总黄酮总酚含量测定方法
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太行菊的抗氧化活性试验计划
1. 实验内容
对太行菊的甲醇提取物的乙醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水共六种萃取物进行总酚、总黄酮含量的测定，分析实验结果，选择总分和总黄酮含量比较高的两个层分进行抗氧化能力测定，分析其抗氧化能力强弱，判断其有无研究价值。
用Folin-Denis法测定太行菊甲醇提取物各萃取层组分的总酚含量，以没食子酸作为标准品进行对照。
用三氯化铝法测定太行菊各萃取层组分的总黄酮含量，以槲皮素作为标准品进行对照。
根据实验结果，选择总酚和总黄酮含量较高的萃取层组分进行抗氧化能力测定，包括DPPH自由基清除能力测定，羟基自由基清除能力测定，还原能力测定。
2.实验步骤
将太行菊用甲醇溶液回流提取其有效成分，旋转浓缩后用水溶解，然后分别用正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取、水层，得相应层的馏分。
2.1总酚含量测定：在试管中分别加入不同层样品（1mg/ml）0,25ml +Folin-Denis 试剂0.5ml ，5min后，再加入Na2CO3饱和溶液0.5ml,并做三组重复。
对照组中样品和Folin-Denis试剂用DW代替，其他不变。
空白组中Folin-Denis试剂用DW代替，其他不变。
在760nm紫外光下测定吸光度。
对实验结果处理后做标准曲线，以没食子酸为标准品。
以没食子酸的微克数表示总酚含量:吸光度=0.0069 μg没食子酸－0.042。
Folin-Denis试剂的配制：在2L烧瓶中加入750ml蒸馏水，再加入100g钨酸钠和20g磷钼酸，再加入50ml正磷酸回流2h, 冷却后装入1L容器内置于暗处
实验组*3:
体积Folin-Denis的体积Na2CO3
MEOH层0.25ml 0.5ml 0.5ml
H层0.25ml 0.5ml 0.5ml
CH层0.25ml 0.5ml 0.5ml
EA层0.25ml 0.5ml 0.5ml
BUOH层0.25ml 0.5ml 0.5ml
W层 1 2 2
对照组*3：
DW DW Na2CO3
体积0.25ml 0.5ml 0.5ml
空白组*3：
体积DW的体积Na2CO3
MEOH层0.25ml 0.5ml 0.5 ml
H层0.25ml 0.5ml 0.5 ml
CH层0.25ml 0.5ml 0.5ml
EA层0.25ml 0.5ml 0.5ml
BUOH层0.25ml 0.5ml 0.5 ml
W层0.25ml 0.5ml 0.5ml
2.2总黄酮含量测定：在试管中分别加入不同层样品(1mg/ml) 0.5ml + 1M CH3COOK溶液0.1ml + DW 2.8ml + 95%乙醇 1.5ml + 10% AlCl3·6H2O溶液0.1ml，并做三组重复。
对照组中样品和AlCl3·6H2O溶液用DW代替，其他不变。
空白组中AlCl3·6H2O溶液用DW代替，其他不变。
所配溶液在室温下放置40分钟后在510nm紫外光下测定吸光度。
对实验结果处理后做标准曲线，以槲皮素为标准品。
以槲皮素的微克数表示总黄酮含量: 吸光度=0.0066 μg槲皮素－0.0357。
实验组*3：
体积CH3COOK DW 95%乙醇AlCl3·6H2O MEOH层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
H层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
CH层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
EA层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml BUOH层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
W层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
对照组*3：
DW CH3COOK DW 95%乙醇DW
体积0.5ml 0.1ml 2.8ml 1.5ml 0.1ml
空白组*3：
体积CH3COOK DW 95%乙醇DW MEOH层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
H层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
CH层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
EA层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml BUOH层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml
W层0.5ml 0.1ml 2.8 ml 1.5ml 0.1ml 根据实验结果选择总酚和总黄酮含量较高的组分进行DPPH自由基清除能力测定、羟基自由基清除能力、还原能力的测定。
2.3DPPH（1,1-二苯基苦基苯肼自由基）自由基清除能力的测定
将总酚和总黄酮含量较高的两组样品配制成：1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，50μg/mL，100 μg/mL5个浓度
对照组: 0.5mL 0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液+ 0.5mL试样溶剂（水），
测试组：0.5mL 0.2mmol/L的DPPH甲醇溶液+0.5mL待测样品溶液，
空白组: 0.5mL样品溶液+0.5mL试样溶剂（水）,混合均匀后室温下于暗处静置30 min，然后在517 nm处测定吸光度。
由下面的方程计算样品对DPPH自由基的清除能力：
消除效率（%）=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100％
2.4羟基自由基清除能力测定：抗氧化能力是用Fe3+的螯合物(如Fe-EDTA)存在下的Fenton型Haber-Weiss反应产生HO·来测定的。
将总酚和总黄酮含量较高的两组样品配制成：1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，50μg/mL，100 μg/mL5个浓度试管中依次加入100 μL的FeSO4·7H2O、EDTA、2-脱氧核糖、100 μL各浓度的样品溶液（对照组加入100 μL样品溶剂水）、500 μL磷酸缓冲溶液，100
μL H2O2于试管中,于37 ℃水浴加热4小时。
然后加入三氯乙酸(TCA)、二硫代巴比妥酸（TBA）各500 μL。
之后将它们放在100 ℃恒温水浴锅中，冷却，3000 rpm，离心5分钟。
最后分别测定各样品在532 nm下的吸光度，每个样品的每个浓度重复3次。
然后根据实验结果计算消除效率。
消除效率（%）=（1-As/Ao）× 100％
其中：As为待测溶液的吸光度
Ao为对照组溶液的吸光度
2.5 还原能力测定
将总酚和总黄酮含量较高的两组样品配制成50、100、200、500、1000 μg/mL，分别移取各浓度的样品1 mL于试管中加入磷酸盐缓冲液(pH=6.6) 2.5 mL，再加入1%铁氰化钾溶液2.5 mL，在50 ℃下反应30 min。
然后加入10% 三氯乙酸溶液2.5 mL 充分混和均匀，3000 rpm下离心10 min。
移取上清液2.5 mL于试管中，加入2.5 mL蒸馏水，再加入0.1 %三氯化铁0.5 mL，常温下反应5 min，然后使用紫外可见分光光度计于700 nm波长下测定吸光值。
同时做空白对照组，不加样品，加入1 mL蒸馏水。
每组实验重复3次。
