失活。
2.3不耐药性。
直接在噬菌体上喷洒1%新洁尔灭、75%酒精、1%双氧水、5%的甲醛等都可使其失活。
3 感染噬菌体后的现象噬菌体分烈性噬菌体和温和性噬菌体。
温和性噬菌体由于其潜在的危害性大，有时候感染了，但不爆发，为以后的大面积爆发埋下了隐患。
在从事发酵工作时就遇到，车间周围环境恶化的已经相当厉害，仅一个星期中上的罐中有75%罐都爆发了噬菌体，除了一罐以外，且表观中基本看不出染噬菌体的现象，而电镜观察是能看到噬菌体存在的。
感染后爆发的现象有：3.1发酵液光密度开始上升，而后下降。
但有时也不上升，当把1%的噬菌体人为的接入罐中，光密度始终处于最低位3.2 pH逐渐上升，一般升到7.5，不再下降3.3耗糖、氨缓慢或停止3.4 OD回升3.5泡沫大、料液略黏3.6镜检时发现菌体减少，发胖，革兰氏染色后呈现红色碎片。
严重时，可出现拉丝或网状，或呈鱼刺状，几乎看不到完整菌体。
3.7用含有噬菌体的发酵液点在平板上能看到噬菌斑4 噬菌体的预防4.1五大误区4.1.1精度为0.01um的空气过滤器能阻拦噬菌体空气。
过滤器中的0.01um的精度不是单指膜的精度，他是把布朗运动、撞击等拦截都计算在内的，故0.01um只是个相对精度，实际上膜的绝对精度在0.2um左右，故0.01um的空气过滤器可以挡住一部分噬菌体，但不能完全挡住。
发酵工艺染菌综合分析及防止措施YUKI was compiled on the morning of December 16, 2020发酵工艺：染菌(bacteria infection)综合分析及防止措施原创2016-07-01 arrowone1.造成发酵染菌的可能途径有哪些?菌种培养过程操作不当培养基灭菌不彻底发酵设备(如发酵罐、管道)密封不严空气除菌不净2.既然染菌不可避免，哪我们应该怎样做?要提高生产技术水平，强化生产过程的管理，把握好各个易染菌的环节，尽可能防止发酵染菌的发生；而且一旦发生染菌，要能尽快找出其污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。
3.不同发酵过程相对危害最大的杂菌种类？青爲素的发酵细短产气杆菌链霧素的发酵细短杆菌、假单泡杆菌四环素的发酵双球菌、芽他杆菌、荚膜杆菌谷氨酸的发酵噬菌体柠檬酸的发酵青霉菌4.不同生产阶段染菌对发酵的影响：种子培养期染菌:对整个发酵过程的危害极大发酵前期染菌：严重干扰生产菌的生长繁殖发酵中期染菌：干扰生产菌的代谢，影响产物的生成发酵后期染菌：影响相对较小5.不同染菌原因对发酵的影响：种子带菌：将导致染菌范围不断扩大，使生产蒙受重大损失。
空气带菌：使发酵大面积染菌培养基或设备灭菌不彻底：一般不具延续性，使单个（批）发酵罐发酵失败设备渗漏：染菌儿率较大&发酵异常现象及染菌原因分析：（1）溶解氧的异常变化当杂菌是好气性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直至接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好气性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。
（2）排气的C02异常变化如杂菌污染时，糖耗加快，C02含量含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，C02 含量减少。
因此，可根据C02含量的异常变化判断染菌。
（3）其它异常现象：如菌体生长不良、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液的颜色异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的粘度异常增加等判断染菌。
发酵染菌原因分析第一部分：基础知识1）杂菌的类型空气中的微生物大多数是细菌和芽孢,还有一定数量的霉菌、酵母和病毒。
细菌的大小有零点几微米至几个微米.根据以上特点我们应得出如下结论：A：这些微生物在空气中极少单独游离存在,基本上是附着于灰尘、液滴等微粒的表面上。
B：介质过滤除菌就是把空气中的各种微粒和极少量的游离微生物捕集起来予以除掉。
因此我们通常所用的空气过滤器为什么0.3u可以保证无菌发酵生产的原因。
2）无菌检查与染菌的处理在抗生素生产过程中,为了及早发现染菌并进行恰当处理,保证生产正常进行,对菌种制备、种子罐、发酵罐的接种前后和培养过程中,须要按工艺规程要求按时取样，进行无菌检验。
A：无菌检查培养液是否污染杂菌可从三个方面进行分析：a:无菌试验b:培养液的显微镜拉查c:培养液的生化指标变化情况。
其中无菌试验是判断染菌的主要依据。
无菌试验现在采用的无菌试验方法有肉汤培养法、双碟培养法、斜面培养法。
其中以酚红肉汤培养法和双碟培养法结合起来进行无菌检查用的较多。
(1)肉汤培养法直接用装有酚红肉汤的无菌试管取样,然后放入37℃恒温室(箱)内培养。
定时观察试管内肉汤培养基的颜色变化,同时进行显微镜观察。
（2）斜面培养法先用空白无菌试管取样,然后在无菌条件下接种于斜面培养基上,置于37℃恒温室(箱)内培养。
定时观察有无杂菌菌落生长。
（3）双碟培养法种子罐样品先取入肉汤培养基中,然后在无茵条件下在双碟培养基上面划线,剩下的肉汤培养物在恒温室(箱)内培养6小时后复划线一次,发酵罐培养液直接取入空白无菌试管中,于37℃下培养6小时后在双碟培养基上划线。
24小时内的双碟定时在灯光下检查有无杂菌生长。
24小时~48小时的双碟1天检查一次,以防生长缓慢的杂菌漏检。
正常生产过程中,种子罐和发酵罐每隔8小时取样一次,进行无菌检查。
该方法经常用于单菌落挑选，可以从染有杂菌的培养液中经多次划线挑取单菌落进行分离培养，得到纯种的种子。
噬菌体的污染和防治在许多发酵生产中，如氨基酸发酵、丙酮-丁醇发酵和抗生素发酵中常常遇到噬菌体（b acteriaphage）污染，引起溶菌，并随之出现发酵迟缓或停止发酵等异常现象。
本节主要介绍噬菌体污染的特征，检查方法及防治措施。
一噬菌体污染的特征1 发酵液光密度上升缓慢，甚至下降，肉眼可见发酵液逐渐变清；2 耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少或不增加，发酵液中残糖高；3产生大量泡末，发酵液呈粘稠状；4 菌体不规则，甚至出现畸形。
二噬菌体的检查方法1．双层琼脂平板法（1）双层琼脂平板的制备：先用7~8mL 2%的琼脂培养基作底层，凝固后，加入3~4mL 冷至45℃的1%琼脂上层培养基（其中含0.2mL发酵菌种悬液和0.1mL待检发酵液），让其平整凝固；（2）在发酵菌的适宜温度下培养，若是细菌，一般培养16~20小时。
（3）检查有无透明的噬菌斑。
2．液体培养检查法将培养基、发酵菌种及待检发酵液三者混合，培养后观察培养液是否变清。
3．斑点试验法先制备好涂布有发酵菌种的平板，再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种，培养后，观察是否有噬菌斑。
4．玻片快速法将发酵菌种、发酵液和少量琼脂培养基（含0.5~0.8%的琼脂）混匀后涂布于无菌载玻片上，经短期培养后，在低倍镜下观察是否有噬菌斑。
三噬菌体的防治发酵液中污染噬菌体，不外乎有两种原因。
1 菌种本身带噬菌体，特别是溶源性噬菌体，对这种菌种，一经发现，应立即弃去。
2 生产的环境中有噬菌体。
因此，可采取相应的预防措施：1 决不使用可疑菌种；2 清除周围环境中存在的噬菌体。
能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，搞好清洁卫生工作；3 选育抗噬菌体菌株4 轮换使用菌株。
因为一个菌株用的时间一长，就有可能出现该菌种的噬菌体。
5 注意通气质量。
取风口应设在30~40米的高空，空气过滤器要保证质量；四发酵液污染噬菌体后的抢救措施如果一旦发现噬菌体污染，应及时采取补救措施1．若在发酵前期污染了噬菌体，因为此时耗糖还不多，常用以下措施（1）补加抗性种子，并根据发酵液中的营养多少，适当补加营养物质；（2）补加约50%的已培养至对数期的正常的发酵液，再进行发酵；（3）若噬菌体轻度污染，菌体仍能较正常地生长，并积累代谢产物，则可照常进行发酵，若污染严重，则用加热法（70~80℃）灭活噬菌体，放罐后重消毒。
发酵过程中噬菌体感染问题
1 噬菌体
噬菌体是侵染细菌的微生物病毒，广泛分布于自然界中。
在生产中见到的噬菌体为蝌蚪形，直径约0.1um，其形态在显微镜下看不见，通过电子显微镜放大9×104倍后才能看见。
故在生产中平时对噬菌体看不见摸不着，无形之中增加了对其了解和预防的难度。
2 噬菌体的主要特性
2.1专一的寄生性。
噬菌体只能在专一的宿主细胞中生长繁殖，只能在活的、处于繁殖阶段的细胞中生长繁殖，不能脱离宿生而自行生长繁殖。
如果不同菌株的亲缘关系比较近，那么此菌株也是会感染的，特别是针对长期生产同一产品的发酵工厂要特别注意，在换新菌株之前必须了解其背景。
2.2不耐热性。
游离的噬菌体在45℃条件下10min就可使其失活。
2.3不耐药性。
直接在噬菌体上喷洒1%新洁尔灭、75%酒精、1%双氧水、5%的甲醛等都可使其失活。
3 感染噬菌体后的现象
噬菌体分烈性噬菌体和温和性噬菌体。
温和性噬菌体由于其潜在的危害性大，有时候感染了，但不爆发，为以后的大面积爆发埋下了隐患。
在从事发酵工作时就遇到，车间周围环境恶化的已经相当厉害，仅一个星期中上的罐中有75%罐都爆发了噬菌体，除了一罐以外，且表观中基本看不出染噬菌体的现象，而电镜观察是能看到噬菌体存在的。
感染后爆发的现象有：
3.1发酵液光密度开始上升，而后下降。
但有时也不上升，当把1%的噬菌体人为的接入罐中，光密度始终处于最低位
3.2 pH逐渐上升，一般升到7.5，不再下降
3.3耗糖、氨缓慢或停止
3.4 OD回升
3.5泡沫大、料液略黏
3.6镜检时发现菌体减少，发胖，革兰氏染色后呈现红色碎片。
严重时，可出现拉丝或网状，或呈鱼刺状，几乎看不到完整菌体。
3.7用含有噬菌体的发酵液点在平板上能看到噬菌斑
4 噬菌体的预防
4.1五大误区
4.1.1精度为0.01um的空气过滤器能阻拦噬菌体空气。
过滤器中的0.01um的精度不是单指膜的精度，他是把布朗运动、撞击等拦截都计算在内的，故0.01um只是个相对精度，实际上膜的绝对精度在0.2um左右，故0.01um的空气过滤器可以挡住一部分噬菌体，但不能完全挡住。
用过滤器的洗脱液经电镜观察，可以看到噬菌体的存在。
4.1.2噬菌体不耐热，65℃以上的温度可杀死噬菌体。
我们所说的热灭菌是指达到一定的温度并维持一定的时间，使微生物致死的过程，可在实际生产中我们经常会遇到温度达到了使噬菌体致死的温度，可是却杀不死噬菌体，主要原因在于维持时间不够。
这就很容易解释为什么空气在进罐前就已经加热到70℃，可噬菌体仍然能活着进罐。
4.1.3噬菌体对药物敏感。
甲醛等消毒剂可杀死噬菌体原理同上，虽然药的浓度和剂量足够，可是如果维持时间不够仍起到不杀菌效果。
用5%的甲醛对全厂区喷洒，而后在环境中取样测定，仍有很多活噬菌体。
4.1.4预防噬菌体是发酵车间的事情，与其他车间无关。
噬菌体的防治是要上下齐动手，人人都参于。
发酵要做好是需要各部门配合且长期坚持下去。
4.1.5生产正常时，对噬菌体的警惕可以放松一点了。
对于噬菌体的防治，我们要做到年年防、月月防、日日防、时时防，至少每月召开一次关于噬菌体的分析会，每年召开一次噬菌体的总结会。
4.2预防措施
4.2.1活菌体的排放是噬菌体发生发展的首要条件，故如何控制活菌体的排放成为噬菌体预防的关键所在。
4.2.1.1每次上罐前对发酵罐进行空气试漏处理，防止由于设备原因造成话菌的外泄和噬菌体的进入。
4.2.1.2在接完种后，必须对残余种子液、接种瓶、种子罐及其连接管道附件等用蒸汽或药物消毒，没经过灭活处理的种子液不得排入污水池。
4.2.1.3在发酵过程中，需要知道细菌的生长情况，要求定时取样对发酵液进行检测分析。
取样最好在无风的条件下进行，取样口下方需设一个装有碱液（pH≥11）的容器，除了加盖取样瓶中的料液外，其余料液必须全部进入该碱容器，切勿喷洒或直接进入下水道。
取完样后，要用消毒水对取样者的手、取样瓶、装碱容器和以取样品为中心的上下左右1m的空间进行立体的喷洒；取样瓶需装在盛有消毒水的容器中直到化验室。
4.2.1.4化验室检测的对象就是带有活菌的料液，检测完pH后的电极需先用新洁尔灭冲洗，冲洗水入pH≥11的碱桶中；测OD时，移取原液的移液管或移液枪头须入碱水浸泡，比色管、比色器皿用新洁尔灭清洗浸泡30min后才可继续使用；离心管用新洁尔灭清洗浸泡30min后才可继续使用，且离心后固相及其清洗水须入碱桶中，凡是与料液有直接接触的液体废弃物须入碱桶，严禁直接排入下水池；凡是与料液有直接接触的固体废弃物须有pH≥11碱水浸泡2h后方可废弃。
4.1.2.5在发酵罐运行过程中有大量的尾气要外排，而这尾气中就含有活菌体，故尾气需经过蒸汽加热、热水处理和末端处理并且要排到远离车间100m以上的车间下风口位置。
4.2.1.6在放罐时，就是把大量的菌体排到下游，故对于放罐料液需要进行加热（70℃10min）和调酸（pH2～3）处理。
4.2.2如果在活菌的控制上做得比较好了，但仍避免不了有微量的活菌外泄，那就通过切断噬菌体与发酵液的接触来预防噬菌体的污染。
4.2.2.1提高吸风口高度，离地面每提高10m，空气中的含菌量可减少一个数量级。
故吸风口高度越高越好，建议最低高度需超过发酵车间楼顶高度10m。
4.2.2.2在空压机进口前加装5um的过滤器，可以过滤掉很大一部分杂菌。
4.2.2.3加强环境消毒
车间内部用漂白水和新洁尔灭轮流对所有地面角落进行喷洒，定点放置固体二氧化碳，使车间内部能闻到淡淡的药味。
每天早晚一次对车间地沟用漂白粉消毒，保持地沟内清洁无积水。
车间周围用ClO2、漂白粉每天喷洒2次。
4.2.2.4加强普查力度
定期（3天1次）对车间内部和车间周围环境中的杂菌含量进行普查统计，重点部位要求每天普查，对测得不合格的区域进行重点消毒，并且分析杂菌的来源。
每月1次选择有代表性的样品灭活后用电镜复检。
4.2.2.5加强对蛇管的检查力度。
特别是弯头和焊接部分，极易受到料液的腐蚀而穿孔。
蛇管中循环水的压力一般大于罐内压力，不管穿孔多少，水中的噬菌体会源源不断的进入发酵罐中，车间对蛇管3年来的4400m管道480只弯头及其连接管道的渗漏部位和数量统计如下：
可见在所有的漏点中，弯头渗漏的比例达到了88％，需特别引起重视。
5感染噬菌体后的处理办法
当发酵罐上出现噬菌体的典型现象后，一般说来是车间周围环境污染的相当厉害了。
此时切忌不要多上罐，因为罐上得越多，周围环境污染更厉害。
最好是减产或停产一个星期。
5.1发酵罐如果在20h感染噬菌体，那么立即加热到70℃维持10min后转到另外一个空消好的罐中，进行补种后重新发酵。
如果在20h后感染的话，能产多少酸就让它产多少酸，如果不产酸的话就120℃，30min处理，排入污水池。
5.2感染噬菌体后的发酵罐及其相关联的系统都要经过处理：
5.2.1发酵罐要经过空消121℃，30min→5%甲醛100℃，4h→4%碱水100℃，4h→空消121℃，30min处理
5.2.2所有与罐体直接相连的阀门拆下来肢解后用4%碱水浸泡4h，然后组装好试压（0.8MPa的压缩空气）不漏后待用。
5.2.3物料管道用5%甲醛熏蒸4h，然后用4%热碱水浸泡30min以上，用清水清洗干净备用。
5.2.4移种管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过移种管道排出，再用蒸汽消毒1h，要求每个排污阀都要微开，确保有水或汽排出。
5.2.5把补料罐先清空，补料管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过移种管道排出，再用蒸汽消毒1h，要求每个排污阀都要微开，确保有水或汽排出。
5.2.6放料管道用5%甲醛熏蒸4h，煮罐后的碱水通过放料管道排出，再用蒸汽消毒1h
5.2.7空气总管用5%甲醛熏蒸4h，要求每个支路都要消到，再用蒸汽冲刷3h，最后用空气吹干。
5.2.8配料槽储料槽等用4%热碱水浸泡4h。
5.2.9取样瓶取样篮等用消毒水或碱水浸泡。
5.2.10空气过滤器重消吹干后备用。
要用坚决、彻底的态度来对待噬菌体，宁可做过头也不能少做或不做。
5.3立即召开车间会议，探讨工艺管线等有无缺陷，如果存在立即整改
5.4立即制定相应的卫生和环境消毒策略，并予以执行。
总之，随着科技的进步，人类对噬菌体研究的深入，今后将会有更多有效的措施用于工业噬菌体的防治，确保发酵生产的正常运行。
