细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用
（一）前言
20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。
所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。
由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。
（二）细胞培养技术及其历史
细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载Wilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。
1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。
1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
1903年，Jolly将蝾螈的白细胞保存在悬滴并维持了十个月。
1906年，Beebe和Ewing在动物的血液中尝试培养了传染性巴肉瘤的细胞。
可是，由于当时的培养基并不理想，因此实验难以重复，并且也难以证明这些先躯者所培养的是否是真正存活的健康的组织和细胞。结果都和Welhelm ，一样只能维持离体细胞的短期存活,而没有细胞的生长和增殖。
直到1907年，美国胚胎学家Ross Harrison的实验才被公认为组织培养真正开始的标志，因为该实验但提供了可重复的技术，而且证明了生物组织的功能可以在体外十分明确地延续下去。Ross Harri son将蛙胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织在体外不但存活了若干星期，而且居然还从细胞中长出了轴突(神经纤维)，解决了当时关于轴突起源的争论，并表明了利用体外存活的组织进行实验研究的可能性。他所采用的把培养物放在盖玻分上并倒置于凹玻片腔中的方法还一直沿用至今，称为盖片复盖凹窝玻璃悬滴培养法。
在此基础上，1912年Carrel 则更加丰富和完善了此项技术，他将无菌操作技术引入动物细胞培养，在没有使用抗菌素的条件下使鸡胚心脏细胞在人工培养条件下生存了34年，并且先后传代3400次。并发现动物体液中存在着对动物细胞生长有强烈促进作用的生长因子。这一结论早已被现在的研究所证实，并成为无血清培养基研究的基础。由于这两个人的卓越成就，细胞培养从此开始了迅猛的发展，并成为生物工程特别是细胞工程中一项重要的基础技术.
1912年，当时的Carrel是外科医生，在实验中特别注意无菌操作。他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，并采用了更新培养基和分离组织的传代措施，从而完善了经典的悬滴培养法（Suspension Culture）。Carrel用这种方法，曾培养一鸡胚心肌组织长达数年之久。这些创造性的工作充分揭示：离体的动物组织在培养条件下，具有近于无限的生长和繁殖能力；并充分证明组织培养的确是研究活组织和细胞的极好方法。
1924年Maximow又把Carrel的悬滴培养法改良为双盖片培养，使之更易于传代和减少污染。Carrel又设计了用卡氏瓶培养法，扩大了组织的生存空间。自悬滴培养问世后的30年中，以Harrlson 和Carrel为首的科学家们，用这些方法对各种组织在体外生长的规律和细胞形态进行了深入的研究，发表了大量论文，为组织培养的进一步发展奠定了巩固的基础。
（三）动物细胞的培养方法
（1）贴壁培养法
大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是：先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法) 或化学(酶消化法) 的方法分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板) 中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层,生长就会受到抑制，细胞产量有限。如要继续培养还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传代培养。
（2）悬浮培养
少数动物细胞属于悬浮生长型，这些细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长，如淋巴细胞和肿瘤细胞。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物组织经分散、过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件下即可良好生长。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快、产量高、培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数种类的细胞适于悬浮培养。
③大规模培养法
动物细胞大规模培养技术是在贴壁培养和悬浮培养的基础上融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应罐技术以及人工灌流和温和搅拌系统等技术后发展起来的。始于20 世纪60 年代初Caps tick 及其同事为生产FMD 疫苗而对BHK 细胞的研究。其后，随着生物技术产品倍受世人亲睐，动物细胞大规模培养技术也随之得到了迅猛发展，并形成了几种比较成熟且有应用价值的大规模培养方法。
①空心纤维法：空心纤维培养法是Richard kncazek 等在1972年创建的。最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性滤膜，外径约为1/3～3/4mm ，表面具有海绵状多孔结构，既能使水分子、营养物质和气体透过，也能使细胞在上面贴附生长。这种培养系统的核心部分是由3～6层这样的空心纤维组成的，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔，培养一段时间后，当细胞密度达到107-107个/ml时逐渐用无血清培养液代替含血清培养液。此时细胞虽不再增殖，但能正常生活并继续分泌所需的蛋白质或其他生物制品。由于这种培养方法在分离和纯化分泌物时很方便，因而在生产激素和单抗时被广泛应用。并相继开发出了由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的新的空心纤维培养系统。
②微载体法：微栽体法是Wezel 在1967 年首先创建的。所采用的微栽体是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固体小珠，其直径约在50 微米到数百微米之间。培养动物细胞时先将微载体在血清
