下载文档原格式
昆虫分子生物技术的主要研究方法与领域-发育生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——摘要：分子生物技术在昆虫系统发育研究中具有重要作用, 该技术在昆虫的鉴定分类, 研究种群系统发育关系等方面应用广泛。
本文主要从分子生物技术的研究材料, 技术方法和应用三方面展开论述, 并展望了分子生物技术未来在系统发育中的应用前景。
关键词：分子生物技术; 系统发育; 分子标记; 应用;Abstract：Molecular biology techniques plays an important role in the research of insect phylogeny. It is widely used in the identification and classification of insects, and in the research of phylogenetic relationships, etc. This paper mainly discussed the molecular biology techniques from the aspects of research materials, technical methods and its application. At last, the prospect of the application of molecular biology technology in the system development prospects in the future.Keyword：molecular biological techniques; phylogeny; molecular marker; application;昆虫系统发育和进化是昆虫学的一个重要分支, 研究昆虫的系统发育不仅对昆虫的命名、鉴定、描述有所帮助, 而且在探究昆虫的起源、进化和种群的形成发展有着更深层次的意义。
分子遗传标记技术及其在昆虫科学中的应用3龚 鹏 杨效文 谭声江 陈晓峰33中国科学院动物研究所农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室 北京 Μολεχυλαργενετιχµαρκερσανδτηειραππλιχατιονινεντοµολογψ ° ≠ ÷ 2• × ≥ 2 εταλ ΣτατεΚεψΛαβορατορψοφΙντεγρατεΜαναγεµεντοφΙνσεχτΠεστσ&Ροδεντσ ΙνστιτυτεοφΖοολογψ ΧηινεσεΑχαδεµψοφΣιχνεχεσ ≤Αβστραχτ × √ ∏ √ √ °≤ ≥ ∏ √ ¬ √ ∏ √ √ √ ¬ √ √ √ ∏ ∏ ∏ ∏ 2 ∏ √ ∏ ∏ ∏ ∏ √ √ √ ∏ ∏ ∏ 2 ∏ ∏ °⁄ ⁄ ƒ ° ƒ ° √ ∏ 2 ∏ ∏ ∏ ≥≥ √ √ ∏ × ∏∏ ∏ ∏ ∏ 2 ¬ √Κεψωορδσ ∏ ∏∏ 2 ∏ 摘 要 分子遗传标记是随着聚合酶链式反应 °≤ 和≥ ∏ 杂交等分子生物学技术的飞速发展而出现的遗传学标记技术它突破了以往形态标记 细胞学标记和同工酶标记等表达型标记的局限性 在揭示物种的遗传变异性研究中发挥着独特的优势∀分子遗传标记目前已出现了几十种可依其涉及的位点和反映的多态性的基础分为多位点分子标记和单位点分子标记多位点分子标记反映核苷酸序列的多态性单位点分子标记反映基因座上等位基因的多态性∀本文对一些常用的分子标记技术的特点和它们在昆虫系统进化!昆虫分类!昆虫生态!生物防治和特定基因标记等研究中的应用作了介绍∀关键词 分子遗传标记 多位点分子标记 单位点分子标记 昆虫学3国家自然科学基金重点资助项目 !中科院九五重大项目 2 2 和瑞典国际基金 ƒ≥资助项目 ≤Π ∀33通讯作者∀收稿日期 2 2遗传标记 是指用来区分不同的个体或群体 能够稳定遗传的物质或性状∀最早的遗传标记是形态标记 后来在显微镜技术的支持下诞生了细胞学标记∀ 世纪 年代电泳技术的发展又出现了同工酶标记∀这 种标记都是基因表达型的标记 易受环境条件和发育阶段的影响 可利用的多态位点较少∀从 世纪 年代开始 由于分子生物学的飞速发展 出现了多种多样的分子遗传标记 2 ∏ 分子遗传标记突破了表达型标记的局限性 其变异只来源于基因⁄ 序列的差异 具有稳定性高!受环境条件的影响较小!信息含量高!不同层次和类群之间广泛可比等优越性 因而成为遗传标记中又一强有力的工具 在揭示物种的遗传变异性研究中发挥着独特的优势∀1常用的分子标记分子标记技术目前已出现了几十种 新的分子标记还会不断涌现 下面介绍一些常用的分子标记方法∀1.1核苷酸序列多态性的标记技术1.1.1以≥ ∏ 杂交为基础的分子标记技术以≥ ∏ 杂交为基础的分子标记的技术过程包括基因组⁄ 的限制性酶切 电泳分离 利用探针进行≥ ∏ 杂交来检测基因组⁄ 的多态性∀此类技术应用较多的是限制性内切酶酶切片段长度多态性 2 简称 ƒ ° 和⁄ 指纹谱 ⁄ ∀ƒ °是由 在 年首先建立并发展起来的一种分子遗传标记∀它是指用限制性内切酶切割不同个体基因组⁄ 后 含有同源序列的酶切片段在长度上的差异∀这种差异可通过用特定的探针进行分子杂交 然后放射自显影而显示出来∀常用的探针来自于对单拷贝或低拷贝的基因组⁄ 的随机克隆或 ⁄ 克隆∀⁄ 指纹谱是 及其同事于 年在人体遗传研究中发展起来的一种遗传标记方法∀该技术运用小卫星或微卫星⁄ 序列为探针 与酶切后的基因组⁄ 杂交产生出包含许多条谱带的杂交图谱 且不同个体杂交图谱上带的位置千差万别 就象人的指纹一样 因此 等人将这种杂交图谱称为⁄ 指纹谱≈ ∀在⁄ 指纹技术诞生之初 ⁄ 指纹探针仅局限于 的人源小卫星探针 和 ∀随着⁄ 指纹技术的广泛采用 新的探针不断涌现∀目前使用的探针有 类 小卫星探针 微卫星探针 2 基因组⁄ 探针∀1.1.2以°≤ 为基础的分子标记技术随着°≤ 技术的产生 近几年已出现了以°≤ 为基础的几种分子标记技术∀这些技术的优势在于容易操作 灵敏度高 有的技术还可在不了解目的物种任何分子生物学背景的情况下 对其进行研究∀下面对目前应用较多的几种标记技术加以介绍∀随机扩增片段长度多态性 ⁄ 简称 °⁄ ∀ 年 两个实验室几乎同时建立了检测随机扩增多态⁄ °⁄ 的分子生物学技术≈ ∀ °⁄是以 左右的随机寡核苷酸单引物 对基因组⁄ 进行扩增 扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭染色来检测∀也可对扩增产物进行同位素标记 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 然后用放射自显影检测∀⁄ 扩增指纹分析 ⁄ 2 简称⁄ ƒ 利用非常短的随机引物扩增不同个体的⁄ 然后采用高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色检测⁄ 的多态性∀⁄ ƒ使用的引物为 ∗ 比 °⁄的引物更短 因而扩增产物也更多∀重复序列 微卫星 引物扩增 ∏ 2°≤ 简称≥ ≥°2°≤ 以微卫星序列和小卫星核心序列为单一引物进行°≤ 扩增∀由于一般使用 以上的重复序列做引物 所以扩增稳定性比 °⁄大大增强∀扩增片段长度多态性 简称 ƒ ° 是 年由 ∏ 和∂ ° 发明的一种⁄ 指纹技术≈ ∀它结合了 ƒ °和°≤ 技术的特点##昆虫知识∞ × ≤ • ∞⁄ ∞具有 ƒ °技术的可靠性和°≤ 技术的高效性∀其基本原理是对基因组⁄ 酶切片段的选择性扩增∀该技术设计了对某种限制性内切酶的通用接头 以及可与接头序列的限制性酶切位点的序列配对的专用引物 扩增的酶切片段在高分辨力的顺序分析胶上电泳 产生扩增片段长度不同的多态性带型∀单链构象多态性°≤ 2 22°≤ ≥≥≤°2°≤此方法是 等于 年建立的∀应用这一方法必须事先知道目的⁄ 的序列 根据其两端的核苷酸顺序设计合成双引物 特异性扩增目的序列扩增产物变性后 用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测∀其基本原理是目的片段上所发生的突变 甚至单个碱基的替换!缺失或插入等微小变化 也将导致其构象改变 并在电泳迁移率上表现出来∀由于缺乏完整的理论依据来预测迁移率和序列对应构象的关系 ≥≥≤°技术目前仍属经验总结阶段∀1.2 基因座上等位基因多态性的标记技术1.2.1 以重复序列为基础的分子标记技术简单重复序列即微卫星⁄ 标记∏ 简称≥≥ 由几个核苷酸 个 为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列 如 ≤ 等 在染色体上呈随机分布 由于重复次数不同及重复程度的不完全而造成了每个基因座上等位基因的多态性≈ ∀可以利用某个微卫星⁄ 两端的保守序列设计一对特异引物 扩增这个位点的微卫星序列 经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不同基因型个体在这个≥≥ 位点上的多态性∀1.2.2 以为基础的分子标记技术 差别显示°≤ √ 2简称⁄⁄ ×2°≤ 技术 年由 和° 所创建≈ ∗将总 以选用的 χ2端锚定引物作反转录合成第一链 ⁄ 然后以反转录产物作模板 用 χ2端随机引物和 χ2端锚定引物组合的引物对 在加入放射性同位素或荧光标记的 ×°的条件下进行°≤ 表1 常用的分子遗传标记的特点分子标记优点局限性涉及的位点多态性的基础 ƒ °多位点 高变异对⁄ 质和量的要求高多位点核苷酸序列稳定性强只能检测内切酶识别位点上的变异孟德尔遗传需用探针 检测方法较繁琐 成本高⁄ 指纹谱同 ƒ °同 ƒ °多位点核苷酸序列 °⁄操作简便易行 成本低稳定性差多位点核苷酸序列样品⁄ 的质和量要求不高显性标记可在不了解遗传背景下应用⁄ ƒ提供信息高于 °⁄技术较为复杂多位点核苷酸序列 °2°≤ 信息量大假阳性高 稳定性差多位点核苷酸序列≥ ≥°2°≤操作简便易行 成本低需前期研究基础多位点核苷酸序列对样品⁄ 的要求不高 ƒ °多态性丰富受专利保护多位点核苷酸序列结果稳定可靠试剂盒价格昂贵所需⁄ 量少对操作和样品⁄ 质量要求严格孟德尔遗传主要用同位素标记≥≥≤°2°≤操作简单可能漏检一些突变单位点核苷酸序列共显性标记≥≥ 共显性标记需前期研究基础单位点基因座上等位基因⁄⁄ ×2°≤可同时检测基因和表达的差异对操作和样品⁄ 要求严格单位点基因座上等位基因# #昆虫知识 ∞ × ≤ • ∞⁄ ∞扩增 将扩增样品加在变性的⁄ 测序胶中进行电泳分离 经÷光底片暴光后就可以观察到差别表达的 之 ⁄ 扩增条带∀2分子遗传标记在昆虫科学中的应用分子遗传标记在昆虫系统进化!近似种的区分!种群遗传结构及分化!生态特性和行为 迁移扩散!生态入侵!领地扩展 等研究领域得到越来越广泛的应用∀2.1系统进化分子遗传标记大大推进了昆虫系统进化的研究∀用 ƒ °技术° 等研究了冈比亚按蚊Ανοπηελεσγαµβιαε 内 个同型种的 ⁄ 的 ×≥区 发现同型种间差异很小 说明出现分化的时间距今并不遥远≈ ∀ 分析了全爪螨属Πανονψχηυσ 个相近种的系统关系 证明Π µορι与Π χιτρι亲缘关系虽然十分接近 但明显是两个独立的种≈ ∀根据钠离子通道侧翼位点的内含子序列分析 等明确了贪夜蛾属Σποδοπτερα 个种的进化关系≈ ∀通过检测 ≥和 ≥ ⁄ 基因序列的差异 等分析蚊总科的进化起源 证实≤∏ 亚目中的≤ ≤ 和≤∏ 个科组成一个单系群≈ ∀2.2分类学在昆虫纲里 同翅目与半翅目的关系一直存在一些争论 目前分类学家大多支持将同翅目划为一个独立的目 应用分子生物学手段分析的结果也证实了这一观点∀∂ ⁄ 等分析了同翅目与半翅目中 个种及作为外群的 个目 个种的 ≥ ⁄ 部分序列 证实了同翅目应作为一个单系与半翅目分开≈ ∀蚜虫分类学家将分子标记用于以往由于缺乏明确的特征以及形态的可变性而比较困难的蚜虫分类和鉴定工作中∀ƒ 等用 ƒ °技术检测了豌豆蚜Αχρψτηοσιπηονπισυµ 和麦长管蚜Σιτοβιοναϖεναε ƒ ∏ 在内的多种蚜虫的 ⁄ 的多态性≈ ∀≤ 等用 °⁄方法对 种蚜虫进行了成功的鉴别≈ ∀≥ 等用 ƒ °方法研究赤眼蜂属Τρι2χηογραµµα 个种 微小赤眼蜂Τ µινυτυµ!甘蓝夜蛾赤眼蜂Τ βρασσιχαε和西伯利亚赤眼峰Τ σιβιριχυµ的 ⁄ 发现这 个种在 ×≥ 和 ×≥ 区的长度上都有差异 每个种都有其特有的酶切谱带型∀这些结果表明赤眼蜂属的一些种可用 ⁄ 标记清楚地区别≈ ∀铁杉尺蛾Λαµβδιναφισχελλαρια是北美广泛分布的森林害虫 它的种下有 个亚种 铁杉尺蛾Λ φ φισχελλαρια ∏ i 西方铁杉尺蛾Λ φ λυγυβροσα ∏ 美西栎尺蛾Λ φ σοµ2νιαρια ∏ 在形态上难以区分 以往根据幼虫寄主和成虫外激素来区别∀≥ 的研究表明细胞色素氧化酶 和 的基因序列差异和酶切位点的变异可成功区分这 个亚种≈ ∀2.3生态学分子标记技术使人们对昆虫的生态学 包括种群遗传分化!种群间迁移扩散关系以及生殖策略等问题获得了更深入的认识∀同一物种不同的种群可能发生遗传变异 在形态学上通常难以发现这种差异 但在⁄ 水平却容易找出明显的不同∀用 °⁄方法 杨效文等≈ 研究了我国烟蚜种群的寄主分化和地理分化 结果表明我国烟蚜分化仅在种群水平上 未达亚种分化程度∀通过对 ⁄ 的分析 ° 等成功地区分了麦二叉蚜的生物型 ≤ ∞和ƒ≈ 研究豌豆蚜在寄主利用方面的种群遗传趋异的程度≈ ∏ 等研究了传播疟疾的Ανοπηελεσφυνεστυσ在西非和东非的地理分化≈ ∀用⁄⁄ ×2°≤ 方法 杨效文等研究了棉蚜的体色遗传分化 杨效文等 待发表 ∀用多位点 ×探针 ⁄ 等对澳大利亚麦长管蚜Σιτοβιοναϖεναε进行指纹谱研究 结果表明不同麦穗上的麦长管蚜的遗传多样性主要由于扩散 即进行二次扩散 而不是迁入造成≈ ∀用⁄ 指纹谱研究苜蓿切叶蜂Μεγαχηιλεροτυνδατα生殖策略 证实每巢中的后代基本上来自单一雌性 而且在多数情况下雌性只与单一雄性交配≈ ∀##昆虫知识∞ × ≤ • ∞⁄ ∞荻草谷网蚜属的Σιτοβιονµισχαντηι和Σφραγαριαε在南亚和欧洲有两性生殖阶段 在澳洲仅有孤雌生殖∀• 等用微卫星多态性研究表明这两种蚜虫的新西兰种群中基因型非常少 其中有来自澳洲和亚洲迁入的个体∀同时从进化的角度解释了蚜虫两种生殖方式的关系≈ ∀ ∏等用微卫星位点多态性研究冈比亚按蚊由于山谷而使两侧的种群缺乏基因交流 导致了种群的分化≈ ∀2.4 生物防治非洲舌蝇是非洲锥虫的中间寄主∀由于非洲锥虫是人类和家畜几种极其危险热带病的病原 因此非洲舌蝇成为第一个尝试用遗传学方法进行控制的昆虫 运用⁄ 指纹谱技术分析了舌蝇不同家系的遗传关系 以帮助进行舌蝇生物防治的设计≈∀2.5 特定基因的标记和≤ 用导致抗性产生的酯酶 基因的探针研究不同地区的库蚊Χυλεξπιπιενσ证明此基因的扩增具有单一的起源 通过迁飞扩散到不同地区≈ ∀ 等用含有绝大部分∞ 基因的探针来确定Μεγαχηιλεπερσιχαε抗药性酯酶基因在染色体上的位置≈∀ƒ 等根据Μ νιχοτιαναε和Μ περσιχαε的∞ 和ƒ∞ ⁄ 的序列及侧翼区限制性酶切图的分析 推断抗性基因在Μ περσιχαε中形成 通过与Μ νιχοτιαναε的杂交而转移到后者并在后者种群中扩散≈ ∀3 讨论3.1 目前多位点标记多是通过计算样品间的相似性指数 ¬ 和遗传距离 然后进行聚类来分析遗传关系∀大多数情况下 无法进行遗传关系的显著性检验 所得到的结果仅是相对遗传关系 同时无法进行种群遗传结构 迁移!选择!漂变 的定量分析∀而单位点标记可定量分析种群是否符合 • 平衡或 平衡用ƒ统计量 ƒ !ƒ !ƒ 可考察不同地理种群间是否有基因交流及种群的遗传结构模式∀多位点标记的分析及计算需进一步研究 使其结果能进行统计检验∀3.2 多位点标记和单位点标记的多态性实质上分别反映了核苷酸序列的多态性和基因座上等位基因的多态性∀在研究中可根据所针对的问题来选择所采用的分子标记方法∀如需考察相对性关系 可用多位点标记∀若要较为准确地了解种群内或种群间基因交流的程度 则应采用单位点标记∀参 考 文 献• ∂ ≥ × Νατυρε316: ∗• ∏ √ εταλ ΝυχλειχΑχιδΡεσεαρχη 18 ∗• ≤ ΝυχλειχΑχιδΡεσεαρχη 18∗∏ ∂ ° ∞∏• ° ∞ Αµ ϑ Ηυµ Γενετ 44∗° ° Σχιενχε 257 ∗ ° ° ΝυχλειχΑχιδσΡεσ 21: ∗° ∏• ÷ εταλ ΝυχλειχΑχιδσΡεσ22 ∗° ≥ • ⁄ ≤ ƒ ΙνσεχτΜολΒιολ 2 ∗≥ ≠ ΙνσεχτΜολ Βιολ 3∗≥ √ ƒ ° ° ⁄ ΑννΕντοµολ Σοχ Αµ 89 ∗≤ ≥ √ ΙνσεχτΜολ Βι2ολ 6 ∗∂ ⁄ ≤ ⁄ ϑ Μολ Εϖολ 41:∗ƒ √ ≤ ΑχταΠηψτοπατηολ ετΕντο2µολ Ηυνγαριχα 25 ∗≤ ° ° ƒ Ανν Εντ Σοχ οφΑµ86 ∗√ ° ≥ ≥ ∏ εταλ Γε2νοµε 38 ∗≥ ƒ √ ≥ ΙνσεχτΜολ Βι2ολ 8 ∗杨效文 张孝羲 陈晓峰等 植物保护学报 26∗# #昆虫知识 ∞ × ≤ • ∞⁄ ∞杨效文 张孝羲 陈晓峰等 昆虫学报 42 ∗° × ≥ ≥ ⁄ εταλ Ανν Εντ Σοχ Αµ 82 ∗× ≤ ° ∏ ⁄ Γε2νοµε 37 ∗∏ ⁄ ∏ εταλ Μολ Εχολ 8 ∗⁄ ° ≥ × ≤ √ εταλ ΙνσεχτΜολ Βιολ 3 ∗Γενοµε 35 ∗ • ≤ ≤ ≥∏ ∏ ° ⁄ ƒ Μολ Εχολ8 ∗∏ ∏ • • εταλ ΙνσεχτΜολ Βιολ 8 ∗ΙνσεχτΒιοχηεµ Μολ Βιολ23 ∗≤ Νατυρε 350 ∗ ≥ ƒ εταλ Ηερεδιτψ 75: ∗ƒ √ ≥ ƒ εταλ ΙνσεχτΜολ Βι2ολ 3 ∗##昆虫知识∞ × ≤ • ∞⁄ ∞。
昆虫鉴定目录第一节园艺昆虫十目及有关科鉴别第二节鳞翅目重要科鉴别第三节鞘翅目、同翅目重要科鉴别第一节昆虫十目及有关科鉴别一、昆虫分类的意义1、定义：昆虫分类是根据不同昆虫的形态特征、生物学特性、生态、生理特性等方面的异同，通过分析、对比、归纳、综合等手段，把种类繁多的昆虫加以分门别类。
总结类群间的亲缘关系，反映昆虫进化过程建立分类系统。
2、意义（1）昆虫分类是认识昆虫的一种基本方法：有了昆虫分类系统，就可以认识昆虫，如建立昆虫分类检索表，并借助予这一‘字典’‘工具书’去查找昆虫的分类地位，叫出它的名称。
（2）昆虫分类是昆虫学研究的基础：昆虫种类的鉴定是植保工作开展的前题，无论是害虫的防治，还是益虫的利用，都需要在种名确定后，去查阅有关科学文献，了解前人的工作经验和研究进展，作为自已植保工作开展的参考。
二、分类的阶元和命名昆虫属动物界节肢动物门、昆虫纲，纲以下又可分为目、科、属、种共七个主要分类阶元。
从界到种，均可设亚级，如亚门、亚科等。
物种是分类的基本阶元，种的定义是繁殖单元，即不同种之间存在生殖隔离。
界：动物界Animalia门：节肢动物门Arthropoda纲：昆虫纲Insecta目：直翅目Orthoptera科：蝗科Locustidae属：飞蝗属Locusta种：飞蝗Locusta migratoria L亚种：东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis Meyen三、昆虫纲分目Order 目World 世界China 中国Subclass Apterygota无翅亚纲Thysanura 缨尾目600 21Diplura 双尾目600 51Protura 原尾目650 199Collembola 弹尾目5000 289 ubclass Pterygota: Ephemeroptera 蜉蝣目2200 306Odonata 蜻蜓目3500 738 Division Exopterygota Plecoptera衤责翅目2300 374有翅亚纲外翅部Grylloblattodea 蛩蠊目251Order 目World 世界China 中国Orthoptera 直翅目23000 2256 Phasmatodea虫脩目2500 221 Dermaptera 革翅目1850 284 Embioptera 纺足目200 7 Blattaria 蜚蠊目4000 366 Mantodea 螳螂目2000 165 Isoptera 等翅目3000 538 Zoraptera 缺翅目25 2 Psocoptera 啮虫目4500 1656 Mallophaga 食毛目4500 934 Anoplura 虱目500 104 Homoptera 同翅目45000 6885 Heteroptera 半翅目38000 3873 Thysanoptera 缨翅目6000 489 有翅亚纲内翅部Order 目World 世界China 中国Neuroptera 脉翅目4500 645 Megaloptera 广翅目500 74 Mecoptera 长翅目500 194 Lepidoptera 鳞翅目200000 18985 Trichoptera 毛翅目10000 987 Diptera 双翅目110000 104 Siphonaptera 蚤目3000 617 Hymenoptera 膜翅目120000 8796 Coleoptera 鞘翅目330000 18794 Strepsiptera 捻翅目400 19Total 79313四、昆虫十大目及重要科鉴定（一）园艺昆虫分目依据1、翅的有无；翅的类型、数目、翅脉脉相；2、口器类型；3、变态类型；4、触角、足类型等。
