查尔酮异构酶简介

异黄酮合成代谢调控关键酶CHS、CHI的特性与研究前景第26卷第5期2007年1O月大豆科学SOYBEANSCIENCEV oI_26No.5Oct.2007异黄酮合成代谢调控关键酶CHS,CHI的特性与研究前景李莉,孙欣.,马君兰,赵越(1.东北农业大学,哈尔滨150030;2.黑龙江省农业科学院大豆研究所,哈尔滨150086)摘要查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)与查尔酮异构酶(Chalconeisomerase,CHI)是异黄酮合成途径中的两个关键酶,它们在植物中的表达效率直接影响到异黄酮的产量.本文综述了植物CHS,CHI的功能,特性,基因结构,进化以及基因表达调控等方面研究的新进展,并对CHS,CHI研究的应用前景进行了展望,在此基础上提出了从根本上提高异黄酮产量的可行途径以及一些亟代解决的问题.关键词异黄酮;查尔酮合酶(CHS);查尔酮异构酶(CHI)中图分类号Q814文献标识码A文章编号1000—9841(2007)05--0762--04 PROGRESS0NKEYENZYMESCHS,CHIOFISOFLAV0NESSYNTHESIZELILi,SUNXin",MAJun—lan,ZHAOYue(1.NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030:2.SoybeanResearchInstituteofHeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences,Harbin150086)AbstractChalconesynthase(CHS)andChalconeisomerase(CHI)arethekeyenzymesinisof ia—vonessynthesize,andvariationoftheirexpressionmightaffectthecontentofisoflavones.Th efunction,character,genestructure,geneevolutionandexpressioncontrolofCHSandCH1we resummarizedinthispaper.TheapplicationforegroundofCHSandCH1werealsoprospected, andthemeanstoincreaseisoflavoneswereadvised.KeywordsIsoflavones;Chalconesynthase(CHS);Chalconeisomerase(CHI)异黄酮(Isoflavone)是植物生长过程中形成的次生代谢产物,是生物黄酮中的一种,也是一种植物雌激素,主要是指以3一苯并吡喃酮为母核的化合物,动物体内不能合成.它主要包括大豆黄素(Daidzein),染料木素(Genistein),6一甲氧大豆素(Glycitein)三种游离型甙元和它们的九种葡糖苷.收稿日期:基金项目:作者简介:通讯作者:2006—12—30黑龙江省教育厅资助课题(10551024)李莉(1977一),女,硕士研究生,研究方向植物生理生化.赵越,E—mail;yuezhao一**************;Tel1393613,1116大量的实验表明:异黄酮在植物体内可作为保护性物质,保护植物正常生长,抵制病虫侵害;在动物体内能降低胆固醇,预防癌症,预防骨质疏松,促进繁殖,泌乳和生长等,显示了异黄酮可以作为动物生长的调节剂和促进剂,使其成为动物营养学的研究热点之一[.然而,在自然界中异黄酮的资源十分有限,只局5期李莉等:异黄酮合成代谢调控关键酶CHS,CHI的特性与研究前景限于豆科的蝶形花亚科等极少数植物中,如大豆,墨西哥小白豆,苜蓿和绿豆等植物中,其中异黄酮含量最高的只有苜蓿和大豆(故称为大豆异黄酮),在含量最高的大豆中所含的异黄酮也仅为0.1～0.5.因此研究异黄酮合成的关键酶基因的表达规律,不但可以在分子生物学领域找到提高异黄酮相对含量的方法,而且在深入利用异黄酮资源方面具有极大的应用价值.异黄酮的生物合成途径是研究最早且较深入的次生代谢途径之一,大量研究已经大体揭示了异黄酮生物合成途径(图1):对香豆酸辅I~A(4?Coumaryl-CoA)丙二酰辅酶A(Malonyl—CoA) HS)查尔~j(Chalcone)l查尔酬异构酶(CHI)'类黄flleJ(Flavones)图1植物体内异黄酮合成代谢的一般途径Fig.1Thegeneralpathwayofisoflavone synthesisandmetabolisminplant从图上可知:异黄酮合成途径是植物类黄酮代谢途径的一个分支,部分参与异黄酮合成的酶与参与其它类黄酮类物质(如花色素苷元等)合成的酶相互交叉.其中特别值得提出的是CHS和CHI,作为异黄酮合成途径中的两个关键酶,其表达量的改变或表达功能的丧失及酶的失活都将直接影响到黄酮类代谢产物的量j,所以越来越多的人把目光集中在这两种酶的研究上.1CHS,CHI研究的新进展1.1查尔酮合酶(或苯基苯乙烯酮合酶.Chaleone synthase,CHS)1.1.1CHS蛋白的基本功能CHS蛋白为类黄酮合成途径中的第一个特异性酶,它不需要辅助因子,在特定物种中,CHS蛋白和一个依赖NADPH的还原酶协同作用,催化该途径的第1步反应,即1分子4一香豆酰一CoA与3分子丙二酰一CoA缩合形成查尔酮(又称苯基苯乙烯酮,Chalcone).查尔酮为其它类黄酮(如花色素苷元,异黄烷酮,黄酮醇等)合成提供基本骨架,所以说CHS蛋白催化的反应是整个类黄酮合成途径的重要限速步骤.1.1.2CHS蛋白的基本特性对CHS蛋白的X射线衍射,表明该酶是一个同源二聚体蛋白,有2个功能互相独立的亚基,每个亚基的分子量为4O～45 kDaEs].不同植物问,CHS蛋白氨基酸同源性一般在85以上,表明不同植物的CHS蛋白具有高度的保守性,而这种一级结构的高度的保守性,也说明了不同植物的CHS蛋白功能的高度一致性.比如,被子植物和松柏科植物间CHS蛋白的氨基酸序列同源性高达9O.1.1.3CHS基因的结构CHS基因是世界上第一例从经紫外线辐射的欧芹(Petroselinumhor—tense)悬浮培养细胞中分离的类黄酮生物合成基因],目前EMBL数据库中有来自于19个科8O多个CHS基因编码区全序列.不同植物之问,CHS基因的编码区比较保守,长约1.2kb,不同科问DNA的同源性达6O以上. CHS的基因结构也非常保守,据报道除金鱼草的一个CHS基因AMCHS含有两个内含子外],其余的都只有1个内含子,而且这个内含子的位置在已发现的序列中均相同,即位于第65位(以欧洲赤松的PSCHS为标准)的半胱氨酸密码子内第1和2 位碱基之间,其长度从几十碱基对到几千碱基对不等.外显子I编码约57～64个氨基酸,外显子2编码约340个氨基酸,对CHS基因外显子2氨基酸序列进行排序,结果表明,CHS基因的外显子2比较保守,没有大的插入,缺失突变,科间氨基酸同源性一般在7O以上【6j.不同植物之间,CHS基因拷贝数目差异很大],而且功能上存在明显差异.如,金鱼草和拟南芥的基因组中都只含单个的CHS基因拷贝,菜豆有6～8个,水生三叶草至少有9个,矮牵牛中有12 个,非洲菊中有3个.同一植物体内虽然也存在CHS多个编码基因,但在不同品系中的表达活性不同.如:Pinusstrobus中的CHS1和CHS2基因编码的蛋白质有88的同源性,但CHS1催化查尔酮合成,CHS2催化二酮基CoA与甲基丙二酰CoA 的缩合反应;矮牵牛中至少有8个CHS基因,有的品系有一个基因表达活性高,有的品系有2个基因表达活性较高.1.1.4CHS基因的进化CHS基因是一个多基因家族,依据类黄酮物质存在与否,推测该基因最早出现在藓类,在CHS基因的进化中基因重复一分歧大豆科学5期(duplication—divergence)是经常发生的事件.攀枝花苏铁的两个克隆CPAI和CPAS分布在相距很远的分支中,说明CHS基因的重复在裸子植物就已经发生,依据已有数据,欧芹,拟南芥和金鱼草中似乎都只存在一个拷贝,而在其他物种中均有多个, 其中豆科的拷贝数最多,但在分支图上,豆科的27 个序列却只形成一组,即这些序列重复发生在豆科分化之后.以上分析说明CHS基因在不同的科中发生的重复和丢失的情况不同,因此,很难确定直系同源的CHS基因成员,从而很难用此基因进行被子植物科间系统发育的研究.1.1.5CHS基因的表达调控CHS基因的表达能被光照[,生理钟【1..,低温"],BA和GA5],脯氨酸及碳水化合物,P蛋白[1等所调节.CHS基因的表达也是与其它基因相互作用的结果,如FIN2,FJN5基因的突变导致CHS表达受损伤口,而L兀厂Tl和ICXI基因的突变则导致CHS基因表达水平的提高口引.1.2查尔酮异构酶(或查尔酮一黄烷酮异构酶, Chalconeisomerase,CHI)1.2.1CHI蛋白的基本功能CHI蛋白是第一个被认识的与类黄酮合成相关的酶,它催化分子内环化反应,通过选择性地连接一个在结构上有益于闭环的离子化的查耳酮,使双环的查耳酮变为有生物学活性的三环的(S)一黄烷酮,即形成第1个类黄酮产物.CHI催化活性具有pH依赖性,在pH7.5时,其催化活性为90,而在pH6.0时,其催化活性则为50L1.这一步反应也可以在没有CHI蛋白的条件下在植物体中缓慢自发进行.1.2.2CHI蛋白的基本特性CHI蛋白以单体的形式普遍存在于大多数植物中,分子量因植物组织而异,约24～29kDaL1.通过比较发现,不同植物CHI蛋白的氨基酸序列同源性在50以上,存在明显差异,但这一差异集中在靠近N端与C端的部分氨基酸残基上,这说明在整个进化过程中,CHI蛋白的进化是趋于保守的.CHI蛋白的1.85A分辨率晶体结构显示,它具有一个奇怪的口一三明治折叠,这种三维结构的特异性可能与其催化活性的立体化学特异性有关,活性位点裂口的拓扑学效应限制了环化反应的立体特异性L1.CHI基因序列家族及其蛋白的这种三维折叠结构在植物中具有唯一性,已被建议作为植物特有的基因标记【1.1.2.3CHI基因的结构CHI基因在多种植物中被克隆(已克隆的CHI基因信息可在NCBI的主页上获得),具有较高的同源性,约499/6～809/6[3].植物中的CHI基因家族主要分为两大类[1:TypeI类CHI基因编码的酶蛋白只能将查尔酮异构化为(2S)一黄烷酮;TypelI类CHI基因编码的酶蛋白除了具有TypeI类的功能外,还能将6,_脱氧查尔酮异构化为(2S)一5一脱氧黄烷酮,它主要存在于豆科植物中.现在把在真菌和细菌中发现的,与植物CHI基因直向同源(orthologous)的CHI基因[1,归为TypeIII.在研究矮牵牛的CHI时发现,它含有两个CHJ基因,CHJA(AF233637)和CHJB(Xl4590). CHIA全长726bp,编码241个氨基酸L2叩;CHIB全长2l70bp,编码220个氨基酸.CHIA基因编码区上游存在两个启动子PAl和PA2,PAl和PA2在不同矮牵牛花组织中具有不同的驱动活性.PAl启动子在花冠组织中驱动CHIA表达,而PA2启动子仅在花药发育后期和花粉粒组织中启动CHJA ¨.CHIB只有一个启动子,仅仅在花药发育早期(未成熟的花粉组织)驱动CRIB基因表达.此外, CHIA和CRIB基因启动子区域有37bp的高度保守的DNA序列.1.2.4CHI基因的表达调控研究发现,CHI酶蛋白的积累与消失受光调控和紫外辐射诱导,并与CHS蛋白的积累存在协同性L2...另外,CHI也受P 蛋白的影响口引.实验表明,这种协同积累效应是因为CHI基因和CHS基因mRNA协同表达的结果....2研究前景大豆起源于中国,我国大豆的种质资源十分丰富.近几年,我国的科技界对于大豆蛋白,大豆磷脂,大豆低聚糖等成分的研究已逐渐深入,与国际上相关的研究与交流也比较多,但对于大豆异黄酮这一国际新热点的研究,却远远落后于欧,美,日本等国.它的研究的深入开展及成果的推广应用,将对我国相关方面的研究有极大的推动作用,并可以带来巨大的社会与经济效益L2引.改良栽培环境,贮藏条件,加工工艺等,这些方法确实在某些程度上提高了大豆异黄酮的含量,但不是从根本上提高其产量的方法.随着细胞生物学和分子生物学的不断发展,越来越多的研究者把工作重点转移到以为基础的生物技术上来,以期望在5期李莉等:异黄酮合成代谢调控关键酶CHS,CHI的特性与研究前景765 提高异黄酮类次生代谢物的产量的同时降低成本,主要表现在其代谢关键酶的分子克隆及基因工程方面L2,这也已经成为生命科学的一个新生长点.进一步了解对CHS,CHI特异性基因的结构特点,克隆,测序,作用机制,表达部位和时空表达模式的研究,将利于进一步研究它们的基因表达调控机理,同时也为更好的改造这些基因,进而改变它们的表达活性,富集特定目的次生代谢产物——异黄酮提供更多的基础资料.若能同时增强多个基因的协同表达则是提高异黄酮产量的捷径.人们在研究中发现,cHs基因和cH基因的表达在很多方面确实具有协同性,如它们同时受转录因子P蛋白的影响,转录因子P蛋白就充当了"分子开关"的作用,随着分子生物学的不断发展,在各国科学研究工作者的共同努力下,这些问题终将会得到解决,也将为异黄酮类次生代谢产物的研究开拓新的途径.参考文献[1][2][3][4][5][6][7][8]谷利伟,谷文英,过世东.新型生长调节剂——异黄酮类植物雌激素[J].饲料添加剂,2000,21(12):26—28. 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胀果甘草查尔酮异构酶基因的克隆及序列分析尹彦超;张晓冬;马永生;周姗;高智强;胡婷;刘颖【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2017(28)3【摘要】目的:对胀果甘草甘草苷生物合成途径的关键酶查尔酮异构酶(CHI)进行基因克隆及序列分析.方法:根据乌拉尔甘草CHI基因cDNA序列设计引物,以胀果甘草主根总RNA为模板RT-PCR扩增CHI基因cDNA序列,并对其进行分析.结果:克隆得到20条胀果甘草CHI基因eDNA序列,开放读框全长690 bp,编码229个氨基酸残基.20条胀果甘草CHI基因的cDNA序列存在22个变异位点,一致性为99.54％,可分为6种单倍型;其编码的氨基酸序列存在14个变异位点,一致性为98.98％.胀果甘草CHI基因编码蛋白为稳定性亲水蛋白,相对分子质量为24.5× 103,等电点为5.3～6.2,不合信号肽,无跨膜区,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,保守结构域包含一个查耳酮超家族结构域.同源性分析显示,不同物种间的CHI基因同源性较低.结论:克隆了胀果甘草CHI基因cDNA序列,为进一步研究不同基原甘草中甘草苷生物合成的分子调控机制奠定了基础,并为优质甘草的分子选育提供了理论依据.%Objective:To clone and analyze the chalcone isomerase(CHI) gene from Glycyrrhiza inflata Bat..Methods:Specific primers were designed based on reported CHI cDNA sequence of G.uralensis,RT-PCR technique was used to amplify CHI cDNA sequences of G.inflata,and which were analyzed by bioinformatics.Results:Twenty CHI cDNA sequences ofG.inflata with the length of 690 bp were obtained encoding 229 amino acid residues.Twenty-two variable sites were found in these 20 cDNAsequences and 6 haplotypes werc determined,with a similarity of99.54％.Physicochemical property ananlysis shows that these CHI coding protiens are all stably hydrophilic protein,with a molecular weigh of 24.5 kD and a isoelectric point between 5.3～6.2.It has no signal peptides or transmembrane domains.Its secondary structure mainly consists of alpha helix and random coil.Also chalcone super family domain is included in the conserved domain.Homology analysis indicates that the homology of CHI among different species is low.Conclusion:CHI cDNA sequeces were successfully cloned from G.inflata.We hope this work will lay a foundation for further researches on the molecular mechanisms of flavonoid biosynthesis in different licorice origins and licorice molecular breeding.【总页数】7页(P274-280)【作者】尹彦超;张晓冬;马永生;周姗;高智强;胡婷;刘颖【作者单位】北京中医药大学中药学院,北京100102;北京中医药大学中药学院,北京100102;北京中医药大学中药学院,北京100102;北京中医药大学中药学院,北京100102;北京中医药大学中药学院,北京100102;北京中医药大学中药学院,北京100102;北京中医药大学中药学院,北京100102【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.油橄榄查尔酮合酶与查尔酮异构酶基因全长的克隆及序列分析 [J], 陈文拴;黄乾明;陈华萍;杨泽身;王安逸;苏光灿2.“冷俊”槭查尔酮异构酶基因(CHI)片段克隆及序列分析 [J], 尹燕雷;苑兆和;招雪晴;冯立娟;李芹3.胀果甘草查尔酮合成酶基因cDNA的克隆及序列分析 [J], 梁玉玲;姚红宝;曲占良;许恒飞4.光果甘草查尔酮异构酶基因的克隆及序列分析 [J], 张晓冬;尹彦超;周姗;马永生;胡婷;高智强;刘颖5.花生查尔酮异构酶基因的克隆及其序列分析 [J], 温世杰;邱金梅;刘海燕;朱方何;王文皓;梁炫强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

专利名称：一种海南龙血树查尔酮异构酶DcCHIL1及其编码基因和应用
专利类型：发明专利
发明人：朱家红,赵婉,梅文莉,戴好富,彭世清,王辉
申请号：CN201710334743.6
申请日：20170512
公开号：CN107190016A
公开日：
20170922
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种海南龙血树查尔酮异构酶DcCHIL1及其编码基因和应用。

该基因的核苷酸序列包括：(a)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或(b)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或(c)与(a)或(b)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述的查尔酮异构酶DcCHIL1其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；或为SEQ ID NO:2经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成具有同等功能的氨基酸序列。

本发明首次克隆得到海南龙血树查尔酮异构酶DcCHIL1基因，得到的DcCHIL1蛋白具有查尔酮异构酶活性，利用生物技术将该基因转入海南龙血树中可以提高海南龙血树类黄酮积累和血竭的产量，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。

申请人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所
地址：571101 海南省海口市龙华区学院路4号
国籍：CN
代理机构：北京创遇知识产权代理有限公司
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文献[2]
植 物 表示形成活性部位的核心区域:三角符号表示可能涉 及到的与底物特异性结合相关的位点[4]。
型 氨 基 酸 多 序 列 比 对
CHI
由表1可见,不同植物CHI 基因全长、开放阅读框碱 基数及其所编码的CHIB 氨基酸残基数相差较小, 且编码区的起始密码子均 为ATG,而终止密码子则 不一致,洋葱和豌豆的是 TGA,番茄和茶的是TAA。 同时,不同植物CHI的分子 量、等电点、摩尔消光系 数、酸性氨基酸比例、碱 性氨基酸比例、带电氨基 酸比例、极性氨基酸比例、 疏水性氨基酸比例等理化 指标均表现出一定的差异, 这表明CHI基因可能存在 一定的物种特异性和生化 多态性;含量最丰富的氨 基酸也不完全相同,但至 少都含有Lys,说明Lys在 CHI的催化反应中起着重 要作用[3]。
文献[3]
参考文献： [1]李莉,孙欣,马君兰,赵越. 异黄酮合成代谢调控关键酶CHS、CHI的特性与研 究前景[J]. 大豆科学,2019,05:762-765. [2]周发俊,王逸群,陈由强. 植物查尔酮异构酶分子生物学研究进展(综述)[J]. 河 北科技师范学院学报,2019,01:73-77. [3]雷桅,邹祥,向阳,汤绍虎,孙敏. 植物查尔酮异构酶的生物信息学分析[J]. 北方 园艺,2019,02:193-197. [4]吴冰,祝钦泷,郭余龙,眭顺照,皮伟,李名扬. 查尔酮异构酶基因的分子特征及 其在基因工程中的应用[J]. 植物生理学通讯,2019,01:175-181.
一、CHI的基因序列研究:
按查尔酮异构酶作用底物不同，可将其基因分为2类。一类存在于非豆科 植物，其编码的CHI仅能催化6’-羟基查尔酮转化为5-羟基黄烷酮（Tape Ⅰ）；另一类存在于豆科植物，其编码的CHI能催化6’-羟基查尔酮和 6’-脱氧查尔酮转化为相应的5-羟基黄烷酮和5-脱氧黄烷酮（Tape Ⅱ） [3]。 研究发现 CHI隶属超基因家族，通常由 一到多个基因编码。已经识别的 典型 CHI基因通常包括 4个外显子和3个内含子，在不同种类的植物相似 程度较高。在矮牵牛中已经发现的两类CHI基因具有不同的时空表达模式， CHIA在所有花组织以及 UV处理的幼苗中表达，而 CHIB仅在未成熟的花 药中表达。在玉米中也发现 3个编码CHI 的基因，其中一个编码 24.3KDa 的基因(ZmCHI Ⅰ)，与矮牵牛 CHIA和 CHIB的同源性分别达到55%和 58%[4]。

3.2 催化反应发生过程及分子机理
CHI 催化的分子内环化反应需要底物具有 2’位羟基，反应开始于对底物查尔酮 2’-羟基 的去质子化，产生的 2’-氧负离子对 α,β-不饱和双键的 β-碳原子进行亲核攻击，产生 2'-酸性 在 pH7.5 时， CHI 催化 4,2’,4’,6’羟基基团 （图 3） 。 CHI 催化的这种环化反应是 pH 依赖的[19]， 四羟基查尔酮、 4,2’,4’-三羟基查尔酮、 2’,4’-二羟基查尔酮的催化活性达到 90%以上， 而 4,2’二羟基查尔酮很低的环化效率也反映出它的 2’位羟基基团的高 pKa 值。在 pH6.0 时，CHI 催化 4,2’,4’,6’-四羟基查尔酮、 4,2’,4’-三羟基查尔酮的催化活性只有 50%， 而 CHI 催化 2’,4’二羟基查尔酮和 4,2’-二羟基查尔酮的催化活性更低。比较 CHI 与 7,4’-二羟基黄烷酮、7-羟 基黄烷酮和 4’-羟基黄烷酮复合物的晶体结构，显示所有的 7-羟基黄烷酮都有共同的结合方 式，而 4’-羟基黄烷酮则结合在活性部位的另一侧[19]。
4. CHI对黄酮代谢的调控
研究表明 CHI 是黄酮代谢途径中一个很重要的关键酶， 降低 CHI 酶活性或 CHI 突变体 能导致植物中查尔酮大量积累，黄酮化合物的含量显著降低。如：降低翠菊（C.chinensis）
-4-

[23]
、康乃馨（Dianthus caryophyllus）[24]、仙客来（Cyclamen persicum）[25]的 CHI 酶活性，
图 2 CHI 催化反应示意图 Overall reaction 化生成(2RS)-黄烷酮， 但只有(2S)-黄烷酮是后来的黄酮 类化合物代谢过程的中间产物，而由 CHI 催化的反应速度是自发反应速度的 107 倍，且催化 产物中 99.999%的是(2S)-黄烷酮[16]。植物中缺少 CHI 活性的突变体，如拟南芥 tt5 突变体仅 能产生很少量的类黄酮，影响种子的正常着色[17]。而若将 typeⅠ的 chi 基因转到拟南芥 tt5 突变株中使其过量表达，可以使转化株产生正常的柚皮素而使种皮颜色恢复正常[18]。

专利名称：桑树查尔酮异构酶基因及应用
专利类型：发明专利
发明人：余茂德,李军,刘长英,赵爱春,王茜龄,张琼予,金筱耘,吕蕊花,吴存容
申请号：CN201210119487.6
申请日：20120423
公开号：CN102643846A
公开日：
20120822
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一个来源于桑树的查尔酮异构酶基因的序列、克隆方法及应用。

该基因全长2112bp，含4个外显子和3个内含子，开放阅读框（ORF）全长为660bp，编码219个氨基酸，包括290bp的3′端非编码区。

该基因为植物类黄酮合成路径中的关键基因之一，采用基因工程的方法，将其导入桑树中，实现过表达，可提高桑树各组织中类黄酮的含量。

该发明还可以应用到其他植物中，改变植物体内类黄酮的含量及种类，降低从植物中提取类黄酮的成本，有利于促进类黄酮物质在医药产业中的开发利用。

申请人：西南大学
地址：400716 重庆市北碚区天生路216号
国籍：CN
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代理人：周韶红
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J Sci Food Agric 1996,71,313-330
Developmental Changes in Enzymes of Flavonoid Biosynthesis in the Skins of Red and Green Apple Cultivars
Carolyn E Lister,* Jane E Lancaster
New Zealand Institute for Crop & Food Research Limited, Private Bag 4704, Christchurch, New Zealand
and John R L Walker
Department of Plant a n d Microbial Sciences, University of Canterbury, Private Bag 4800, Christchurch, New Zealand (Received 3 July 1995; revised version received 2 November 1995; accepted 29 January 1996)
Key words : anthocyanin, apple skin, chalcone isomerase, flavonoid biosynthesis, fruit development, glycosyltransferase, phenylalanine ammonia-lyase.
INTRODUCTION The main pathway of flavonoid biosynthesis was deduced some 20 years ago using data from chemicogenetical studies (Harborne 1962) and from studies with radioactively labelled precursors (Grisebach 1965). In the past few years considerable progress has been made in elucidating the biosynthesis of flavonoids and their enzymology. With the exception of the anthocyanins, where a few reactions remain unknown, the essential steps of the biosynthetic pathway of the main flavonoid classes are now well established (Harborne 1988). The enzymes involved in flavonoid biosyቤተ መጻሕፍቲ ባይዱthesis are classed into three general groups: ( 1 ) enzymes involved in precursor biosynthesis, eg phenylalanine ammonia-lyase

厅科技项 目（ 目编号 ： ０１５ 。 项 Ｊ ３２ ） Ｂ ，通讯作者 ， ， － 男 副教授 。Ｅ ｍ ｉ ｙｑｎ ０ ａｏ．ｏ ．ｎ — ａ ： ｉｕ２ ＠ｙｈ ｏｃｒ ｃ ｌ ｎ 收稿 日期 ：０ ７１ ．９ 修改稿 收到 日期 ： ０７ １－７ ２ ０ —１１ ； ２ ０ ．２２
反应 ， 而发 生环化 。这一步骤也 可以在没有 Ｃ 的条 件下 在植 物 体 内缓 慢 自发进行 ， 从 ＨＩ 但在 Ｃ Ｉ Ｈ 催化下 可使该生 化反
应加速完成 ， 反应速率 提高了 １７ ０ 倍 。随着反应体系 中 ｐ 的不 同 ，Ｈ 的催 化效率 也有所 不 同。当 ｐ 为 ７ ５Ｃ Ｉ Ｈ ＣＩ Ｈ ． ，Ｈ 催 化活性 达到 ９ ％ ； ０ 而在 ｐ Ｈ为 ６０ ，Ｈ 催 化活性仅有 ５ ％ 。 ．时 ＣＩ ０ 对Ｃ Ｉ Ｈ 进行结 晶后经 过 ｘ光衍射发现紫花苜蓿 （ ｄ ｏｏ 口 『 的 Ｃ Ｉ ． Ｍｅｉ， ｆⅡ ｃ ｓ 矗 ） Ｈ 在立 体结构上 以及催化作用 的动态反应过 ｇ
中图分 类号 ：０ ８ ７６ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：１７ ￣９ ３ ２ ０ ） １０ ７ －５ ６２ ８ （０ ８ ０ － ３０ － ０
查尔 酮异构酶 （ｈｌ ｎ ｏ ｅ ｅＣ Ｉ Ｃ５５１６ 是首先被认识 的黄酮物质合成相关酶 … ， ｃａ ｏｅ ｓ ｒ ，Ｈ ， ．．．） ｃ ｉｍ ￣ Ｅ 也是增加黄 酮化合物 的关键酶 。黄酮 化合物是一类结构 相似的多酚化合物 ， Ｊ 大多具 有颜 色 ， 物生 长发育及 防御敌害具 有重要作用 ， 对植 对人类而 言则 具有清除 自由基 、 抗氧化 、 癌等多种生物活性 ， 抗 对肿瘤 和心血 管等疾 病的治疗 与预 防也 有重要 的药用价
２ Ｃ 催 化 反 应 机 理 ＨＩ

植物查尔酮异构酶的生物信息学分析雷桅;邹祥;向阳;汤绍虎;孙敏【期刊名称】《北方园艺》【年(卷),期】2008(000)002【摘要】采用生物信息学方法和工具对GenBank中的洋葱、豌豆、番茄和茶等植物的黄酮类化合物合成关键酶查尔酮异构酶(CHI)的核酸和氨基酸序列进行了比对、分析和建模,进而对其分子结构、理化性质、亚细胞定位、蛋白转运肽、跨膜结构域、疏水性、分子系统进化、蛋白质二级和三级结构等重要参数进行了预测和推理.结果表明:该类酶基因的全长包括5'、3'非翻译区和一个开放阅读框,无蛋白转运肽,且定位于细胞质基质,是一个疏水性蛋白,二级结构均以随机卷曲和α-螺旋为主要构件,洋葱和豌豆的CHI三维建模成功.【总页数】5页(P193-197)【作者】雷桅;邹祥;向阳;汤绍虎;孙敏【作者单位】西南大学,生命科学学院,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆,400715;西南大学药学院,重庆,400715;西南大学,生命科学学院,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆,400715;西南大学,生命科学学院,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆,400715;西南大学,生命科学学院,三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆,400715【正文语种】中文【中图分类】Q946.5;Q558【相关文献】1.油橄榄查尔酮合酶与查尔酮异构酶基因全长的克隆及序列分析 [J], 陈文拴;黄乾明;陈华萍;杨泽身;王安逸;苏光灿2.鸳鸯茉莉查尔酮异构酶基因(CHI)cDNA的克隆与生物信息学分析 [J], 曹玉婷;邱栋梁3.植物查耳酮异构酶生物信息学分析 [J], 陈克克;武雪4.狗枣猕猴桃查尔酮异构酶1(AkCHI1)的生物信息学分析 [J], 刘丹; 李然红; 陈鑫; 王立凤5.石榴查尔酮异构酶生物信息学分析 [J], 陈川;凯迪日耶·玉苏普因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

黄酮类化合物合成途径及合成生物学研究进展黄酮类化合物是来源于植物的一类重要的次生代谢产物，具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血管脆性等多种药理作用。

黄酮类化合物的主要合成途径已经研究得比较清晰，即首先合成二氢黄酮类的柚皮素或松属素，然后进一步通过分支途径合成黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素等。

黄酮生物合成途径的解析为其合成生物学研究奠定了基础。

利用合成生物学技术已成功在大肠杆菌或酵母中合成了黄酮类化合物，如柚皮素、松属素和非瑟酮等。

合成生物学研究为黄酮类化合物提供了新的来源，将进一步推动黄酮类药物和保健品的研发，使其在人类饮食和健康等领域发挥更大的作用。

标签：黄酮类化合物；合成途径；合成生物学Advance in flavonoids biosynthetic pathway and synthetic biologyZOU Liqiu1，WANG Caixia2，KUANG Xuejun1，LI Ying1，SUN Chao1*（1.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences and PekingUnion Medical College，Beijing 100193，China；2.Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）[Abstract] Flavonoids are the valuable components in medicinal plants，which possess a variety of pharmacological activities，including antitumor，antioxidant and antiinflammatory activities. There is an unambiguous understanding about flavonoids biosynthetic pathway，that is，2Sflavanones including naringenin and pinocembrin are the skeleton of other flavonoids and they can transform to other flavonoids through branched metabolic pathway. Elucidation of the flavonoids biosynthetic pathway lays a solid foundation for their synthetic biology. A few flavonoids have been produced in Escherichia coli or yeast with synthetic biological technologies，such as naringenin，pinocembrin and fisetin. Synthetic biology will provide a new way to get valuable flavonoids and promote the research and development of flavonoid drugs and health products，making flavonoids play more important roles in human diet and health.[Key words] flavonoids；biosynthetic pathway；synthetic biologydoi：10.4268/cjcmm20162207黄酮类化合物（flavonoids）是植物特有的次生代谢产物，指2个苯环（A与B环）通过中央3个碳原子相互连接形成具有C6C3C6基本结构的一系列化合物[1]，由于这类化合物大多呈黄色或淡黄色，因此称为黄酮。

茶 叶 科 学 2007，27（2）：127~132Journal of Tea Science收稿日期：2006-10-30 修订日期：2006-12-30 基金项目：国家863计划（2006AA10Z171）、浙江省“钱江人才”计划项目（2006R10042）、浙江省重点科技项目（2004C22033）、人事部和教育部留学回国人员科研基金（2005-134，2005-383）内容之一作者简介：马春雷（1982— ），男，黑龙江人，硕士研究生，从事茶树分子生物学研究。

*通讯作者: liangchen@茶树查尔酮异构酶基因克隆及序列分析马春雷1,2，赵丽萍1，张亚丽1,2，陈亮1*（1. 中国农业科学院茶叶研究所茶树资源和遗传改良与分子生物学实验室，浙江 杭州 310008；2. 中国农业科学院研究生院，北京 100081）摘要：茶叶是世界上最流行的无酒精饮品之一，含有许多有价值的次生代谢产物，如儿茶素类物质。

分离和克隆重要的茶树功能基因，对利用基因工程技术进行茶树遗传调控具有重要意义。

本文采用EST 测序技术和T 4RNA 连接酶介导的5′RACE 技术，获得了一个茶树儿茶素代谢中的重要基因—查尔酮异构酶（CHI ）基因，在GenBank 登录（DQ904329），其序列全长1 163 bp ，其中开放阅读框长723 bp ，编码240个氨基酸，3′端有一个明显的多聚腺苷酸加尾信号，推测的蛋白分子量约为26.4 kD ，理论等电点为5.19。

序列分析表明它与番茄CHI 基因序列的亲缘关系比较近。

关键词：茶树；查尔酮异构酶；基因克隆；序列分析中图分类号：S571.1，Q523 文献标识码：A 文章编号：1000-369X （2007）02-127-06Molecular Cloning and Sequence Analysis of Chalcone Isomerase Gene of Tea Plant (Camellia sinensis )MA Chun-lei 1,2, ZHAO Li-ping 1, ZHANG Ya-li 1,2, CHEN Liang 1*（1. Lab for Tea Germplasm, Genetic Improvement and Molecular Biology, Tea Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China ）Abstract ：Tea is one of the most popular non-alcoholic healthy beverages in the world, which possesses great value as a source of secondary metabolic products, such as catechins. Isolation and cloning of important functional genes of tea plant (Camellia sinensis ) is of crucial significance for using biotechnology method to regulate the metabolism of tea plant. In this paper, the chalcone isomerase gene, which was an important functional gene of catechins biosynthesis pathway, was cloned from tea plant by using EST sequencing and RACE (rapid amplification of cDNA ends) approaches. The full-length cDNA of chalcone isomerase gene is 1 163 bp (GenBank Accession No. DQ904329), containing a 723bp open reading frame (ORF) encoding a 240 amino acid protein, and its 3′ untranslated region has an obvious polyadenylation signal. The deduced protein molecular weight was 26.4 kD and its theoretical isoelectric point was 5.19. Sequence analysis result showed that it is closely related with that of Lycopersicon esculentum. Keywords ：tea plant (Camellia sinensis ), chalcone isomerase, gene cloning, sequence analysis茶树中含有大量的多酚类化合物，含量一般为干重的15％~35％，它是茶叶品质的主要成分之一，其中儿茶素的含量最高，对于改善人体健康效果最为突出，它不仅具有防治肿瘤的功能，而且对增强微血管强韧性，降低血糖、血脂、血压，预防肝脏及冠状动脉硬化都有明茶叶科学27卷128显疗效[1,2]。

第27卷　第2期中南林业科技大学学报V ol.27　No.2　2007年4月J o urnal o f Central South Univ er sity o f Fo rest ry&Techno log y Apr.2007　文章编号:1673-923X(2007)02-0087-05查尔酮合酶与查尔酮异构酶基因特征及转基因应用张党权,谭晓风,王晓红(中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室,湖南长沙410004)摘　要:　查尔酮合酶和查尔酮异构酶一起构成了黄酮类化合物生物合成的限速酶.底物先是由查尔酮合酶的作用形成袖皮素查尔酮化合物,然后再由查尔酮异构酶异构化成不同的黄酮类化合物.查尔酮合酶和查尔酮异构酶广泛存在于多种植物中,涉及了苯丙氨酸代谢途径中各种具有防御性产物的生物合成,在植物的抗菌机制、抗胁迫、细胞的发育和分化、色素的积累和外源基因的表达等方面起着重要的作用.就查尔酮合酶和查尔酮异构酶的结构特点、编码基因的克隆及序列特征、基因的表达调控以及转基因应用等方面进行了系统的综述,并对其今后进一步的研究提出了适宜的建议.关键词:　查尔酮合酶;查尔酮异构酶;基因表达与调控;植物基因工程;综述中图分类号:　S718.46;Q943.2 文献标志码:　AGene Characteristics and Transgenic Application of ChalconeSynthase and Chalcone IsomeraseZHANG Dang-quan,T AN Xiao-feng,W AN G Xiao-ho ng(Th e Key Lab of Non-w ood Fores t Products of Fores try M inis try,Central South University ofFo res try and Technology,Changsh a410004,Hunan,China)Abstract:Ch alcone syn thas e(CHS)and ch alcone is om erase(C HI)are th e key en zymes con trolling th e biosynthesis of flavonoid,fo rC HS can catalyze its s ubs trate into naringenin-chalcone,which will s equentially be isomerized into flav onoid compounds by CHI.Th es e tw o en zymes exis t widely in mos t plants,and involv e th e biosyn th esis of prev entive products from ph enylpropan oid pathw ay, hence playing an im portant role in th e anti-fu ngus m ech anis m,s tress resis tance,cell development and differentiation,pig men t accum ulation,and exogenous gen e exp ression in plan ts.In this paper,th e s tructural traits of CHS and CHI,gen e cloning and sequence characteristics,gene expres sion and regulation,and its transgenic application,are s ystematically s ummarized,and feasib le sugg es tions for fu rth er res earch es are presented.Key words:ch alcone s ynth as e;chalcone isom erase;gene expres sion and regulation;plant gene engineering黄酮类化合物系色原烷和色原酮的衍生物,是一类在高等植物中大量存在的重要的次生代谢产物,具有很多重要的功能,如参与花色的形成、UV防护、抵抗病原体等等.目前研究表明,它们还与人类的健康有着密切的关系,具有消除氧自由基、抗炎、抗癌、保护心脑血管系统等多种药理作用.查尔酮合酶(chalco ne sy nthase, CHS)和查尔酮异构酶(chalco ne isomerase,C HI)是所有黄酮类化合物合成的关键酶,CHS介导了黄酮类化合物合成的第一步,催化3个分子的丙二酞辅酶A与1个分子对羟基苯丙烯酞辅酶A缩合成袖皮素查尔酮,并以此为支架经由CHI的异构作用衍生出其它黄酮类化合物.因而,查尔酮合酶和查尔酮异构酶一起构成了色素苷合成的限速酶,即底物先由查尔酮合酶的作用形成袖皮素查尔酮化合物,然后再由查尔酮异构酶异构化成不同的黄酮类化合物.就查尔酮合酶和查尔酮异构酶的结构、编码基因的克隆及特征、基因的表达调控以及转基因应用等方面进行了系统的综述,并对其今后进一步的研究提出了适宜的建议.收稿日期:2006-12-31基金项目:国家自然科学基金(30371184),湖南省自然科学基金(06J J10125),中南林业科技大学青年科学基金重点项目(05007A).作者简介:张党权(1976-),男,副教授,硕士生导师,博士,主要从事植物分子生物学、植物基因工程、植物组织培养的研究.通讯作者:谭晓风,男,教授,博士导师,博士,E-mail:tanxiaofencn@.1　查尔酮合酶1.1　活性与结构特征查尔酮合酶能催化香豆酰Co A缩合成查尔酮.在大多数植物中,查尔酮合酶的底物来源于苯丙氨酸途径中的4-香豆酰辅酶A(4-coumaroy l-Co A),而在另外一些植物中,查尔酮合成酶的生理底物可以是肉桂酰辅酶A (cinnamo yl-Co A)或咖啡酰辅酶A(caffeoyl-Co A)[1].如近期对大麦(Hordeum vulgure)查尔酮合酶活性分析表明,在特定条件下咖啡酰辅酶A可以作为生理底物,因为在逆境(如紫外胁迫、病原体攻击等)条件下更倾向于以咖啡酰辅酶A为底物,而不是4-香豆酰辅酶A[2].当以4-香豆酰辅酶A为底物时查尔酮合酶最适pH值为7.5～8.5,以肉桂酰辅酶A为底物时为6.7～7.3,而以咖啡酰辅酶A为底物时为6.5～ 6.8.对查尔酮合酶蛋白三维结构的研究表明,它的亚基结合位点和酶活性位点紧密连接在一起,二聚体酶的活性位点在三维结构中可能相邻.然而,尽管CHS的两个亚基的活性位点连接很紧密,但单个亚基仍能独立催化整个缩合反应[3],因而,可认为C HS的亚基在查尔酮合成过程中起协同作用.经过三维结构及定点突变分析,已查明定查尔酮合成酶催化中心由四个高度保守的残基(Cys169、His307、Asn340、Phe219)组成[4],同时确定了CHS 的反应机制与分子机理[5].这些研究为进一步了解植物中聚酮化合物生物合成的化学基础,并为利用基因工程手段改造C HS活性提供了结构基础.1.2　编码基因及特征自从1983年荷兰芹的查尔酮合酶基因首次被克隆以来[6],至目前为止,已从大部分单子叶和双子叶植物中克隆了查尔酮合酶的基因组DN A或cDN A序列,涉及的植物主要是豆科的大豆、苜蓿、豌豆,十字花科的拟南芥,禾本科的水稻、玉米,葡萄科的葡萄等.查尔酮合酶基因在不同植物类群中保守性较高[4],除金鱼草(Antirrhinum majus)外,其它植物CHS基因含有2个外显子和1个内含子.外显子1编码60个左右氨基酸残基,外显子2则编码340个左右氨基酸残基,在长度和核苷酸序列方面外显子2的保守性高于外显子1.内含子的大小及序列差异都较大,而金鱼草则在外显子2中含有第二个内含子.作为活性位点的4个保守氨基酸残基也位于外显子2中.不同物种中查尔酮合酶的氨基酸水平的一致性很高,约79%～91%[7].CHS基因的启动子具有多个特异的元件,如与接受激发因子诱导所必须的ACE元件(ACGT element)和H区(H-bo x),以及负调控的沉默子、维持基因转录水平的P区[8].在大部分植物中,CHS编码基因组成了一个多基因家族,如矮牵牛、豌豆、大豆等,特别是双子叶植物中CHS家族的基因数目较多,如菜豆中已发现8个CHS基因,矮牵牛中已鉴定出8个以上的CHS基因[9].尽管Lo 和Nicholso n在两色蜀黍(Sorghum bic olor)中已经分离得到了7个查尔酮合酶基因,但更多的研究结果表明,在单子叶禾本科植物中大部分属(如玉米、稻、大麦、黑麦等)只含有2个C HS基因[8].虽然查尔酮合酶基因家族中数目较多,但各成员的基因编码区同源性较高.由于查尔酮合酶在植物的抗菌机制、抗胁迫、细胞的发育和分化、花色素的积累和外源基因的表达等起着重要的作用,查尔酮合酶基因家族的不同成员往往受不同的发育调控和组织特异性调控,对不同外界刺激的敏感程度也不同,这个特点是与黄酮、异黄酮类物质的功能多样性相适应的.如在矮牵牛中C HS基因家族由8～12个成员组成[9],植物正常发育过程中只有C HSA和C HS J表达,且这种表达只能在花中进行;CHSA转录的m RN A占总CHS基因总m RN A的90%;在苗期,CHSA、CHSJ、C HSB 和CHSG基因可被紫外线诱导表达;CHSD是假基因,CHSC、CHSE、CHSH、CHSI、CHSK、CHSL虽不具有假基因的性质,但尚未检测到其基因产物[10].通过对CHS的基因进行分子进化分析,结果表明查尔酮合酶基因在植物中普遍存在,甚至最早在陆生植物中如轮藻纲(Cha ro phyceae)出现,同时显示查尔酮合酶是从脂肪酸代谢途径中的一个酶进化而来[10].越来越多的分子遗传学证据显示,在进化的过程中CHS的功能有过多次转变,如不断重复地转变成合成酶(stilbene sy nthase,ST S)的活性[10],这些功能发生转变的酶也称为C HS的相似酶.近年来的分子进化研究结果表明,CHS只是植物聚酮化合物合成酶家族中的一个成员.DN A序列分析结果表明,这个家族的其他成员还包括STS、ACS、2PS,这些蛋白的基因与C HS基因的序列一致性在65%～75%之间.这个结论也和前面的查尔酮合酶在进化的过程中经过几次变化的理论相一致.Durbin等指出CHS非常适合于基因复制的研究和基因家族起源的调查[9].但是,目前还没有从假定的早期陆生植物中或者其可能的祖先植物88中　南　林　业　科　技　大　学　学　报第27卷中分离得到C HS 及其相关的基因,关于这些植物的CHS 及相关蛋白合成的代谢产物也没有相关的研究.1.3　基因的表达调控CHS 多基因家族中的每个个体都可以被不同的调控方式所调控,如组织特异性表达,由光、诱导处理或病原体侵染而诱导的转录,及由其他调节基因控制的转录.在一些植物的早期发育阶段,CHS 出现在叶片组织中,而成熟植株中主要限于花组织中表达[11].在很多植物中(如矮牵牛、菜豆等),一些外界刺激如胁迫、紫外线和病原体的攻击会诱导C HS 的快速响应并表达[8].对蜀黍采用炭疽病菌株Colletrichum graminic ola 侵染的结果显示,由于非相容性作用,在植物抗毒素出现的部位(即病原菌侵染的部位)开始积累植物抗毒素前的3～6h,C HS 的表达量开始大幅度增加[12].当菜豆的叶片接种毒性或非毒性的丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringae )分离物,与相容性相互作用相比,非相容性相互作用中CHS 转录本的积累更迅速,且很快提升到很高的水平.更多的相关研究表明,C HS 在植物组织中的积累优先发生在与病原体直接相互作用的位点[13].由于C HS 多基因家族中的个体间存在一定的差异,因而它们在逆境时所产生的响应及表达情况差异较大.如苜蓿中至少含有7个不同的C HS 基因,但在细胞悬浮培养物中进行高盐胁迫诱导处理时,只有5个CHS 基因被诱导转录.而且,当叶片被真菌苜蓿黑茎病菌株(Phoma medicaginis )侵染时,同一家族不同CHS 基因的转录本在真菌的侵染部位会产生不同的积累方式,其中一个C HS 基因的转录本比家族内其它CHS 基因的转录本更迅速地积累[9].CHS 参与了黄酮、异黄酮、5-脱氧异黄酮等类黄酮化学物的生物合成途径,这些化合物在植物中分别起着不同的作用,而且对CHS 的生物合成起着一定的反馈调控作用.越来越多的分子生物学研究表明,CHS 基因的调控主要发生在转录水平上[11].由于C HS 多基因家族的功能多样性,以及在不同发育阶段的调控、组织特异性的调控、以及诱导调控的复杂性,使它进化成为一个完善的调控系统,可作为模式基因家族,用于研究植物基因调控与表达的分子机制,特别是多基因家族的分子机理的研究.1.4　转基因应用CHS 的种类与活性对植物花色素的形成与积累起着重要的作用.C HS 基因的突变将导致植物颜色表型发生相应的变化,如金鱼草、大麦、番茄、豌豆、玉米等的C HS 功能失效会导致花色素苷的缺乏而产生白化花的表型.亦可通过转基因技术,将C HS 基因的表达进行控制,即可控制花色素的形成,最终可控制花色的改变.如将反义C HS 基因转到矮牵牛中,通过降低C HS 基因的表达而抑制花色素的形成,产生不同寻常的花色素形成方式,包括花色素平均分布、花斑、环斑,使白色花斑随机分布在花瓣上;而当一个嵌合的正义CHS 基因转入矮牵牛植株后,内源基因和转入的基因会产生共抑制而导致表型的变异,如花色的改变[14].目前人们已经成功的利用反义技术和共抑制技术在碧冬茄属(petunia )、扶朗花属(gerbera )和茴蒿属(c hrysanthemum )的植物中通过抑制色素生成,使花颜色变浅或成白色而得到了颜色改变的花[15].除了可控制花色素形成外,将C HS 基因导入植物还可提高植物的抗逆性,这也成为目前C HS 基因研究的一个热点.最新的研究进展表明,将CHS 基因导入杨树,降低了转基因杨树植株对低温的敏感性,将CHS 基因与黄酮醇合酶(flavo nol synthase)基因共同转化至番茄后,发现它们可协同作用正调节番茄果肉组织中黄酮醇的合成,从而提高了番茄的抗氧化水平[16].将CHS 、C HI 和DFR (黄烷酮醇还原酶,dihydroflav ono l 4-reductase)基因导入马铃薯块茎中,这些基因的过量表达引起了花色素苷等黄酮类化合物的增加,从而改善了马铃薯的抗氧化能力[17].2　查尔酮异构酶2.1　高级结构及活性特征查尔酮异构酶是第一个被认识的类黄酮合成相关酶,是类黄酮类色素生物合成所需的关键酶之一.自从通过抗体技术从菜豆中分离纯化CHI 以来,通过类似方法已在多种植物中分离纯化出CHI [18].C HI 是植物异黄酮途径中植物抗毒素生物合成所必需的酶,以单体的形式普遍存在于大多数植物中,分子量因植物的种类而异[19].C HI 的氨基酸序列和蛋白质的三维折叠结构在植物中具有唯一性,已被建议作为一种植物特有的基因及结构标记[20].目前研究表明,除在植物中普遍存在C HI 外,在真菌、粘土霉菌和大部分γ蛋白细菌中,都存在89第2期张党权等:查尔酮合酶与查尔酮异构酶基因特征及转基因应用90中　南　林　业　科　技　大　学　学　报第27卷与植物CHI直向同源的类C HI蛋白,但都缺乏C HI的上游酶CHS.CHI催化分子内的环化反应,其底物为CHS催化合成的查尔酮(4,2',4',6'-四羟基查尔酮)或6'-脱氧查尔酮(4,2′,4′-三羟查尔酮).在CHI的作用下,底物的2′位羟基失氢与β位断裂的碳碳双键形成“-O-”键,从而分别形成分子内环化的(2S)-黄烷酮(5,7,4′-三羟查尔酮)或(2S)-5-脱氧黄烷酮(7,4′-二羟查尔酮)[21].CHI催化活性具有立体异构性,并且具有p H依赖性,当pH为7.5时,催化活性为90%,而在p H为6.0时,催化活性只有50%[22].No rimo to等[21]把CHI家族分为两大类,Type I类C HI只能将查尔酮异构化为(2S)-黄烷酮,绝大部分植物都含有该类CHI;Type II类CHI除能将查尔酮异构化为(2S)-黄烷酮之外,还能将6'-脱氧查尔酮异构化为(2S)-5-脱氧黄烷酮,该类CHI主要存在于豆科植物中.根据Gensheimer等[20]的研究结果,可将真菌和细菌中的类C HI蛋白家族归为CHI的Ty pe III类.2.2　基因特征及表达调控自从C HI被发现以来,C HI基因已经在多种植物中被克隆出来,对其DN A序列的分析结果表明,CHI基因具有较高的同源性,其一致性约为65%～90%[21].虽然克隆的CHI基因较多,但绝大部分集中于花卉植物,其它植物的CHI基因极少.在我国,主要集中于美人蕉以及茶属植物等CHI基因的克隆,如中国科学院昆明植物研究所克隆了茶的CHI基因,而经济林育种与栽培国家林业局重点实验室则克隆了油茶的CHI基因,其全长cDN A为所有C HI基因中最长,同时还克隆了油茶CHS基因[23].对矮牵牛C HI基因的克隆进行得比较深入,至目前已经获得了两个CHI基因:C HIA和CHIB.CHIA在花冠、导管、成熟的花粉和经紫外线照射的幼苗中表达,而CHIB仅在未成熟的花粉中表达.从矮牵牛花瓣cDN A 中克隆到的C HIA全长726bp,编码241个氨基酸;C HIB的基因组DN A全长2170bp,编码220个氨基酸[24].CHIA基因编码区上游存在两个启动子PA1和PA2,PA1和PA2在不同矮牵牛花组织中具有不同的启动活性.PA1启动子在花冠组织中可驱动C HIA表达,而PA2启动子仅在花药发育后期和花粉粒组织中启动CHIA[24].C HIB只有一个启动子,仅仅在花药发育早期及成熟花粉组织中驱动CHIB基因的表达.C HIA和CHIB基因启动子区域有37bp的高度保守的DN A序列.其他结构基因如C HS和DFR的启动子DN A序列也存在一段与CHI基因启动子高度保守的DN A序列,称为花药盒(a nther box)[25].在植物的花冠、球茎与花药的发育过程中,CHSA、CHSJ与CHI的积累与消失受光调控和紫外辐射诱导,并存在协同性.实验表明,这种协同积累效应是因为CHI基因和CHS基因m RN A协同表达的结果[24].2.3　转基因应用由于CHI基因在类黄酮和异黄酮合成中的重要性,其表达量的多少会直接影响花色素的合成,同时也会影响到黄酮类代谢产物的量,因而CHI的转基因研究正成为次生代谢基因工程与花卉基因工程的热点研究之一.目前,直接应用CHI基因改变花色的研究较少,而直接应用外源CHI基因的超量表达增加黄酮类物质已进行了深入的研究.通过异位表达CHI得到了果实中总黄酮醇含量比野生型增加48倍的番茄;在西红柿中超量表达矮牵牛CHIA基因,结果导致果皮中黄酮醇的含量比对照增加了79倍,且无明显的表型变化[26].而且,CHI基因还可与其它多种酶基因同时起作用,如将CHI基因与CHS、DFR基因同时转化至马铃薯中,并实现这些基因的过量表达,从而大幅度提高了花色素苷等黄酮类化合物的含量,最终改善了马铃薯的抗氧化能力[17].3　研究展望3.1　基因克隆至目前为止,所克隆的CHS和CHI基因主要集中于草本植物[28],如各种草本花卉和农作物等,而对木本植物的基因克隆的研究较少[29],而且主要是山茶属C HS基因的cDN A.虽然山茶属C HS基因在GenBa nk中登录了不少,但经过我们仔细的序列分析,发现只有5条是全长cDN A(CHS1、CHS2、C HS3、CHS4、CHS5),分别由日本、韩国、印度等从茶中克隆出来[30].在GenBank中,还有19条中国登录的非全长cDN A,其中三条是来自茶的CHS1、CHS2、CHS3的部分序列;另外16条均是C HS2基因型.目前山茶属在GenBank中只登录了3条基因,而中南林业科技大学登录了其中2条[23,31].因而,我国科研工作者还需加强对木本植物CHS和CHI基因的克隆,特别是全长cDN A的克隆,为这两个重要基因的应用提供更多可选择的资源[32].3.2　结构与功能改造鉴于C HS 功能的多样性与基因家族的复杂性,为了方便它的应用,必须对其进行适度的改造.主要从缩减CHS 的次要功能入手,如抗菌、抗胁迫、外源基因的表达、细胞的发育和分化等,将这些功能减弱甚至完全去除;同时,将其主要功能——花色素积累及类黄酮代谢调控进一步加强.而对C HI 而言,主要是增强它的功能活性,减少非特异性.而要完成这些功能上的改造,必须对CHS 和C HI 的结构与功能关系进行深入的了解,才能通过蛋白质工程方法对其进行合适的改造,从而达到定向改造CHS 和C HI 的目的.3.3　基因工程应用CHS 和CHI 是类黄酮代谢和色素苷代谢的关键酶,涉及了苯丙氨酸代谢途径中各种具有防御性产物的生物合成,而且具有直接的正相关性.因而,一旦确定了这两个酶基因的全长cDN A,首先可以通过基因工程技术改变植物中查尔酮合酶和查尔酮异构酶的含量,或者改变这两个酶的比例以增加植物抗逆性能力,如抗氧化、抗寒和抗旱等;也可以将其转化至农作物、经济作物或者经济树种等不同的有用植物中,以增加其抗逆性,或者通过导入其中一种基因或两种基因同时导入,通过两者的相互作用使花色变化,可有效解决目前花卉市场花色单调的难题.参考文献:[1]　De cooman L,Everacrt E,Fach e P,et al.Flavonoid biosyn th esis in Petals of Rhododend ron simsii [J ].Phytoch emis try,1993,33:1419-1426.[2]　Chris tens en A B,Gregersen P L,Sch roder J ,et al.A chalcone syn thase w ith an unus ual su bstrate p reference is ex Press ed in barley leav esin res ponse to UV -ligh t and pathogen attack [J ].Plan t M ol .Biol .,1998,37:849-857.[3]　TroPf S ,Karch er B ,Sch roder G ,et al .Reaction mech anisms of h omodimeric Plan t Polyketide syn thases (s tilbene and chalcon e s ynth as e ):Asing le active site fo r the conden sing reaction 15sufficient for syn th esis of s tilbenes,chalcones ,and 6'-deoXychalcones [J ].Biol.Ch 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研究发现 CHI隶属超基因家族，通常由 一到多个基因编码。已经识别的典 型 CHI基因通常包括 4个外显子和3个内含子，在不同种类的植物相似程度 较高。在矮牵牛中已经发现的两类CHI基因具有不同的时空表达模式， CHIA在所有花组织以及 UV处理的幼苗中表达，而 CHIB仅在未成熟的花药 中表达。在玉米中也发现 3个编码CHI 的基因，其中一个编码 24.3KDa的 基因(ZmCHI Ⅰ)，与矮牵牛 CHIA和 CHIB的同源性分别达到55%和58%[4]。
文献[2]
氨 基 酸 多 序 列 比 对
星号表示各活性位点;圆圈表示形成活性部位的核心区域:三角符号表示可能涉 及到的与底物特异性结合相关的位点[4]。
由表1可见,不同植物CHI 基因全长、开放阅读框碱 基数及其所编码的CHIB 氨基酸残基数相差较小, 且编码区的起始密码子均 为ATG,而终止密码子则不 一致,洋葱和豌豆的是TGA, 番茄和茶的是TAA。同时, 不同植物CHI的分子量、 等电点、摩尔消光系数、 酸性氨基酸比例、碱性氨 基酸比例、带电氨基酸比 例、极性氨基酸比例、疏 水性氨基酸比例等理化指 标均表现出一定的差异, 这表明CHI基因可能存在 一定的物种特异性和生化 多态性;含量最丰富的氨 基酸也不完全相同,但至 少都含有Lys,说明Lys在 CHI的催化反应中起着重 要作用[3]。
感谢观赏
学习交流共同提高
一、CHI的基因序列研究:
按查尔酮异构酶作用底物不同，可将其基因分为2类。一类存在于非豆科 植物，其编码的CHI仅能催化6’-羟基查尔酮转化为5-羟基黄烷酮（Tape Ⅰ）；另一类存在于豆科植物，其编码的CHI能催化6’-羟基查尔酮和6’-脱 氧查尔酮转化为相应的5-羟基黄烷酮和5-脱氧黄烷酮（Tape Ⅱ）[3]。

黄酮类物质的生物合成及对干旱胁迫响应的研究进展作者：白禹卯丹王继玥来源：《安徽农业科学》2018年第16期摘要通过阐述黄酮类物质生物合成、代谢调控以及参与干旱胁迫响应的研究进展，提出了从多组学层面联合分析逆境胁迫下基因转录以及转录调控过程，这将有助于深入理解植物对逆境胁迫响应的分子机制，从而为品种改良和产品开发提供理论参考。

关键词黄酮类物质；生物合成；代谢调控；干旱胁迫响应中图分类号 Q945文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）16-0024-03Abstract The research progress on flavonoids biosynthesis， metabolism regulation and the response to drought stress were summarized， and a joint analysis of multiomics levels to study gene transcription and transcriptional regulation under stress was proposed ， which will help deeper understanding of plant diversity.It aims to provide a theoretical reference for breed improvement and product development.Key words Flavonoids；Biosynthesis；Metabolism regulation；Response to drought stress黄酮类物质广泛存在于植物各器官中，参与花、果实和种子颜色的形成，保护植物抵御紫外线伤害和防止病原微生物侵袭。

黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、防治血管硬化、降低心肌耗氧量、抗衰老、增强机体免疫力等功能，现已广泛应用于医药和食品行业，具有较高的经济价值[1]。

药用植物黄酮类化合物代谢合成途径及相关功能基因的研究进展康亚兰1，裴瑾1*，蔡文龙2，刘薇1，罗静1，吴清华11. 成都中医药大学药学院，中药材标准化教育部重点实验室，四川成都 6111372. 肯塔基大学药学院，莱克星顿，美国肯塔基州 40503摘要：黄酮类化合物是广泛存在于药用植物中的一类化合物，大多与糖类结合为苷存在。

黄酮类成分具有调血脂、扩张冠脉、止血、镇咳、祛痰、降低血管脆性等药理作用，备受研究者的关注。

黄酮类化合物的生物合成途径的研究开始较早，并取得了很大进展，对黄酮化合物生物合成步骤、催化各步反应的酶及其基因都有初步研究。

对药用植物黄酮类化合物代谢合成途径及功能基因的研究进展进行综述，以期为黄酮类化合物进一步研究提供参考。

关键词：药用植物；黄酮类化合物；代谢合成途径；功能基因；次生代谢产物中图分类号：R282.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)09 - 1336 - 06DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.09.026Research progress on flavonoid metabolic synthesis pathway and related function genes in medicinal plantsKANG Ya-lan1, PEI Jin1, CAI Wen-long2, LIU Wei1, LUO Jing1, WU Qing-hua11. Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicins of Ministry of Education, School of Pharmacy, Chengdu Universityof Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China2. College of Pharmacy, University of Kentucky, KY 40503, USAKey words: medicinal plants; flavonoids; metabolic synthesis pathway; functional genes; secondary metabolites黄酮类化合物是广泛存在于药用植物中的一类化合物，大多与糖类结合为苷存在，多具有调血脂、扩张冠脉、止血、镇咳、祛痰、降低血管脆性等活性。