谈谈生物药物分析方法
—现状与发展趋势
药物制剂0301 许敏华 3031901053
摘要：本文对生物药物分析方法进行了较全面的阐述，并对近年来生物药物分析的新方法、新技术的进展及应用前景进行探讨。
关键词：生物药物分析
生物药物包括直接从生物体分离纯化所得生化药物及利用基因重组技术或其它生物技术研制的生物技术药物及生物制品[1]。由于生物药物具有毒性低、副作用小、易被吸收的特点，同时具有多方面的生物活性及功能，在疾病的预防、诊断及治疗方面有着突出贡献。随着人们对生命本质及身体健康的日益关注，生物药物的研究和开发日趋增加，控制生物药物的质量，加强药物分析检测技术日益受到重视。本文将对用于生物药物的鉴别、检查和含量测定的方法进行分析比较，并对近年来生物药物分析的新方法、新技术的进展及应用前景进行探讨。
一．生物药物分析方法
生物药物分析主要包括化学方法、仪器分析方法和生物检定法。
1．化学法
化学法包括重量法和滴定法
重量法：指待测物经处理后分离出与待测组分相关的单质或化合物，根据其质量，确定该组分的含量。硫酸软骨素的测定及胰酶中脂肪含量的测定均采用重量法[2]。
滴定法：指利用化学反应定量关系，根据消耗标准溶液的体积确定待测物的含量。目前滴定法在我国药典中仍占有一定的比例，氨基酸类和糖类药物多用滴定方法进行含量测定[3]。
化学方法主要用于常量分析，准确度较高，但操作繁琐，耗时较长，不利于实现自动化，在药典及近年来的研究中有所下降。而仪器分析方法的研究、应用与改进则是生物药物分析的热点。
2．仪器分析方法
仪器分析方法用于微量和痕量分析，灵敏度较高。主要包括光学法、电化学法、色谱法、电泳法、酶法、免疫法。
2．1光学法
在生物药物分析中常用的光学分析方法有：紫外/可见分光光度法、荧光法、红外吸收分光光度法、核磁共振、质谱等。
紫外/可见分光光度法：主要是利用生物大分子中的某些基团对特定波长具有光吸收作用或某些特殊基团可与某些化学试剂反应生成稳定的颜色，根据吸收光的波长及强度对物质进行定性定量分析。紫外/可见分光光度法由于其设备简单，价格低廉，操作方便易于普及等特点在药物分析中应用很广泛。测定的药物涉及蛋白质多肽类、酶类、抗生素、维生素及嘌啉类药物的测定[4，5]。但紫外/可见分光光度法灵敏度不高，一般可达10－4～10－7g/mL。
荧光法：利用某些基团在吸收了能量以后能够发射出一定波长的荧光等性质，对物质进行定性定量分析。近年来镧系敏化发光的方法在对氨基酸、肽类、蛋白质、核酸、核苷酸、脱氧核苷酸等的分析及药代动力学的研究中应用较为广泛[6]。荧光法灵敏、准确、选择性好、荧光特性参数多，动态线性范围宽、灵敏度比分光光度法高2～4个数量级，对微量和痕量
药物进行灵敏准确的检测具有较大的优越性。激光诱导荧光光谱的灵敏度已达10－22g，实现了检测单个分子的水平，可用于癌症的早期诊断[7]。荧光法作为一种高灵敏的分析手段，与其它技术相结合，有着更广阔的发展前景。
红外光谱法在我国药典中主要用于生物药物的鉴别和活性成分的分析，目前近红外光谱法是红外分析研究的热点，它具有光谱信息量大，稳定性及重复性好，不需样品制备，无化学废料污染等优点，在药品生产过程中可全面监控整个生产周期的产品质量，在21世纪有很好的应用前景[7,8]。
核磁共振波谱是测定生物大分子结构的有力手段，二维及三维核磁共振波谱仪应用于生物工程中蛋白质的三维结构分析[7]。质谱法用于对基因工程药物多肽、蛋白质、核酸等的分子量测定及结构和序列的证实[9]。
2．2色谱法
色谱法是利用物理或物理化学性质对混合物进行分离分析的方法。
薄层色谱法是药物色谱领域中的重要分支之一，是一种定性和半定量的方法，在自动化程度、分辨率及重现性等方面不如气相色谱法和高效液相色谱法。薄层色谱法主要用于药物的鉴别、杂质检测，如氨基酸类药物（丝氨酸、亮氨酸和甘氨酸）、酶类（抑肽酶）、蛋白质多肽类（杆菌肽）、嘌呤类（硫唑嘌呤、巯嘌呤）的鉴别等[10，11]。近年来薄层色谱法大力加强标准化、仪器化和自动化改进，如应用自动点样仪，自动程序多次展开仪，薄层扫描仪等，引入强制流动技术，使薄层色谱法的重现性、准确度和精密度有大幅度提高[7]。
气相色谱法（GC）：对含有挥发性成分的药物，气相色谱仪是常用的分析工具。美国药典中氨基酸等药物中有机挥发性杂质的检查采用气相色谱法。在药品中残留的有机溶剂的毒性和致癌作用日益引起人们的重视，用气相色谱测定药品中有机溶剂的残留量也是目前值得重视的研究方向。采用 GC-MS-SIM可测定药物浓度至10－9～10－12g/mL的体液样品[7]，在体内药物分析、药物动力学研究等方面具有较强的优势。
高效液相色谱法（HPLC）：HPLC具有高压、高速、高效、高灵敏度等特点，在目前生物药物的鉴别、检查和含量分析中占有重要地位[12]。随着衍生化技术的发展，改善了被测物的检测特性，提高检测灵敏度，使HPLC已广泛用于氨基酸的分析[13]；HPLC也是蛋白质结构和纯度分析的重要工具，英国药典和美国药典对胰岛素的鉴别和效价测定及其中相关蛋白的限量测定均采用HPLC方法，我国药典中HPLC仅用于鉴别；对于嘌呤类药物甲氨喋呤与叶酸以及糖类药物美国也多已应用HPLC进行含量分析。近年来由于检测器的发展，如蒸发光散射检测器的应用拓展了对无近紫外吸收的药物的分析，二极管阵列检测器、荧光检测器的应用提供了一种快速有效的高灵敏度的方法。HPLC采用蒸发光散射检测器直接检测非衍生化的氨基酸[8]，配合HPLC的分离定量，检测限达到了ng 级，回收率为94％。液相色谱与质谱的联用在生物大分子、体内药物代谢和临床药物检测中应用日益增多，多维色谱LC-LC-MS,LC-LC-LC-LC-MS-MS等用于药物、蛋白质、多肽结构测定，并使整个操作完全自动化，是21世纪色谱分析的发展方向之一。微柱液相色谱由于分析所学的样品用量及流动相的消耗大大下降，检测灵敏度大幅度提高，具有广阔的发展前景。
超临界流体色谱法（SFC）:是以超临界流体作流动相进行分析的一种色谱技术，适用于热稳定性差、极性大和挥发性小的药物分析，是GC和HPLC的重要补充技术。SFC在分析激素、抗菌素和依赖性药物时，只用CO2作流动相就将结构相近的物质分开，并用于尿中咖啡因和激素的测定，在分析一个含多个极性基团，分子量达440的抗菌素时不需衍生化，可直接进样分析[14]；Bargman等用SFC研究一系列选光性的β－阻抗剂的分离与分析，以分子模型为基础，提出了手性识别机理。由于超临界流体色谱法不用或很少用有机溶剂，是一种符合环保要求的分析方法。
2．3电泳法
