游离氨基酸样品前处理

日立L-8900全自动氨基酸分析仪样品前处理步骤（内部用）一、饲料样本中水解蛋白中氨基酸含量测定步骤（参考GB/T 18246-2000）1. 样品制备取具代表性的饲料样品，用四分法缩减分取25g 左右，粉碎并过。

.25m m孔径(60目)筛，充分混匀后装入磨口瓶中备用。

对于粗脂肪含量大于、等于5%的样品，需将脱脂后的样品风干、混匀，装入密闭容器中备用。

而对粗脂肪小于5%的样品，则可直接秤用未脱脂样品。

2. 氨基酸水解液制备（酸水解）称取含蛋白7.5 -25 mg的试样(约50~100 mg,准确至1 mg) 于20 mL水解管，加10.00 mL 酸解剂（6 mol/L HCl)，置液氮或干冰(丙酮)中冷冻。

然后，抽真空至7 Pa(-<5X1 0-'mm汞柱)后封口或充氮气封口。

将水解管放在110℃恒温干燥箱中，水解22~24 h。

冷却，混匀，开管，用水定容至50~100mL（保证上机液中总氨基酸浓度在50-250 nmol/mL），过滤，用移液管吸取1.0 mL 于真空干燥箱60℃蒸干，必要时，加少许水，重复蒸干1-2次（或50℃氮吹仪吹干，加少量水重复吹干2次）。

加入2 mL 0.02 mol/L HCl溶液，充分溶解，0.22 um滤膜过滤，上机。

二、血浆中游离氨基酸测定1. 样品制备采集约5 mL抗凝全血，4000 × rpm离心，获得血浆，检测前-20℃保存。

2. 分离游离氨基酸取血浆1.0 mL，加入1.0 mL 8%磺基水杨酸（8g磺基水杨酸溶于92mL的超纯水），4℃冰箱过夜，14000 × rpm 离心10 min，上清液过0.22 um滤膜，取约1 mL上机测定。

总游离氨基酸测定（完整版）实验原理：游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用，产生蓝紫色的化合物二酮茚－二酮茚胺，产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm下测其含量。

因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应，在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉.仪器与用具：100ml容量瓶；漏斗；三角瓶研钵；刻度吸管：0.1ml×1、1ml×2、2ml×2、5ml×1;沸水浴；具塞刻度试管20ml×10;分光光度计.一、试剂1.水合茚三铜：称重结晶的茚三铜0.6g,装入烧杯，加入正丙醇15ml，使其溶解加入正丁醇30 ml、乙二醇60 ml、乙酸-乙酸钠缓冲液（pH=5.4）9 ml,混匀，棕色瓶冰箱保存，10天内有效。

2.乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.4）：称取化学纯乙酸钠54.4g，加入无氨蒸馏水100 ml，电炉加热至沸，使其体积减半，冷却后加冰乙酸30 ml，加蒸馏水定容至100 ml。

3.氨基酸标准溶液：精确称取80℃烘干至恒重的亮氨酸0.0234g溶于10％异丙醇并定容至50ml。

取此液5ml蒸馏水稀释到50ml，即为5μg/ml氨基酸标液。

4.0.1%抗坏血酸：称取0.050g抗坏血酸，溶于50 ml蒸馏水中，即配即用。

5.10％乙酸二、标准曲线制备加塞子密封于沸水中加热15分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去，待呈现兰紫色时，用60％乙醇定容至20ml，摇匀于570nm波长下比色。

以吸光度为纵坐标，氨基氮ug数为横坐标，绘标准曲线三、实验步骤：1.烟末0.5g于研钵中加入5 ml10%乙酸，研磨匀浆后用蒸馏水定容100 ml，用滤纸过滤到三角瓶中备用。

2.1ml滤液加入到20ml 干燥试管中，加1 ml蒸馏水，水合茚三铜3ml, 0.1%抗坏血酸0.1ml, 加塞子密封于沸水中加热15分钟，取出后用冷水迅速冷却并不时摇动使加热时形成的红色被空气逐渐氧化褪去，待呈现兰紫色时，用60％乙醇定容至20ml，摇匀于570nm波长下比色。

游离氨基酸的测定实验方案（茚三酮比色法）一、实验目的茚三酮比色法测定发酵液中游离氨基酸含量，利用氨基酸含量这个参数，控制发酵过程.二、实验原理游离氨基酸的游离氨基可与水合茚三酮作用,产生蓝紫色的化台物二酮茚一二酮茚胺,产物的颜色深浅与游离氨基酸含量成正比，用分光光度计在570nm 下测其含量.因蛋白质中的游离氨基酸也会产生同样反应,在测定前必须用蛋白质沉淀剂将其除掉。

三、实验材料发酵液样品；实验试剂:水合茚三酮;氨基酸标准液；0.1%抗坏血酸实验仪器:100ml容量瓶；漏斗；三角瓶；研钵；移液器;枪头；沸水浴；具塞刻度试管20 ml×10;分光光度计四、实验方法1.溶液配制（1)水合茚三酮称取0。

6g重结晶的茚三酮放烧杯中，加入15ml 正丙醇、30ml正丁醇、60ml乙二醇及9 ml PH4。

54的醋酸盐缓冲液混匀,棕色瓶中冰箱内保存,10天内有效。

（2）氨基酸标准液称取80℃烘干的亮氨酸23.4mg,以10％的异丙醇溶解定溶至50ml（含氮为50ug/ ml)，取此液5ml，用水定容至50 ml，此为含氮量5ug/ ml工作液。

（3）0.1%抗坏血酸称取0。

1g抗坏血酸定容100 ml，随用随配。

2.标准曲线绘制取6支20ml 试管,按下表加剂：试剂管号12 3 4 5 6 亮氨酸标准液（ml ） 0 0.2 0.4 0。

6 0。

8 1.0 无氨蒸馏水（ml ） 2.0 1。

8 1。

6 1.4 1.2 1.0 水合茚三酮（ml) 3.0 3。

0 3。

0 3.0 3.0 3。

0 抗坏血酸（ml ） 0.1 0.1 0.1 0.1 0。

1 0.1 氨基氮量（ug/管 )1.02.03.04.05.0将各管溶液混合均匀，封口，在沸水中加热15min ，取出后立即用冷水摇动冷却,用60%乙醇定容至20 ml ，摇匀。

λ=570nm 处测定吸光度0 0.025 0.055 0。

0990。

146 0.186以吸光度为纵坐标，氨基氨ug 数为横坐标，绘标准曲线如图：茚三酮比色法测定游离氨基氮标准曲线-0.0500.050.10.150.2氨基氮（ug）吸光度A3.样品中游离氨基酸的测定取20ml 试管，取待测液1ml ，加蒸馏水l ml ，水合茚三酮3.0 ml,坏血酸0。

高效液相色谱法测定大豆中游离氨基酸含量一、本文概述本文旨在探讨高效液相色谱法（HPLC）在大豆中游离氨基酸含量测定中的应用。

作为一种重要的植物蛋白来源，大豆中的氨基酸组成对于其营养价值及食品工业应用具有重要意义。

游离氨基酸作为大豆蛋白质水解的产物，其含量直接反映了大豆的蛋白质质量和营养价值。

因此，准确测定大豆中游离氨基酸的含量对于评估大豆品质及开发高附加值产品至关重要。

高效液相色谱法作为一种高效、准确的分离分析技术，在氨基酸分析领域具有广泛应用。

本文将详细介绍高效液相色谱法的基本原理、样品处理方法、色谱条件优化以及结果计算与分析等方面的内容，并通过实验验证该方法的可行性和准确性。

本文还将讨论高效液相色谱法在大豆游离氨基酸含量测定中的优势及局限性，以期为相关领域的研究和实践提供有益的参考。

二、实验材料与方法（1）大豆样品：选择新鲜、无病虫害、无杂质的大豆作为实验材料，经过清洗、烘干、破碎后备用。

（2）试剂：实验所需试剂包括高效液相色谱仪用流动相（如乙腈、甲醇等）、衍生化试剂（如OPA、FMOC等）、标准品氨基酸等，均为分析纯或更高纯度。

（3）仪器：高效液相色谱仪（配备紫外检测器或荧光检测器）、离心机、涡旋混合器、水浴锅、移液枪等。

（1）样品处理：称取适量大豆样品，加入适量的水或缓冲液，进行匀浆处理。

然后，将匀浆液进行离心，取上清液作为游离氨基酸提取液。

（2）衍生化处理：取一定体积的游离氨基酸提取液，加入适量的衍生化试剂，进行衍生化反应。

衍生化反应的目的是将氨基酸转化为易于检测的衍生物，提高检测灵敏度和准确性。

（3）高效液相色谱分析：将衍生化后的样品进行高效液相色谱分析。

选择合适的流动相和色谱柱，设置合适的检测波长或激发/发射波长，记录色谱图和峰面积。

（4）数据处理：根据标准品氨基酸的色谱图和峰面积，绘制标准曲线。

然后，根据样品的色谱图和峰面积，结合标准曲线，计算样品中游离氨基酸的含量。

本实验采用高效液相色谱法测定大豆中游离氨基酸的含量，通过样品处理、衍生化处理、高效液相色谱分析和数据处理等步骤，实现对大豆中游离氨基酸的快速、准确测定。

实八:植物组织中游离氨基酸的分离鉴定
左哥
一、实验材料、器材
1、展层溶剂标准氨基酸溶液0.5%羧甲基纤维素钠溶液硅胶G粉0.5%茚三酮丙酮溶液
2、层析缸玻璃板
二、操作步骤
1、马铃薯提取液制备：30g去皮马铃薯，80%乙醇，组织捣碎机，水浴蒸干，残渣加水溶解→
2、制版：1.8g硅胶G，研磨3min，干燥，110C烘箱活化30min→
3、点样：→
4、展层→
5、显色→
6、鉴定。

三、实验结果
四、讨论及分析
由样点颜色和Rf值与标准样点对比可知，2号点为Met，6号点为Pro，7号点为His，
1—6号点，对应氨基酸为酸性或中性氨基酸，而7、8号对应氨基酸为碱性氨基酸。

薄板上样品中5号显色斑点为紫红色，但距离6号点较近，未能完全分离，推断有以下
几点原因：点样时扩散直径过大，导致两斑点扩散区域重叠难以辨认；薄层担体粒度本身的
限制，试验中展层时间不长即达到了预计的溶剂前沿（居上边缘约1cm），即展层速度过快，
原因可能是制板时硅胶G研磨过粗，据范迪姆特方程：H=A+B/U+Cu,其中A、C均与粒度成
正比，即提高填充料的均匀性和减少粒度才能在定长的条件下提高有效搭伴数，增强分离效
果；研磨时用力适当，方法合适，适当增加研磨时间才能是硅胶G颗粒又匀又细，达达到
较好分离效果。

同时，也要注意不可研磨过细，否则易拖尾。

游离氨基酸样品的制备:
1.如为固体样品，取样品置于打浆机中打碎或碾碎，备用。

含油高时需去除油脂。

2.秤取适量打碎样品于小烧杯中加入适量超纯水，涡旋混合2min，常温下提取氨基酸10-30min，定容至25或50ml 容量瓶中。

（注：液体样品从步骤3开始，无需步骤1和2）。

3.取定容后的样液4ml于离心试管中，按样品：磺基水杨酸（15%）=4：1加入磺基水杨酸，混合均匀。

4.置冰箱中 2-4 摄氏度冷藏静置60min以上。

5.置离心机中以10.000rpm离心15min。

6.取上层清液再次以10.000rpm离心15min。

7.用样品稀释液按1：1--1：100稀释（根据样品中氨氮含量确定稀释倍数，以稀释后样品瓶中氨氮含量
0.01-0.006%进样合适，如酱油氨氮含量0.8，稀释100倍为0.008进样正好）。

8.经0.22-0.45微米过滤器过滤后装入试剂瓶中上机分析。

蘑菇中游离氨基酸含量的测定实验报告蘑菇是一种常见的食用菌类，具有丰富的营养价值。

其中，游离氨基酸是蘑菇中重要的营养成分之一。

本实验旨在测定蘑菇中游离氨基酸的含量，为进一步了解蘑菇的营养价值提供科学依据。

实验步骤如下：1. 样品准备：选取新鲜的蘑菇作为实验材料，并将其洗净，去除杂质。

2. 样品处理：将蘑菇样品切成小块，然后使用搅拌器将其研磨成蘑菇泥。

3. 提取游离氨基酸：取一定量的蘑菇泥，加入适量的提取液（如酸性溶液、无水乙醇等），并进行搅拌，使蘑菇中的游离氨基酸溶解到提取液中。

4. 离心处理：将提取液进行离心，使蘑菇的残渣与提取液分离。

5. 过滤处理：将离心后得到的提取液通过滤纸进行过滤，去除其中的固体残渣，得到纯净的提取液。

6. 清洗提取液：将提取液加入适量的洗涤溶液中，进行清洗，去除其中的杂质。

7. 测定游离氨基酸含量：采用比色法、高效液相色谱法或气相色谱法等方法测定提取液中游离氨基酸的含量。

通过以上实验步骤，可以得到蘑菇中游离氨基酸的含量。

游离氨基酸是蛋白质分解产物，是蘑菇中重要的营养成分之一。

它们在人体内参与蛋白质合成、酶的催化活性以及细胞信号传递等生理过程中发挥重要作用。

蘑菇中游离氨基酸的含量与蘑菇的品种、生长环境、采摘时间等因素有关。

不同品种的蘑菇中游离氨基酸的含量也有所差异。

此外，蘑菇的新鲜程度也会影响游离氨基酸的含量。

因此，在进行蘑菇中游离氨基酸含量的测定时，需要选择新鲜的样品，并且注意控制其他影响因素，以保证实验结果的准确性和可靠性。

通过测定蘑菇中游离氨基酸的含量，可以了解蘑菇的营养价值和食用价值，为人们合理膳食提供科学依据。

此外，还可以为蘑菇的种植和加工提供参考，以提高蘑菇的品质和经济效益。

蘑菇中游离氨基酸含量的测定是一项重要的实验研究。

通过科学的实验方法和严谨的实验步骤，可以准确测定蘑菇中游离氨基酸的含量，为了解蘑菇的营养成分和提高蘑菇的品质提供科学依据。

这对于人们的健康饮食和蘑菇产业的发展具有重要意义。

游离氨基酸的测定方法
游离氨基酸咋测定呢？其实有不少方法呢！比如说茚三酮比色法。

先准备好样品，把它处理成合适的状态。

然后加入茚三酮试剂，经过一系列反应后，通过比色来确定游离氨基酸的含量。

这过程中可得小心操作，要是弄错了一步，那结果可就不靠谱啦！那安全性咋样呢？只要按照正确的步骤来，一般没啥大问题。

稳定性嘛，只要试剂没问题，操作规范，结果还是挺稳定的。

这方法能用到好多地方呢！像食品检测领域，你想想，要是不知道食品里的游离氨基酸含量，咋能保证食品的质量和营养呢？优势也不少呢！操作相对简单，成本也不高。

咱举个实际案例哈。

有个食品加工厂，用这个方法检测产品中的游离氨基酸含量，及时调整了生产工艺，提高了产品质量。

这效果多棒啊！
游离氨基酸的测定方法真的超实用，能帮我们了解各种物质中的氨基酸情况，为我们的生活和生产带来很多好处。

咱可得好好利用这些方法，让它们发挥更大的作用。

水溶肥游离氨基酸含量测定标准
水溶肥是一种现代化肥料，它可以直接溶解在水中，提供给植
物所需的养分。

其中，游离氨基酸是水溶肥中的重要成分之一，对
植物的生长发育起着重要作用。

因此，准确测定水溶肥中游离氨基
酸的含量，对于合理施肥、提高作物产量和质量具有重要意义。

为了保证水溶肥中游离氨基酸含量的准确性，制定了相应的测
定标准。

首先，需要选择合适的测定方法，常见的有高效液相色谱法、气相色谱法、紫外分光光度法等。

然后，根据标准操作程序，
进行样品的前处理、提取和分析，确保测定结果的准确性和可靠性。

同时，还需要建立相应的质控体系，包括仪器设备的校准、标准品
的准备和实验室操作规范等，以确保测定结果的准确性和可靠性。

标准的制定和实施，不仅有利于水溶肥生产企业提高产品质量，还可以为农民提供科学合理的施肥指导，促进农业生产的可持续发展。

因此，加强对水溶肥游离氨基酸含量测定标准的研究和推广应用，具有重要的现实意义和深远的社会影响。

希望相关部门和科研
机构能够进一步加强标准的制定和实施，推动水溶肥行业的发展，
为农业生产提供更好的支持。

氨基酸分析样品水解用于氨基酸分析的样品制备要得到满意的氨基酸分析结果，不仅仅要注意样品的制备，最重要的是样品的处理。

最精密的仪器也只是在分析时从样品中分离出氨基酸本来的含量。

下面的制备方法已经过实践验证，适用于常规分析。

但在某些情况下也可以，或者说有必要，做适当的修改。

含缩氨酸或蛋白质的样品制备方法：水解样品需要预先粉碎并过60目筛，如果样品含有油脂成分，则水解前还必须先萃取。

方法一、用6 mol/L盐酸水解纯蛋白质或缩氨酸1、称取含蛋白7.5-25 mg的样品（约50－100 mg，准确至0.1 mg）于20 mL安培管中（切勿粘壁）；2、加入10 mL 6mol/L HCL（取500 mL优级纯盐酸（36-38%），定容到1000 mL，加1 g苯酚）；3、用液氮冷冻；4、待液体超过三分之一凝固后，抽真空，熔化安培管使其密封；5、根据样品的不同，将其放在110℃的炉子（烘箱）上，水解12、24、36或72h；6、为了保证结果的重现性，应使炉子恒定在110℃，建议使用内置气流环路的炉子；7、水解完成后，冷却，混匀，开管，过滤，定容至50 mL；8、取适量（0.5 mL左右）滤液置于浓缩仪或旋转蒸发仪中，低于60℃，抽真空，蒸发至干，必要时加少许水，重复蒸干1－2 次；9、加入1－3 mL样品稀释液，使氨基酸浓度达到50－250 nmol/mL。

震荡混匀，用0.22 μm滤膜过滤后，供上机测定使用。

注意：称取样品的量最好与氮的总含量相关联，这样分析结果的重复性会更好。

除此之外的另一个重要因素是样品量与所加入的酸的比例。

当样品中不含纯的缩氨酸和蛋白质而是含有碳水化合物时，酸的多少就非常重要。

碳水化合物的量越多，所需酸就越多。

样品与酸的比例必须在1:10到10:1的之间(mg/mL)。

方法二、氧化水解1、称取含蛋白7.5-25 mg的样品（约50－100 mg，准确至0.1 mg）于20 mL浓缩管中（切勿粘壁）；2、置于0℃冰水中加入2 mL预冷的过甲酸溶液，加液时需将样品全部润湿，但不能摇动；3、在2℃的冰箱中放置15 h；或者55℃水浴中放置15 min；4、溶液中多余的过甲酸可以通过加入氢溴酸（48％氢溴酸0.3 mL）放入冰浴静止30 min来去除；5、然后置于浓缩仪或旋转蒸发仪中，低于60℃，抽真空，蒸发至干；6、用10-15 mL 6 mol/L HCL将残渣转移到20 mL安培瓶或厌氧管中（切勿粘壁），封口（无须抽真空），置于（110±1）℃恒温干燥箱中水解22－24 h；7、水解完成后，冷却，混匀，用水把水解液定容到20 mL；8、过滤后取0.5 mL上清液浓缩至干；9、加入1－3 mL样品稀释液，使氨基酸浓度达到50－250 nmol/mL，震荡混匀，用0.22 μm滤膜过滤后，供上机测定使用。