最新聚合酶链式反应PCR

pcr的原理和步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种基因扩增技术，可以通过复制DNA片段来产生大量的特定DNA序列。

PCR的原理和步骤
如下：
原理：
PCR基于DNA的体外扩增，使用DNA聚合酶来合成新的
DNA链。

其过程可以概括为三个主要步骤：变性、退火和延伸。

这些步骤在不同温度下进行，使用特定的引物来定向扩增目标DNA序列。

步骤：
1. 变性（Denaturation）：将含有所需DNA片段的DNA模板
加热至94-98℃的高温，使双链DNA解链成两条单链。

在此
过程中，氢键断裂，使两条链分离。

2. 退火（Annealing）：将温度降低至50-65℃，使引物与单链DNA模板的互补序列结合。

引物是DNA的短片段，其中一段序列与目标DNA序列的两端相互衔接。

3. 延伸（Extension）：将温度升高至72℃，加入DNA聚合酶
和足够的核苷酸（dNTPs），使DNA聚合酶沿着引物的互补
序列合成新的DNA链。

DNA聚合酶能够识别引物上的碱基对，并在其基础上合成新的DNA链。

此过程会在每一个DNA模
板两端的引物上进行。

以上步骤组成了PCR的一个循环。

通常，PCR会进行多个循
环，每个循环使DNA的数量翻倍，从而快速扩增目标DNA 序列。

PCR的结果是产生大量特定的DNA片段，可以用于分析、测序、克隆等应用。

《聚合酶链式反应技术》知识清单聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称 PCR）技术是现代分子生物学领域中的一项关键技术，它具有极其重要的应用价值。

一、PCR 技术的原理PCR 技术的基本原理其实并不复杂。

想象一下，我们有一条很长的DNA 链，就像一条长长的绳子。

我们的目标是把其中特定的一小段“剪”下来并进行大量复制。

首先，我们要知道这段特定 DNA 片段的两端序列，然后根据这两端的序列设计出一对引物。

引物就像是两个小钩子，能够特异性地与目标 DNA 片段的两端结合。

接下来，把 DNA 模板、引物、四种脱氧核苷酸（dNTPs）、耐高温的 DNA 聚合酶（比如 Taq 聚合酶）以及合适的反应缓冲液混合在一起，放入 PCR 仪中。

PCR 仪会按照设定的程序，先将反应体系加热到 90-95℃，使 DNA 双链变性，变成两条单链。

然后，温度降低到 50-65℃，引物与单链DNA 结合，这一步叫做退火。

最后，温度升高到 70-75℃，DNA 聚合酶沿着引物的方向合成新的 DNA 链，这就是延伸。

这样，经过一个循环，原来的一条DNA 双链就变成了两条。

然后，再经过多次这样的循环，目标 DNA 片段就会以指数形式大量扩增。

二、PCR 技术的反应体系一个完整的 PCR 反应体系通常包括以下几个主要成分：1、 DNA 模板：这是我们要扩增的对象，可以是基因组 DNA、质粒 DNA 或者 cDNA 等。

2、引物：引物是决定 PCR 特异性和扩增效率的关键因素。

它们是一小段人工合成的寡核苷酸序列，通常长度在 18-30 个碱基之间。

3、四种脱氧核苷酸（dNTPs）：包括 dATP、dTTP、dCTP 和dGTP，它们是合成新 DNA 链的原料。

4、 DNA 聚合酶：常见的有 Taq 聚合酶，具有耐高温的特性，能够在高温条件下保持活性。

5、反应缓冲液：提供合适的离子强度、pH 值等反应条件，以保证反应的顺利进行。

实验二 PCR扩增（聚合酶链式反应）一、实验目的1.学习聚合酶链式反应概念及技术方法；2.掌握聚合酶链式反应操作过程。

二、实验原理（聚合酶链式反应）PCR是聚合酶链式反应，是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。

反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。

因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成1．模板DNA的变性模板DNA加热到90-95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。

故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。

对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。

2．模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至37-65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。

关键词：核酸标记通过核酸标记技术可将细胞因子cDNA作为基因探钊检测细胞内细胞因子基因组DNA或mRNA。

主要有以下几种方法：1.应用同位素（或非同位素）标记的cDNA探针，检测经Northern blot后细胞因子mRNA水平或采用打点杂交法。

2.应用标记cDNA探钊与细胞或组织切片进行原位杂交，然后进行放射自显影。

3.细胞因子mRNA经反转录为cDNA，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子cDNA,Southern blot后用标记探针检测特异细胞因子DNA水平。

核酸扩增检测技术的研究进展(作者傅占江来源摘自：《国外医学临床生化学与检验学分册》)聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。

近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。

已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。

前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。

信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。

而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。

这些方法的区别见表1。

表1 不同核酸扩增技术的特性fig2058BDNA：枝状DNA,LCR：连接酶链式反应；NASBA：依赖性核酸序列的扩增；PCR：聚合酶链式反应；RCA：滚环扩增：RT-PCR：逆转录PCR; SDA: 链替代扩增；SNP：单核苷酸多态性：TMA：转录依赖的扩增；Invader:侵染检测技术1 反应（PCR）在DNA扩增方面,PCR一直是应用最广泛的方法。

美国食品与与药品管理局（FDA）已经批准一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒（Roche）,如HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等。

聚合酶链式反应pcr
1 聚合酶链式反应PCR
聚合酶链式反应（PCR）是一种允许大量翻倍指定的DNA序列的分
子生物技术。

通过利用特殊的酶（聚合酶）将两个DNA片段分别相互“拉伸”，重复地迭代扩增，合成更长的片段。

1.1 PCR的原理
PCR主要利用DNA聚合酶的功能来调控DNA片段的重复扩增与合成。

扩增过程分为三个步骤，即引物扩增、双螺旋扩增、保守分裂。

引物
扩增过程中，首先将扩增片段与反转录引物结合起来，DNA聚合酶将其复制到双螺旋结构；双螺旋扩增过程中，DNA聚合酶会主动分裂双螺旋，然后重复复制双螺旋，产生DNA序列的复制品；最后，保守分裂过程中，会继续分裂DNA双螺旋，直到完成指定的扩增任务。

1.2 PCR的应用
PCR技术有着广泛的应用，主要包括临床诊断应用、筛检、疾病分子检测等。

其中，PCR已经被广泛应用在心脑血管疾病、肿瘤、感染性疾病以及遗传病的检测上，准确可靠地检测出各种疾病的抗原。

另外，PCR技术在基因组学研究中也有广泛应用，可以用来进行基因鉴定、基因表达研究、比较基因组研究等。

在微生物学研究中，PCR技术也可以用来识别和遗传分类各种细菌和病毒，可以研究它们的源头和传播路径。

由此可见，聚合酶链式反应PCR技术无疑是一种重要而有用的分子生物技术，它已经得到广泛的应用，在诊断、疾病研究以及基因组学研究中发挥着重要作用。

聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。

典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。

因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。

它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

通常，PCR 在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．T aq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

聚合酶链式反应（PCR）第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。

PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。

在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。

反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。

因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。

1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。

变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。

对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。