正交法测定几种因素对酶活力的影响

《发酵⼯程实验》实验⼀淀粉酶⽣产菌的筛选⼀、实验⽬的学习淀粉酶产⽣菌的筛选⽅法。

⼆、实验原理淀粉酶在酿造、纺织、⾷品加⼯、医药等领域有⼴泛⽤途。

淀粉酶是⼀类淀粉⽔解酶的统称，它能将淀粉⽔解成糊精等⼩分⼦物质并进⼀步⽔解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被⽔解后，遇碘不再变蓝⾊，因此可根据淀粉培养基上透明圈的⼤⼩来判断所选菌株的淀粉酶活⼒。

三、实验⽤品1．样品淀粉含量丰富的⼟样。

2．培养基⾁汤培养基：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl 5g，加⽔⾄1000ml，pH7.0。

121℃灭菌20min。

初筛平板培养基：⽜⾁膏3g，蛋⽩胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂18g，加⽔⾄1000ml，pH7.4。

121℃灭菌20min。

Lugol碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏⽔300ml。

先将碘化钾溶解在少量⽔中，再将碘溶解于碘化钾溶液中，待碘全溶后，加⾜⽔即可。

3．器材⾼压蒸汽灭菌锅，超净⼯作台，电⼦天平，电炉，恒温振荡器，恒温培养箱；烧杯，量筒，三⾓瓶，培养⽫，移液管，洗⽿球，试管，试管架，接种针，涂布棒。

四、实验⽅法1．培养基制备：配制⾁汤培养基45ml，分装于250ml三⾓瓶中，纱布封⼝，灭菌。

配制初筛平板培养基350ml，分装于500ml三⾓瓶中，封⼝膜封⼝，灭菌。

2．倒平板：将融化的初筛平板培养基冷却⾄50～60℃，以⽆菌操作法倒⾄已灭菌的培养⽫中，⾄盖满底部。

冷却凝固待⽤。

3．样品预处理：取5g⼟样接⼊45ml⾁汤培养基中，30℃摇床振荡15min制成⼟壤悬液，此时的稀释度为10-1。

另取4⽀试管，分别记作10-2、10-3、10-4、10-5共5个梯度，每⽀试管内加⼊9mL⽆菌⽔。

⽤⽆菌移液管从三⾓瓶中吸取1mL⼟壤悬液，加⼊到10-2试管中混匀，再从此试管中吸取1mL加⼊到10-3试管中，依此类推直⾄10-5试管。

4．平板涂布分离：分别从不同稀释度的试管中吸取0.1ml悬液，均匀涂布于初筛培养基平板上，于30℃培养24～48h。

正交法测几种因素对酶活力的影响一、实验原理1、酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等都能影响酶反应速度，并且各因素之间也相互影响（交互作用）。

1）底物浓度对酶反应速度的影响2）酶浓度对酶反应速度的影响3）温度对酶反应速度的影响的常数，它受底物的种类、浓度；溶液的离子强度、pH、反应时间等的影响。

4）pH对酶反应速度的影响是一个固定的常数，2、正交法1）正交法是利用正交表来安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。

它从多因素试验的全部水平组合中挑选部分有代表性的水平组合进行试验，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优水平组合。

2）正交法的优点：用较少的试验获得较全面的数据结果，避免了在多因素、多水平试验中对每个因素的每个水平都互相搭配进行的全面试验，节省大量的人力、物力，缩短了实验时间。

3）正交表的正交性：Ⅰ表中每一列（因素）各水平的重复数相等；Ⅱ表中任意两列横向形成的有序数对中，所有各种可能的有序数对的重复数相同。

用正交表安排的实验，具有均衡分散的特点。

即按正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布式均衡的。

4）正交实验的一般流程Ⅰ列出试验中的因素和水平数Ⅱ选择合适的正交表Ⅲ根据正交表进行实验设计Ⅳ实验并收集数据Ⅴ分析数据，得出结论5）结果分析Ⅰ利用各因素同一水平试验指标之和及平均数，可比较因素不同水平对试验的影响程度。

Ⅱ计算极差，可比较不同因素的影响程度。

Ⅲ找出最佳试验条件（理论值）。

3、本实验选取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、 pH 值，每个因素选三个水平，选择正交表设计实验，实验设计如下表：表 14、本实验测定的是胰蛋白酶的活力，以血红蛋白为底物，血红蛋白水解后的产物多肽或氨基酸可用Folin-酚显色，在680nm下比色来得到产物浓度，从而通过一定时间内生成产物的量来判断酶反应的速度。

二、实验试剂1、2%血红蛋白液2、15%三氯乙酸（TCA）溶液3、0.3mg/mL牛胰蛋白酶（1：250）4、0.04mol/LpH为7、8、9的巴比妥钠-HCl缓冲液5、Folin-酚试剂：Folin-A(Ⅰ):-NaOHFolin-A(Ⅱ):-酒石酸钾（钠）临用前将A(Ⅰ)和A(Ⅱ)按50：1体积比混合得Folin-A试剂。

碘价的测定(Hanus) 法三、实验原理在适当条件下，不饱和脂肪酸的不饱和键能与碘、溴或氯起加成反应。

脂肪分子中如含有不饱和脂酰基，即能吸收碘。

100g脂肪所吸收碘的克数称为碘价。

碘价的高低表示脂肪不饱和度的大小。

由于碘与脂肪的加成作用很慢，故于Hanus试剂中加入适量溴，使产生溴化碘，再与脂肪作用。

将一定量(过量)的溴化碘(Hanus试剂)与脂肪作用后，测定溴化碘剩余量，即可求得脂肪之碘价，本法的反应如下：I2+Br2-->2IBr(Hanus试剂) IBr+一CH=CH—-->—CHI—CHBr—KI+CH3COOH-->HI+CH3COOKHI+IBr-->HBr+I2I2+2Na2S2O3-->2Nal+Na2S4O6 (滴定)四、实验试剂及材料仪器1、Hanus试剂：溶13.20升华碘于1000ml冰醋酸(99.5％)内，溶时可将冰醋酸分次加入，并置水浴中加热助溶，冷后，加适当之溴(约3ml)使卤素值增高一倍。

此溶液储于棕色瓶中。

2、15％碘化钾溶液称取150g碘化钾溶于水，稀释至1000ml。

3、标准硫代硫酸钠溶液(约0.1N) 25g纯硫代硫酸钠晶体Na2S2O3．5H20溶（C·P以上规格)于经煮沸后冷却的蒸馏水中，稀释至1000ml，此溶液中可加入少量(约50mg)Na2CO3，数日后标化。

标化方法：精密称取在1200C干燥至恒重的基准重铬酸钾0.15—0.20g 2份，分别置于两个500ml碘瓶中，各加水约30ml使溶解，加入固体碘化钾2.0g及6NHCl l0 ml：混匀，塞好，置暗处3分钟，然后加入水200ml稀释，用Na2S203滴定，当溶液由棕变黄后，加淀粉液3ml，继续滴定至呈淡绿色为止，计算Na2S2O3溶液的准确浓度。

滴定的反应：K2Cr2O7+6I-+14H+—>2K++2Cr3++3I2+7H2OI2+2S2O2-—>2I-+S4O2-4、1％淀粉液五、实验方法准确称取0.2g脂肪，置于碘瓶(图5中)，加10ml氯仿作溶剂，待脂肪溶解后，加入Hanus试剂20ml，(注意勿使碘液沾在瓶颈部)，塞好碘瓶，轻轻摇动，摇动时亦应避免溶液溅至瓶颈部及塞上，混匀后，置暗处(或用黑布包裹碘瓶)30分钟，于另一碘瓶中置同量试剂，但不加脂肪，作空白试验。

正交试验法正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。

正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。

正交实验设计包括两部分内容：第一，是怎样安排实验；第二，是怎样分析实验结果。

我们知道如果有很多的因素变化制约着一个事件的变化，那么为了弄明白哪些因素重要，哪些不重要，什么样的因素搭配会产生极值，必须通过做实验验证(仿真也可以说是实验，只不过试验设备是计算机)，如果因素很多，而且每种因素又有多种变化(专业称法是：水平)，那么实验量会非常的大，显然是不可能每一个实验都做的。

能够大幅度减少试验次数而且并不会降低试验可行度的方法就是使用正交试验法。

首先需要选择一张和你的实验因素水平相对应的正交表，已经有数学家制好了很多相应的表，你只需找到对应你需要的就可以了。

所谓正交表，也就是一套经过周密计算得出的现成的实验方案，他告诉你每次实验时，用那几个水平互相匹配进行实验，这套方案的总实验次数是远小于每种情况都考虑后的实验次数的。

比如3水平4因素表就只有9行，远小于遍历试验的81次；我们同理可推算出如果因素水平越多，试验的精简程度会越高。

建立好实验表后，根据表格做实验，然后就是数据处理了。

由于试验次数大大减少，使得试验数据处理非常重要。

首先可以从所有的实验数据中找到最优的一个数据，当然，这个数据肯定不是最佳匹配数据，但是肯定是最接近最佳的了。

这是你能得到一组因素，这是最直观的一组最佳因素。

接下来将各个因素当中同水平的实验值加和(注:正交表的一个特点就是每个水平在整个实验中出现的次数是相同的)，就得到了各个水平的实验结果表，从这个表当中又可以得到一组最优的因素，通过比较前一个因素，可以获得因素变化的趋势，指导更进一步的试验。

实验35 用正交法测定几种因素对酶活力的影响一、实验目的1.了解和掌握正交法的原理。

2.通过正交试验找出影响酶活力的主要因素。

二、实验原理酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等都能影响酶反应速度。

这种多因素的试验可通过正交法即用一特制的表格——正交表来安排试验、计算和分析试验结果。

这样就能通过少量试验取得较好的效果。

实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法，目前已广泛用于工、农、医药业生产和科学实验中。

本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和 PH值时酶的活性最大。

通过本实验初步掌握正交法的使用。

三、实验试剂及材料仪器1.2％血红蛋白液：于20ml蒸馏水中加入血红蛋白2.2g，尿素36g，lNNaOH溶液8ml，室温放置1小时，使蛋白变性。

如有不溶物，可过滤除去。

再加0．2MNaH2P04溶液至110ml及尿素4g，调节溶液pH达7.6左右。

2.15％三氯醋酸溶液：15g三氯醋酸溶于蒸馏水，并稀释至100ml。

3.牛胰蛋白水解酶液：3mg牛胰蛋白水解酶冷冻干粉，溶于10ml蒸馏水。

4. 0.1MpH7、8、9巴比妥缓冲液：见附录三。

5.Folin一酚试剂：见实验十七。

四、实验方法1 ．实验设计：本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、 pH 值。

每个因素选三个水平按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑；共需做 34 =81 次试验，而用正交表只需做9次试验。

选用L9 表（L是正交表的代号， L右下角的数字表示试验次数）。

L9表有两个特性；（ 1 ）每一列中“1”“2”“3” 这三个数字都出现三次，即它们出现的次数是相同的。

（ 2 ）每两列的横行组成的“数对”共有九个，九种不同的数对（1，1），（1，2），（1，3），（2，1），（2，2），（2，3），（3，1），（3，2），（3，3）各出现一次。

正交实验法正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。

正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。

正交实验设计包括两部分内容：第一，是怎样安排实验；第二，是怎样分析实验结果。

目录试验方法正交实验法举例•色试验方法我们知道如果有很多的因素变化制约着一个事件的变化，那么为了弄明白哪些因素重要，哪些不重要，什么样的因素搭配会产生极值，必须通过做实验验证（仿真也可以说是实验，只不过试验设备是计算机），如果因素很多，而且每种因素又有多种变化（专业称法是：水平），那么实验量会非常的大，显然是不可能每一个实验都做的。

能够大幅度减少试验次数而且并不会降低试验可行度的方法就是使用正交试验法。

首先需要选择一张和你的实验因素水平相对应的正交表，已经有数学家制好了很多相应的表，你只需找到对应你需要的就可以了。

所谓正交表，也就是一套经过周密计算得出的现成的实验方案，他告诉你每次实验时，用那几个水平互相匹配进行实验，这套方案的总实验次数是远小于每种情况都考虑后的实验次数的。

比如3水平4因素表就只有9行，远小于遍历试验的81次；我们同理可推算出如果因素水平越多，试验的精简程度会越高。

建立好实验表后，根据表格做实验，然后就是数据处理了。

由于试验次数大大减少，使得试验数据处理非常重要。

首先可以从所有的实验数据中找到最优的一个数据，当然，这个数据肯定不是最佳匹配数据，但是肯定是最接近最佳的了。

这是你能得到一组因素，这是最直观的一组最佳因素。

接下来将各个因素当中同水平的实验值加和（注：正交表的一个特点就是每个水平在整个实验中出现的次数是相同的），就得到了各个水平的实验结果表，从这个表当中又可以得到一组最优的因素，通过比较前一个因素，可以获得因素变化的趋势，指导更进一步的试验。

生化实验的方法--用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响1．正交试验设计法的基本思想正交试验设计法，就是使用已经造好了的表格--正交表--来安排试验并进行数据分析的一种方法。

它简单易行，计算表格化，使用者能够迅速掌握。

下边通过一个例子来说明正交试验设计法的基本想法。

[例1]为提高某化工产品的转化率，选择了三个有关因素进行条件试验，反应温度(A)，反应时间(B)，用碱量(C)，并确定了它们的试验范围：A：80-90℃B：90-150分钟C：5-7％试验目的是搞清楚因子A、B、C对转化率有什么影响，哪些是主要的，哪些是次要的，从而确定最适生产条件，即温度、时间及用碱量各为多少才能使转化率高。

试制定试验方案。

这里，对因子A，在试验范围内选了三个水平；因子B和C也都取三个水平：A：Al＝80℃，A2＝85℃，A3=90℃B：Bl＝90分，B2＝120分，B3=150分C：Cl＝5％，C2＝6%，C3＝7%当然，在正交试验设计中，因子可以是定量的，也可以是定性的。

而定量因子各水平间的距离可以相等，也可以不相等。

这个三因子三水平的条件试验，通常有两种试验进行方法：(Ⅰ)取三因子所有水平之间的组合，即AlBlC1，A1BlC2，A1B2C1，……，A3B3C3，共有33=27次试验。

用图表示就是图1 立方体的27个节点。

这种试验法叫做全面试验法。

全面试验对各因子与指标间的关系剖析得比较清楚。

但试验次数太多。

特别是当因子数目多，每个因子的水平数目也多时。

试验量大得惊人。

如选六个因子，每个因子取五个水平时，如欲做全面试验，则需56＝15625次试验，这实际上是不可能实现的。

如果应用正交实验法，只做25次试验就行了。

而且在某种意义上讲，这25次试验代表了15625次试验。

图1 全面试验法取点..........(Ⅱ)简单对比法，即变化一个因素而固定其他因素，如首先固定B、C于Bl、Cl，使A 变化之：↗A1B1C1 →A2↘A3 (好结果)如得出结果A3最好，则固定A于A3，C还是Cl，使B变化之：↗B1A3C1 →B2 (好结果)↘B3得出结果以B2为最好，则固定B于B2，A于A3，使C变化之：↗C1A3B2→C2 (好结果)↘C3试验结果以C2最好。

六、课程简介课 号：BI03020课程名称（中文）：生命科学导论课程名称（英文）：Introduction of Life Sciences学 时：60学 分：3开课学期：秋预修课程：高中生物适用对象和学科方向：低年级本科生、生物主要内容：该课程系统介绍了动物生物学的一些基本概念，内容以发育为主干，代谢、适应为中心，对动物的形态、解剖、生理、生态和分类等基本生物学原理作了简明的论述。

全书从微观动物界到宏观动物界，涉及分子、细胞、个体和群体四大水平。

课 号：BI03022课程名称（中文）：生物多样性及实验 I课程名称（英文）：The Biology Diversity and Experimental I学 时：40学 分：1.5开课学期：春预修课程：高中生物适用对象和学科方向：低年级本科生，生物主要内容：本课程分为必修实验（32学时）和选修实验（8学时）。

必修实验以各门代表动物为实验对象，对其进行观测解剖，记录其形态结构和生命活动。

结合动物生物学的基本概念和基本理论，从进化的角度，探讨其形态结构和生理功能的关系、生物体与环境的关系。

同时注重实验基本方法和技能的训练（包括显微镜的使用、生物制片、组织观察、动物外形的测量、动物解剖技术、分类技术等）。

选修实验让学生在给定的范围内任选实验内容，并以组为单位独立设计和完成，最后相互讨论结果。

在培养实验能力的同时，注重综合素质的训练。

课 号：BI03023课程名称（中文）：生物多样性及实验 II课程名称（英文）：The Biology Diversity and Experimental II学 时：40学 分：1.5开课学期：春预修课程：高中生物适用对象和学科方向：低年级本科生，生物主要内容：本实验课的内容包括种子植物的解剖结构和功能、植物的系统分类和实验设计等三方面的内容。

种子植物的解剖结构和功能，涉及到植物生物学实验技能和技巧（各种制片方法和观察方法、生物绘图、植物的离析和压片等等），植物细胞、组织、器官等多层次的结构、发育、生理功能及与环境的关系。