肠道病毒71型的快速纯化及其鉴定

肠道病毒EV71新型VLPs疫苗的制备及鉴定董轲;王希;龙敏;王琳;张惠中【摘要】目的制备肠道病毒71型(EV71)的新型病毒样颗粒(VLPs)疫苗,为手足口病防治奠定基础.方法应用分子克隆技术构建外壳蛋白VP1融合基因cVP1,免疫细胞化学及Western Blot测定该融合基因在HeLa细胞表达情况;将cVP1克隆于杆状病毒表达载体pFastbac1,应用昆虫细胞TN5制备重组杆状病毒cVP1 rBV,再将此重组病毒与本室保存的gag rBV以不同MOI比例共感染昆虫细胞TN5,得到含有VP1的重组嵌合病毒样颗粒cVP1 VLPs,最后以Western Blot及电镜进行鉴定.结果免疫细胞化学及Western Blot结果显示构建的融合基因cVP1可在真核细胞内表达,并成功制备成cVP1 rBV,该重组杆状病毒和gag rBV共感染昆虫细胞制备的VLPs结构完整.结论成功制备了EV71的新型VLPs疫苗,为后续研究打下了基础.【期刊名称】《中国妇幼健康研究》【年(卷),期】2015(026)006【总页数】3页(P1125-1127)【关键词】手足口病;肠道病毒71型;病毒样颗粒;制备及鉴定【作者】董轲;王希;龙敏;王琳;张惠中【作者单位】第四军医大学唐都医院临床实验与检验科,陕西西安710000;第四军医大学唐都医院临床实验与检验科,陕西西安710000;第四军医大学唐都医院临床实验与检验科,陕西西安710000;第四军医大学唐都医院临床实验与检验科,陕西西安710000;第四军医大学唐都医院临床实验与检验科,陕西西安710000【正文语种】中文【中图分类】R512.5手足口病(hand, foot and mouse disease，HFMD)为一组肠道病毒引起的传染性疾病，近年来在我国持续爆发，严重危害公众健康并带来巨大社会负担。

引发手足口病的肠道病毒包括A组柯萨奇病毒、埃可病毒和肠道病毒71型等，其中肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)病毒感染是部分患者出现中枢神经系统、呼吸系统和循环系统严重并发症并导致死亡的重要原因[1-2]。

肠道病毒71抗原ELISA检测方法构建及其应用韩金乐;贾继宗;李川;杨亮;何德磊;李娟;由鹏飞;叶祥忠;李益民【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2011(031)011【摘要】Objective To develop an ELISA method for quantitative determination of enterovirus 71 (EV71) antigen.The method can be applied to detect EV71 antigen contents and analyze the correlation between immunogenicity and immunoprotection.It also can be used for tissue culture infective dose( TCID50 ) assay.Methods A double antibody sandwich ELISA method was developed for quantitative determination of EV71 antigen on the basis of the high-affinity neutralizing monoclonal antibodies ( K8G2 and Y8H2-HRP).This method was compared with microscopic observation for the detection of EV71 TCID50.The correlation was analyzed between the specific activity of EV71 antigen and the EV71 neutralizing antibody titer in immune serum.Results The linear range of this method was 0.125-4.0 U/ml and the R2 value was 0.9911.The reagent did not react with other antigens except EV71 antigen.The recovery ratio of this method was 0.89-1.16.The coefficient of variation was less than 15％.The heat recovery rate was above 85％when the reagent was in 37℃ for 9 days.There was a good correlation in TCID50 of EV71 between this method and microscopic observation,r=0.990.The specific activity of EV71 antigen had positive correlation with the neutralization titer of immuneserum in 21 EV71 strains,r=0.930.Conclusion The quantitative ELISA method for EV71 antigen was developed,which could be used to detect EV71 antigen contents and analyze TCID50.The specific activity of EV71 antigen detected by the method could be used to evaluate the immunoprotection of the vaccine potency test.%目的建立肠道病毒71型(EV71)抗原的ELISA检测方法.用于EV71的抗原定量、TCID50试验及EV71免疫原性与免疫保护性的关系分析.方法以高亲和力的EV71中和单抗K8G2和Y8H2-HRP构建检测EV71抗原的双抗体夹心ELISA方法.比较本方法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50.分析EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的关系.结果本试剂定量检测抗原的线性范围为0.125 ～4.0 U/ml,R2 =0.9911,试剂不与EV71之外的受试物反应,试剂的回收率为0.89 ～ 1.16,变异系数小于15％,37℃9 d的热回收率大于85％.本法与显微镜观察法检测的EV71 TCID50的相关系数r=0.990.21株EV71抗原的特异比活与免疫血清中和抗体水平的相关系数r=0.930.结论构建了EV71抗原ELISA检测试剂,可用于EV71的抗原含量检测、TCID50分析,为特异比活与免疫血清中和性关系研究提供了一些有价值的信息.【总页数】4页(P1031-1034)【作者】韩金乐;贾继宗;李川;杨亮;何德磊;李娟;由鹏飞;叶祥忠;李益民【作者单位】102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心;102206 北京万泰生物药业股份有限公司研发中心【正文语种】中文【相关文献】1.鸡传染性法氏囊病毒抗原捕获ELISA检测方法的建立及应用2.肺炎衣原体ELISA 抗原检测方法的建立和应用3.结核分枝杆菌抗体双抗原夹心ELISA检测方法的建立及初步应用4.猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用5.应用禽呼肠孤病毒σ_3融合蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

包涵体蛋白3种纯化方法的比较目的比较3种纯化方法对表达的肠道病毒71型（EV71）VP1区包涵体蛋白的纯化效果。

方法分别用差速离心法、固定化金属离子亲和层析（IMAC）及不同浓度饱和硫酸氨沉淀法3种包涵体蛋白纯化法对原核表达EV71 VP1包涵体蛋白进行纯化，蛋白垂直（SDS-PAGE）电泳检测蛋白纯化效果。

结果差速离心法可以进行大批量表达蛋白纯化，纯化效果较好，但存在蛋白损失较多，且纯化蛋白不能反复冻融的问题。

IMAC柱纯化获得的蛋白纯度较高，且蛋白性状稳定，但仍存在纯化蛋白量较少的问题。

饱和硫酸氨沉淀纯化法无法获得纯度较高的包涵体蛋白。

结论差速离心法可用于大批量蛋白纯化，纯化蛋白应避免反复冻融，可小量分装冻存后备用。

IMAC柱纯化可获得纯度较高且性状相对稳定的纯化蛋白，其在相应抗体检测方法学的建立及疫苗制备方面均有广泛用途。

饱和硫酸氨法只适用于表达蛋白的初步浓缩纯化。

[Abstract] Objective To compare the expressed inclusion body protein of EV71 VP1 with three purification methods. Methods The expressed EV71 VP1 inclusion body protein was purified by differential centrifugation，IMAC column purification and ammonium sulfate precipitation. SDS-PAGE experiments determinate the purity effects. Results Expressed inclusion body purification in large quantities could been undertaken by differential centrifugation and the purification effect was better but with a lot of protein loss and the purified protein could not be repeatedly frozen and thawed. The purification effect of IMAC was good and stable，but less purified protein was purified. High purity of inclusion body protein wasn’t obtained by ammonium sulfate precipitation. Conclusion Differential centrifugation is applicable in large quantities of protein purification，but avoid repeatedly freezing and thawing. The protein purification of IMAC can be used to establish corresponding antibody detection methods. The ammonium sulfate precipitation is only applicable for the preliminary purification of the expressed proteins.[Key words] Inclusion body protein；Protein purification；SDS-PAGE electrophoresis包涵体是外源基因在细胞中表达量过高形成的一种膜包裹的高密度、不溶性蛋白颗粒。

手足口病EV71疫苗纯化的工艺
蔺芳;穆瑞瑞;张俊;张可
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2012(040)006
【摘要】为提高肠道病毒71型(EV71)疫苗的纯化工艺,采用粗纯、4FF层析、离子交换层析、蔗糖密度梯度离心等方法进行疫苗的纯化.结果表明,粗纯的EV71浓缩液经4FF层析和蔗糖密度梯度离心,得到高纯度的EV71疫苗.新工艺提高了
EV71的纯度,适用于规模化生产.
【总页数】2页(P205-206)
【作者】蔺芳;穆瑞瑞;张俊;张可
【作者单位】新乡学院生命科学与技术系,河南新乡453003;新乡学院生命科学与技术系,河南新乡453003;新乡学院生命科学与技术系,河南新乡453003;郑州大学生物工程系,河南郑州450001
【正文语种】中文
【中图分类】R373.2
【相关文献】
1.儿童家长对手足口病及接种EV71疫苗的认知程度调查 [J], 吕永梅;刘玮
2.EV71疫苗预防重症手足口病的临床观察 [J], 尹秀志;李继安;聂秀真;刘丽艳;刘世花;李娜;王平;宋双双;徐道彦;林爱伟
3.惠州地区EV71疫苗接种水平与手足口病病原学分析 [J], 杨坤祥;黄彬
4.昆明市妇幼保健院肠道病毒EV71疫苗接种后手足口病病原构成变化 [J], 李秀
芳;王艳;张倩;代大春;杨桂云
5.儿童接种EV71手足口病疫苗对手足口病的预防效果及安全性分析 [J], 李翔;周源虎;魏丽娟
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综述肠道病毒EV71最新研究进展2007级生物技术黄琼肠道病毒71（Enterovirus 71, EV71）是1969年Schmidt等首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的[1]。

EV71感染主要引起手足口病（Hand-food-mouth disease, HFMD），在临床上与柯萨奇病毒A16（Coxsakie A16, CA16）感染所引起的手足口病难以区别。

EV71感染严重者还能引起无菌性脑炎、脑膜脑炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹、心肌炎和肺水肿等多种与神经系统相关的疾病[2]。

自1974年首次报道[3]以来，EV71在世界范围内已引起十多次暴发流行，特别是近几年在亚太地区，EV71的流行呈上升趋势，已引起人们的广泛关注。

本文对EV71的结构特征、致病机制、检测技术、型别鉴定、流行病学、研究方向等作一综述。

1 EV71的结构特征肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员。

EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30nrn，核酸为单股正链RNA。

病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VP1、VP2、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体(Protomer)，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位(Pentamer)。

4种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上[4]。

由于病毒颗粒没有类脂性的包膜，所以对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐以及弱酸有抵抗力，此外，该病毒还能抵抗70%乙醇和5%甲酚皂溶液等常见的消毒剂，这些都决定了该病毒较强的野外生存能力。

EV71病毒对高温(50℃以上)及紫外线的抵抗能力较差。

EV71基因组为7408个核苷酸组成的单股正链RNA，病毒基因组具有感染性。

肠道病毒71型的快速纯化及其鉴定胡小云;朱冰;王长兵;邝璐;肖密丝【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2012(033)008【摘要】目的建立一种简单、快速有效的从细胞培养物中纯化肠道病毒71(EV71)的方法.方法 EV71病毒在恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中增殖后,将获得的细胞培养物经反复冻融、聚乙二醇6000沉淀、超速离心、氯化铯垫层超速离心的方法纯化病毒.用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western blot)和透射电镜(TEM)的方法对纯化病毒进行鉴定,并测定其感染性的滴度及回收率.结果 SDS-PAGE显示出3个条带,相对分子质量分别为3.6×103、3×103和2.6×103与EV71的VP1、VP2和VP3相符合.Western blot证实为EV71特异性条带.经磷钨酸负染后电镜观察,能看到典型病毒颗粒.采用终浓度为10%的聚乙二醇6000沉淀后的病毒的感染性回收率为82.0%,再经氯化铯垫层超速离心后浓缩病毒的感染性回性率为29.0%.结论聚乙二醇6000沉淀结合氯化铯垫层超速离心的方法比氯化铯密度梯度区带离心方法更简便,易于操作,并且比单独聚乙二醇6000沉淀有更高的纯度,是一种简便、有效的病毒纯化方法.【总页数】3页(P897-898,905)【作者】胡小云;朱冰;王长兵;邝璐;肖密丝【作者单位】广州医学院附属广州市妇女儿童医疗中心实验室,510120;广州医学院附属广州市妇女儿童医疗中心实验室,510120;广州医学院附属广州市妇女儿童医疗中心实验室,510120;广州医学院附属广州市妇女儿童医疗中心实验室,510120;广州医学院附属广州市妇女儿童医疗中心实验室,510120【正文语种】中文【相关文献】1.肠道病毒71VP1重组蛋白的纯化与鉴定 [J], 王欢2.肠道病毒71VP1重组蛋白的纯化与鉴定 [J], 王欢;3.柯萨奇病毒 A16型快速纯化和中和性单克隆抗体制备与鉴定 [J], 刘杨;赵向绒;关璐媛;王鑫;郭春艳;封青;卫晶晶;胡军;余鹏博4.新生SD大鼠心肌细胞分离培养及纯化的快速便捷方法及鉴定 [J], 付微;刘飞;乔陆明;张绪东5.人胰型及唾液型淀粉酶的分离纯化与鉴定 [J], 朱玉胜;倪赞明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。