N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的快速纯化及性质
- 格式：pdf
- 大小：799.36 KB
- 文档页数：5
下载文档原格式
合集下载
四 固定化酶的性质
合成方法
合成方法是利用天然高分子材料包埋 磁性微粒,或在磁流体存在下进行聚合 反应, 均可得到纳米级的磁性微球
2 其它新型载体
导电聚合物作为酶固定化载体时可用于酶 电极类生物传感器的制备。 光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定化酶时, 条件温和, 可获得酶活力较高的固定化酶。 N - 异丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得 到温敏性水凝胶载体, 用于固定嗜热菌蛋 白酶时可实现均相催化和异相分离的统一
固定化后酶稳定性提高的可能原因
固定化后酶分子与载体多点连接．可防止 酶分子伸展变形。 酶活力的缓慢释放。 抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合， 由于酶失去了分子间相互作用的机会，从 而抑制了降解。
(三)固定化酶的最适温度变化
酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综 合结果。 由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温 度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，汤 亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度 为80℃，比固定化前提高了30℃。 也有的固定化后会降低 固定化的最适温度受固定化方法和固定化载体的 影响。
四 固定化酶的性质
由于固定化常常是一种化学修饰，酶本身 的结构必然受到扰动，同时酶固定化 后．其催化作用由均相移到异相，由此带 来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质 造成的分配效应等因素必然对酶的性质产 生影响。
(一)固定化后酶活力的变化
多数情况下比天然酶小，其专一性也能发 生改变。 例如，用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋 白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活 力的30％，而对低分子底物苯酞精氨酸－ 对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以， 一般认为高分子底物受到空间位阻的影响 比低分子底物大。
工程菌生物转化D氨基酸与其相关酶的研究
工程菌生物转化D-氨基酸及其相关酶的研究【摘要】：D-氨基酸作为一类手性化合物，在医药、农业和食物等领域中的用途正在被普遍而迅速地挖掘。
但D-氨基酸难于从天然产物中直接取得，虽可化学合成但线路复杂、高度污染、价钱昂贵。
为此利用酶生物转化工艺，即D-海因酶(D-Hydantoinase，HYD)和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(D-Carbamoylase，CAB)两酶催化5’-单替代海因从而取得相应的D-氨基酸成为首选方式，该工艺线路具有特异性好、产物光学纯度高、无污染等长处，已成为目前工业生化领域的热点之一。
咱们将假单胞菌PseudomonasputiaYZ26中的HYD基因进行了随机突变、定点突变和截短突变，并对突变后的酶性质进行了一系列研究。
又从中华根瘤菌Sinorhizobiumsp．SS-ori中克隆了CAB 基因，并将其插入到表达载体中，实现了在大肠杆菌宿主菌中可溶表达。
同时，将这两个酶基因别离插入到了具有不同抗性的载体中，然后把两个重组质粒共转化到(DE3)感受态细胞，取得了能够同时表达HYD和CAB的工程菌细胞。
利用该工程菌转化5’-异丙基海因然后对产物进行了纯化，取得了具有必然光学纯度的D-缬氨酸。
为生物转化工业创建了工程菌一步转化D-氨基酸的新工艺。
1．HYD的突变酶分子定向进化实验流程包括突变体分子文库的成立和其高通量挑选两个主要环节。
咱们在已构建表达工程菌株pE-hyd／E．coliBL21(DE3)的基础上，利用易错PCR技术使D-海因酶基因引入随机突变，经反复优化，将PCR条件确立为／LMn~(2+)+3mmol ／LMg~(2+)、／LMn~(2+)+3mmol／LMg~(2+)、／LMn~(2+)+／LMg~(2+)三个离子浓度梯度。
将PCR扩增产物克隆到pET-3a载体，转化(DE3)，利用96孔板挑选了近1，000个克隆，最终取得较高活性的产酶菌株：pE-hyd_(41)／E．coliBL21(A)和pE-hyd_(45)／E．coliBL21(B)。
α-氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质
－1 化合成头孢克洛的 k cat 为 547. 3 ± 38. 2 s 。【结论 】 有关红纹黄单胞菌 α -氨基酸酯水解酶的酶学性质研究相对
本文的研究将为该酶催化合成 β -内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数 。 较少， 关键词 ： α -氨基酸酯水解酶，β -内酰胺类抗生素，分离纯化，酶学性质，乒乓机制 中图分类号 ： Q814 文献标识码 ： A 6209 （ 2012 ） 05062009 文章编号 ：0001应条件温和， 而且无污染
屈凤等： 红纹黄单胞菌 α -氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质 ． / 微生物学报（ 2012 ） 52 （ 5 ）
621
底物仅限 于 含 游 离 α -氨 基 的 酰 基 供 体， 因此它比 PA 更 适 合 合 成 氨 苄 青 霉 素 、 头 孢 氨 苄、 头孢克洛等 带有 α -氨基的 β -内 酰 胺 类 抗 生 素
［2 － 3］
β -内酰 胺 类 抗 生 素 是 含 有 β -内 酰 胺 环 的 一 大 常见 的 有 青 霉 素 和 头 孢 菌 素 。 它 主 要 是 类抗生素， 通过与青霉 素 结 合 蛋 白 （ PBPs ） 共 价 结 合 抑 制 细 菌 细胞壁肽聚糖的合成， 从而产生细胞壁缺损细菌， 当 这些细菌处于不 利 环 境 时， 极易裂解死亡
。由于
这类抗生素选择 性 好， 杀 菌 作 用 强， 适 用 症 广， 它们 成为了最重要的一类抗感染药物 。 目前这类抗生素 可采用化学法和酶 法 合 成， 化学法合成不仅步骤繁 琐， 能源消耗大， 还 涉 及 大 量 有 毒 有 害 的 试 剂， 对环 酶法合成工艺简单 、 反 境造成严重污染 。 相比而言，
［1］
， 因 此， 有关酶法合成
［4 － 7］
本文的研究将为该酶催化合成 β -内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数 。 较少， 关键词 ： α -氨基酸酯水解酶，β -内酰胺类抗生素，分离纯化，酶学性质，乒乓机制 中图分类号 ： Q814 文献标识码 ： A 6209 （ 2012 ） 05062009 文章编号 ：0001应条件温和， 而且无污染
屈凤等： 红纹黄单胞菌 α -氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质 ． / 微生物学报（ 2012 ） 52 （ 5 ）
621
底物仅限 于 含 游 离 α -氨 基 的 酰 基 供 体， 因此它比 PA 更 适 合 合 成 氨 苄 青 霉 素 、 头 孢 氨 苄、 头孢克洛等 带有 α -氨基的 β -内 酰 胺 类 抗 生 素
［2 － 3］
β -内酰 胺 类 抗 生 素 是 含 有 β -内 酰 胺 环 的 一 大 常见 的 有 青 霉 素 和 头 孢 菌 素 。 它 主 要 是 类抗生素， 通过与青霉 素 结 合 蛋 白 （ PBPs ） 共 价 结 合 抑 制 细 菌 细胞壁肽聚糖的合成， 从而产生细胞壁缺损细菌， 当 这些细菌处于不 利 环 境 时， 极易裂解死亡
。由于
这类抗生素选择 性 好， 杀 菌 作 用 强， 适 用 症 广， 它们 成为了最重要的一类抗感染药物 。 目前这类抗生素 可采用化学法和酶 法 合 成， 化学法合成不仅步骤繁 琐， 能源消耗大， 还 涉 及 大 量 有 毒 有 害 的 试 剂， 对环 酶法合成工艺简单 、 反 境造成严重污染 。 相比而言，
［1］
， 因 此， 有关酶法合成
［4 － 7］
N_氨甲酰_D_氨基酸酰胺水解酶的融合表达_纯化和酶活性
!： &’( )*+,-./ 0*+1 234+15. %#6 +0 7/*854 99 $ +*5: "; )<6= $ .">: ?; )<%: @; )<% A B81C !D C54," E : F; &’( )*+,-./ +0 %’873 2343 0*+1 )<%: <*!; %= $ "GGG: <*"; # %#6 A H.+( !D C54," E
! + 内酰胺类抗生素是在世界范围内广泛使用的 抗菌类药物。 其中I 半合成抗生素如阿莫西林 ’ 4C.N0;0EE0O * 因其易口服和溶血性好等特点而成为制 药工业关注的焦点 P !I ( Q 。 阿莫西林是由 2 + 对羟基苯甘 氨酸 ’ 2 + 7 + RDS/.ND7R6ODE + KED;0O6I 2 + T>U * 与青霉 素 的 母 核 % + 氨 基 青 霉 烷 酸 ’ % + 4C0O. + 76O0;0EE0; 4;0SI %9>9 * 两部分缩合而成 I 具光学活性的 2 + T>U 是以 2: + 对羟基苯海因 ’ 2: + RDS/.ND + 7R6ODE RDS4O# H.0OI 2: + T>T * 作为前体 I 通过内酰胺脲转化反应 P , Q 而生成。 实现这一转化可采用以下几种方法 V 一种是化 由于没有大批量及 学合成 I 目前主要采用乙醛酸法 P ) Q 。 高质量的乙醛酸供应 I 使下游产品的价格优势得不到 充分发挥 I 影响产品的市场发展 W 另一种是化学和酶法 相结合 I 先采用海因酶将底物首先转化成 1 + 氨甲酰 + 2 + 对羟基苯甘氨酸 I 再用化学法切除氨甲酰基 I 但化学法反应条件激烈且产率低； 第三种是双酶法 I 又 称 一 步 转 化 法 I 即 利 用 海 因 酶 ’ 2 + TDS4OH.0O456I T2X456 * 和 1 + 氨甲酰 + 2 + 氨基酸酰胺水解酶 ’ 2 + 34/Y4C.DE456I 23456 * 两酶同时催化 Z’ + 替代海因形 成 2 + T>U P Z Q ’ G0K@ ! * 。 首先在海因酶的作用下I 使 2: + T>T 变 为 1 + 氨 甲 酰 + 2 + 对 羟 基 苯 甘 氨 酸 ’ 37T>U * I 之后在 23456 的作用下生成 2 + T>U。 由于 一步转化法条件温和 I 收率高 I 已被企业界广泛采用。 用一菌一步转化生产 2 + T>U 已有不少报道
N氨甲酰基D氨基酸酰胺水解酶基因的克隆与表达
& & /+& =6=5:; : & & ’()%# 2 & /+ : $BF/ /IJ.FO : : HIJKHFE.LM HIJKHFE.LM HIJFLO.... HIJK4FE.LM HIJ----.-N0.0EN/PR0 N0.0EN/PR0 N0.0EN/PR0 N0.0EN/PR0 N0.0EN/PR0 KKM+F.J.0I KKM+F.J.0I KHM+F/J/0I KKM+F.J.0I K- M+F-J-0I I0H+M+LLJ+ I0H+M+LLJ+ 40H+M+0IK+ I0H+M+LLJ+ -0H+M+----+ J0KLLLJEEN J0KLLMJEEN J4NILJJEF. J0KLLLJEER J---L--JEEP04..0EMF EP0I..0EMF EPN0.4JE0F EP04..0EMF EP--.--E-F
’#./0 的 氨 基 酸 序 列 同 & & ’()%#*("+,- 67789::;<: 和 & & /+ =6=5:; 的同源性高达 <>? 和 <@ & 5? ，而 与 假 单 孢 杆 菌 ./,0 )#1#2(/ & /+ 只 有 )> & <? 。
: & 重组工程菌未诱导； ; & 重组工程菌 %5A 诱导 :;B； % & 标准纯 ’#./0
6
$%$
材料与方法
材料
。
’#./0 的 氨 基 酸 序 列 同 & & ’()%#*("+,- 67789::;<: 和 & & /+ =6=5:; 的同源性高达 <>? 和 <@ & 5? ，而 与 假 单 孢 杆 菌 ./,0 )#1#2(/ & /+ 只 有 )> & <? 。
: & 重组工程菌未诱导； ; & 重组工程菌 %5A 诱导 :;B； % & 标准纯 ’#./0
6
$%$
材料与方法
材料
。
N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶研究进展
N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶研究进展
赵莉霞;范俊虎;袁静明
【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》
【年(卷),期】2002(023)006
【摘要】用生物转化法生产D-氨基酸已经成为国内外半合成抗生素行业的支柱之一。
此外，D-氨基酸及其衍生物还是甜味剂、拟除虫菊脂、多肽激素等诸多产品的重要中间体。
介绍D-氨基酸生物转化中N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的一些生化性质、结构特征及催化机制等方面的研究进展。
【总页数】3页(P255-257)
【作者】赵莉霞;范俊虎;袁静明
【作者单位】山西大学生物工程研究中心，太原 030006;山西大学生物工程研究中心，太原 030006;山西大学生物工程研究中心，太原 030006
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1+1
【相关文献】
1.N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆与表达 [J], 赵莉霞;钮利喜;范俊虎;袁静明
2.N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺 [J], 张小飞;朱银惠;王璐璐
3.N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的快速纯化及性质 [J], 袁静明;石亚伟;杨秀清;连惠勇;齐延红
4.重组大肠杆菌共表达D-海因酶和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶 [J], 胡晓佳;
李强;丛进阳
5.N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶生产菌的选育 [J], 莫章桦;刘友全;张小飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《信息检索》综合大作业.doc.
《信息检索与利用》课程综合大作业课题名称：产海因酶菌株的研究及发展前景专业：平面设计班级：BM平面101学号：1051410107姓名：赵洋得分：完成时间： 2011 年 12 月 19 日评分体系及项目得分1．课题的难度系数值（5分）得分2．选择和使用工具书(检索系统)的情况：（1）选择工具书、刊或检索系统的种类（10分）得分（2）查的文献条目的数量（5分）得分（3）所查文献的出版类型（5分）得分（4）所查的原始文献的文种(限中英文两种)（5分）得分（5）外文文摘的翻译情况（至少翻译一篇）（5分）得分（6）综合运用所选工具书、各种索引的能力（5分）得分（7）查全率（所查检索条目与选择课题的针对性的评价）（15分）得分3.原始文献的获取情况（5分）得分4．按照“步骤要求”和“格式要求”完成实习报告情况（5分）得分5．按照格式要求撰写模拟论文 (20分) 得分总得分：课题名称：产海因酶菌株的研究及发展前景一、分析研究课题1．背景分析：海因酶是-类催化水解海因、5-取代海因及其它海因衍生物的内酰胺键，生产D型或L型N-氨甲酰基-氨基酸的酶。
海因酶广泛分布在微生物、植物、动物等有机体。
但是有工业化应用前景的海园酶主要来自微生物海因酶是转化生产D一型氨基酸的关键酶，而D一型氨基酸及其斯生物是医药及食品领域的重要原材料，它不但广泛用于生产半合成抗生素，而且还作为合成多肽，激素、拟除虫菊酯及甜味剂等的中间物。
然而大多数微生物来豫的海因酶由于不耐热等种种原因，很难纯化及用于工业化生产中。
近年来，才陆续报道了几例稳定性较好的海因酶。
在医药工业上具有重要应用价值。
有关海因酶的报道始于上个世纪30年代初，在以后的研究中人们发现不同动物的某-特定组织和植物以及微生物中都有海因酶。
经研究发现二氢嘧啶酶是海因酶的一种．可归类于D-海因酶。
在D-海因酶中因来源不同对海因的5-取代基具有不同的底物特异性。
产海困酶菌株的选育，目前国际上普谊采用以底物为唯一氮源(或碳源)以及对二甲氨基甲醛(PDAB)显色的方法。
生化技术固定化酶及微生物
此外，随着反应体系离子强度的增大，或者载体粒度的增大，米氏 常数也会增大。一般，载体的颗粒越小，固定化酶越接近游离状态的酶， 米氏常数就越接近。
●固定化酶的最大反应速度与游离酶相比，要依具体情况而定。大多数 酶经固定化以后， Vm 变化不大，但也有由于固定化方法不同而有差异 的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其Vm 与游离酶相同； 但用PEAE凝胶包埋的转化酶，其Vm却只 相当于游离酶的1/10。
固定化酶稳定性提高的原因可能是： ➢带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间 构象起到稳定作用 ➢蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生 ➢固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机 溶剂等对酶的进攻破坏作用
（四）米氏常数
●米氏常数（K m ）是酶的一个特征性常数，每一种酶都有一定的K m 值，其倒数1/ K m 称为亲和常数，用来表示酶与底物的亲和力；而固定 化酶的K m 值和最大反应速度（Vm ）常因酶蛋白结构的变化和载体带电 荷的影响而变化。
缺点：这种固定化酶制品只能应用于底物和产物的分子质量都小的反 应中
四、固定化微生物的制备
目前，固定化微生物的制备方法最多的是包埋法， 其次是载体结合法和交联法；另外，还有用选择性 热变法制备固定化微生物的，就是将细胞在适当温 度下进行处理，使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性 而使酶固定与细胞内的方法
此外，顺丁烯二酸酐或乙烯共聚物与酶分子在六 甲撑二氨作用下，相互间进行反应，亦可制成固定 化酶
3、包埋法
定义： 就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高 分子半透膜中制成固定化酶的方法
分类：包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型
优点：由于包埋法制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变 化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应 用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚 乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单
●固定化酶的最大反应速度与游离酶相比，要依具体情况而定。大多数 酶经固定化以后， Vm 变化不大，但也有由于固定化方法不同而有差异 的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其Vm 与游离酶相同； 但用PEAE凝胶包埋的转化酶，其Vm却只 相当于游离酶的1/10。
固定化酶稳定性提高的原因可能是： ➢带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间 构象起到稳定作用 ➢蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生 ➢固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机 溶剂等对酶的进攻破坏作用
（四）米氏常数
●米氏常数（K m ）是酶的一个特征性常数，每一种酶都有一定的K m 值，其倒数1/ K m 称为亲和常数，用来表示酶与底物的亲和力；而固定 化酶的K m 值和最大反应速度（Vm ）常因酶蛋白结构的变化和载体带电 荷的影响而变化。
缺点：这种固定化酶制品只能应用于底物和产物的分子质量都小的反 应中
四、固定化微生物的制备
目前，固定化微生物的制备方法最多的是包埋法， 其次是载体结合法和交联法；另外，还有用选择性 热变法制备固定化微生物的，就是将细胞在适当温 度下进行处理，使细胞膜蛋白变性，但不使酶变性 而使酶固定与细胞内的方法
此外，顺丁烯二酸酐或乙烯共聚物与酶分子在六 甲撑二氨作用下，相互间进行反应，亦可制成固定 化酶
3、包埋法
定义： 就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高 分子半透膜中制成固定化酶的方法
分类：包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型
优点：由于包埋法制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变 化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应 用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚 乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单
D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用[发明专利]
专利名称：D-氨甲酰水解酶突变体及其在D-芳香族氨基酸合成中的应用
专利类型：发明专利
发明人：倪晔,刘亚菲,许国超,韩瑞枝
申请号：CN202010382460.0
申请日：20200508
公开号：CN111454933A
公开日：
20200728
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种D‑氨甲酰水解酶突变体及其在D‑芳香族氨基酸合成中的应用，属于基因工程技术领域。
本发明的D‑氨甲酰水解酶突变对多种N‑氨甲酰氨基酸具有较高的活力，可以催化多种脂肪族或芳基取代的氨基酸底物，尤其是空间位阻较大的D‑N‑氨甲酰氨基酸底物。
将这些突变体用于海因酶过程级联反应进行催化500mM L‑吲哚甲基海因的验证，其中五突变体
A200N/R211G/D187N/S207A/E138W在反应12h时产物得率已经达到81.7％，相比WT(40.1％)，产物得率提升2倍，且反应时间大大缩短，仅需12h。
本发明所获得的D‑氨甲酰水解酶突变体特别适用于海因酶过程级联反应制备光学纯的D‑氨基酸，具有良好的工业应用前景。
申请人：江南大学
地址：214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王玉仙
更多信息请下载全文后查看。
n-氨基甲酰化的催化赖氨酸残基
n-氨基甲酰化的催化赖氨酸残基
n-氨基甲酰化是一种化学反应，通常用于对蛋白质中的赖氨酸残基进行修饰。
这种修饰可以改变蛋白质的性质和功能，并对其在生物学中的活性产生影响。
在n-氨基甲酰化反应中，赖氨酸残基的氨基被转化为酰胺，使其化学性质发生变化。
这种修饰通常是通过将相应的活性试剂与蛋白质中的赖氨酸残基反应来实现的。
一些常见的用于n-氨基甲酰化赖氨酸残基的试剂包括硝基甲烷、氰酸盐、异氰酸酯等。
这些试剂与赖氨酸残基的氨基反应，生成相应的酰胺。
需要注意的是，n-氨基甲酰化是一种化学修饰反应，可能会对蛋白质的结构和功能产生影响。
因此，在进行这种修饰时，需要谨慎操作，并确保对蛋白质的性质和功能进行充分的评估。