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研究蛋白质与蛋白质互作的方法一、研究蛋白质与蛋白质互作的方法1. X-Ray凝聚态晶体学X-Ray凝聚态晶体学方法是用来测定单个蛋白质的空间结构的有效方法，它可以被用来研究蛋白质的互作。
X-Ray凝聚态晶体学方法使用X射线照射晶体，从而创建晶体中蛋白质的X射线衍射图案。
这些图案可以被用来确定蛋白质的空间结构，从而使研究人员能够理解晶格中存在的共振间隙（即两个作用蛋白质间的空间位置），从而提供有关拆分蛋白质之间的紧密互作的信息。
2. 蛋白质-蛋白质交叉反应蛋白质-蛋白质交叉反应是一种可以直接识别作用蛋白质之间的相互作用的技术，它通过检测不同的蛋白质之间的相互作用，从而提供有关他们之间互作的信息。
在蛋白质-蛋白质交叉反应中，首先需要将蛋白质层层复合，然后通过检测复合物的性质来测试蛋白质之间的相互作用。
3. 高通量蛋白质免疫小鼠高通量蛋白质免疫小鼠技术是一种比较新的研究蛋白质互作的技术。
它可以用来检测不同的蛋白质之间的相互作用，在高通量蛋白质免疫小鼠中，研究人员可以同时检测多个蛋白质之间的相互作用，从而提供更多的信息。
4. 免疫印迹免疫印迹技术是一种用来研究蛋白质互作的技术，它利用抗体来检测不同蛋白质之间的互作。
在免疫印迹技术中，研究人员将经过特殊处理的蛋白质溶液滴在特定的'膜'上，然后将抗体滴到它们上面，最后通过观察抗体与膜上的蛋白质之间的作用来判断蛋白质之间的互作情况。
5. 蛋白质-蛋白质结合实验蛋白质-蛋白质结合实验是用来研究蛋白质之间的相互作用的有效的方法，它可以用来研究某一特定蛋白质与其他蛋白质的结合关系。
它以一种可以检测不同蛋白质之间的结合关系的方式，来推断蛋白质之间的相互作用。
检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术蛋白质之间的相互作用对于生物体的正常功能和生理进程至关重要。
因此，了解和研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用对于疾病研究和新药发现具有重要意义。
本文将介绍常见的用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术。
1. 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）免疫沉淀是一种常用的方法，用于鉴定和分离与特定抗原相互作用的蛋白质。
该方法利用特异性抗体结合特定蛋白质并沉淀出来，然后通过电泳、质谱或免疫印迹等分析方法进行检测。
这种方法不仅可以用于识别特定的蛋白质-蛋白质相互作用，还可以捕获整个蛋白质复合物。
2. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）酵母双杂交是一种广泛应用于蛋白质-蛋白质相互作用的实验技术。
该方法利用了转录因子的两个功能域的相互作用来检测蛋白质-蛋白质相互作用。
这种方法包括构建两个融合蛋白质：一个与DNA结合域融合的结构域和一个与激活域融合的结构域。
当两个融合蛋白质相互结合时，它们能够重新组装转录因子并激活报告基因的表达。
3. 质谱（Mass Spectrometry，MS）质谱是一种常用于分析蛋白质-蛋白质相互作用的技术。
图谱可以通过分析蛋白质混合物的质量和荷质比来确定蛋白质相互作用的可能性。
质谱技术包括多肽和蛋白质质量指纹图谱（Peptide and protein mass fingerprinting），包括基于基质辅助激光脱附电离（Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）和电喷雾（Electrospray Ionization，ESI）的方法。
4. X射线晶体学（X-ray crystallography）X射线晶体学是一种用于解析蛋白质-蛋白质相互作用的高分辨率结构的技术。
该方法涉及到将蛋白质复合物结晶成晶体，然后通过测量和分析这些晶体所产生的X射线散射模式来确定蛋白质的结构及相互作用。
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用① FRET技术（in vivo）FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。
该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。
然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。
如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。
② 酵母双、三杂交技术（in vivo）酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。
这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。
由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。
一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。
如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。
该系统的原理如下图所示：如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。
将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。
蛋白质相互作用蛋白质相互作用的概述一、为什么要研究蛋白质相互作用二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB]三、蛋白质相互作用的应用A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合，C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。
五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能I、一些常用蛋白质相互作用技术•Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation)•Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag•(co-)Immunoprecipitation•Western和 Far-Western blotSurface Plasmon ResonanceTwo-Hybrid SystemFluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)（实验过程及原理，注意事项，优缺点）III、研究实例讨论一、酵母双杂交系统作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团具体过程：见书本优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
蛋白质与蛋白质相互作用的技术
蛋白质与蛋白质相互作用的技术主要包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术、荧光能量转移技术、噬菌体展示技术等。
这些技术可用于研究蛋白质之间的相互作用，从而深入了解生命活动的机制。
1.酵母双杂交技术：这是一种有效的筛选蛋白质相互作用的方法，尤其适用
于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
通过将目标蛋白与报告基因连接，在酵母细胞中检测报告基因的表达，可以确定目标蛋白与其他蛋白的相互作用。
2.免疫共沉淀技术：利用抗体与抗原之间的特异性结合，将目标蛋白与其他
相关蛋白一起沉淀下来，然后通过Western blot等技术对沉淀的蛋白质进行分析。
通过这种方法可以检测到目标蛋白与其他蛋白质的直接相互作用或者间接相互作用。
3.荧光能量转移技术：一种高灵敏度的检测蛋白质相互作用的方法。
该技术
利用荧光物质标记目标蛋白，通过检测荧光物质之间的能量转移，来间接检测蛋白质之间的相互作用。
4.噬菌体展示技术：将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因的技术，使外源基
因编码的蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合，并在噬菌体表面展示出来。
通过该技术可以筛选与目标蛋白相互作用的蛋白质，并对相互作用进行定量分析。
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。
把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。
(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较)一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。
其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。
将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。
在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。
Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。
可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。
此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。
二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。
此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。
目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。
三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。
它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。
检测两种卵白质之间相互作用的实验办法比较欧阳歌谷（2021.02.01）1. 生化办法●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究卵白质相互作用的经典办法。
改法的优点是卵白处于天然状态，卵白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以别离获得天然状态下相互作用的卵白复合体。
缺点：免疫共沉淀同样不克不及包管沉淀的卵白复合物时候为直接相互作用的两种卵白。
另外灵敏度不如亲和色谱高。
●FarWestern又叫做亲和印记。
将PAGE胶上别离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种卵白能与标识表记标帜了同位素的诱饵蛋鹤产生作用，最后显影。
缺点是转膜前需要将卵白复性。
2. 等离子概略共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵卵白结合于葡聚糖概略，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜概略。
当有卵白质混合物经过时，如果有卵白质同“诱饵”蛋鹤产生相互作用，那么两者的结合将使金属膜概略的折射率上升，从而招致共振角度的修改。
而共振角度的修改与该处的卵白质浓度成线性关系，由此可以检测卵白质之间的相互作用。
该技术不需要标识表记标帜物和染料，平安灵敏快速，还可定量阐发。
缺点：需要专门的等离子概略共振检测仪器。
3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互自力的结构域组成。
辨别使结合域和激活域同诱饵卵白和猎物卵白形成融合卵白，在真核细胞中表达，如果两种卵白可以产生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活陈述基因。
缺点：自身有转录功能的卵白会造成假阳性。
融合卵白会影响卵白的真实结构和功能。
晦气于核外卵白研究，会招致假隐性。
5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可产生能量转移的现象。
荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些安慰产生的构象变更，也能研究分子间的相互作用。
一、检测蛋白质与蛋白质相互作用
① FRET技术（in vivo）
FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。
该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：
以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。
然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。
如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。
②酵母双、三杂交技术（in vivo）
酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。
这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。
由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。
一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两个载体都转到特定的酵母细胞内，看未知蛋白与已知蛋白是否有相互作用。
如果两者有相互作用，那么就可以启动报告基因的转录，从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来；如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达，那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示：
由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间的相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。
该系统的原理如下图所示：
如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段，即C端段(Cub)和N端段(NubG)，并在C端段的N端接上一个LexA-VP16转录因子，此时它并不能激活基因转录（因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。
将该C端段连到一个膜蛋白上，将N端段连接到另一个膜蛋白上。
若两个膜蛋白有相互作用，那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。
此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。
酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。
第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下图所示：
如上图所示，在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当加入第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。
③ Pulldown技术（in vitro）
Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的基础上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。
亲和层析的原理如下图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，达到纯化目的蛋白的作用。
Pulldown技术利用的是亲和层析技术以及特异的配体（如GSH或者镍）。
以下图为例，将GST的基因与蛋白X的基因融合，表达出融合蛋白。
将该融合蛋白的溶液过带有GSH配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋白的溶液过柱，并让其与融合蛋白反应一段时间。
接着开始进行洗脱。
如果待测蛋白与蛋白X无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才能在收集到的样品中发现待测蛋白（以及蛋白X），说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用。
④ Far western blot（in vitro）
Far western blot是基于western blot发展而来，其原理如下图所示。
将样品蛋白用非变性的PAGE胶分离，然后转膜、封闭、洗膜，加入待测蛋白，使其与已在膜上的样品蛋白进行相互作用。
接着加入带有标记（如HRP）的待测蛋白的抗体反应，最后进行显色（如加入HRP的底物），观察实验结果。
⑤免疫共沉淀（Co-IP）（in vivo）
免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术。
它的原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内有相互作用的蛋白Y也能沉淀下来。
Co-IP的原理如下图所示，首先从细胞中提取蛋白质，获得蛋白提取液，并将其与抗体孵育，使抗体与蛋白X结合。
将预处理过的protein G琼脂糖珠（Sepharose）加入到抗体与蛋白提取液的孵育液中反应，使抗体与protein G结合。
通过离心将琼脂糖珠沉降到管底，去除上清液，然后再用缓冲液将琼脂糖珠冲洗数次，最后用western blot（或SDS-PAGE）进行检测。
二、检测蛋白质与DNA相互作用
①DNA foot printing（in vitro）
DNA foot printing的原理如下图所示。
将DNA的一个3’端用32p标记，然后将DNA分成两份，一份直接用DNase Ⅰ进行
不完全酶切；另一份先与待测蛋白混合反应一段时间，然后再用DNase Ⅰ进行不完全酶切。
然后将两份样品用变性的PAGE胶进行电泳，观察电泳结果。
下图中，由于待测蛋白与DNA结合的部位无法被DNase Ⅰ酶切降解，因此它的电泳结果中与直接用DNase Ⅰ进行处理的样品相比，会缺少一段；如果待测蛋白与DNA无相互作用，那么这两组的电泳结果应当一致。
②EMSA（in vitro）
EMSA，Electrophoretic Mobility Shift Assay，又称凝胶阻滞实验。
其原理是与蛋白质结合的DNA在Native-PAGE胶（非变性胶）上比没有结合蛋白的DNA移动速率要慢，因此通过电泳即可看到DNA的变化，如下图所示。
③Screen a Phage cDNA-library by DNA probe（in vitro）
该方法又成为原位筛选法，用于检测cDNA文库中的蛋白与DNA探针之间的相互作用。
其原理和实验流程如下图所示，首先是用噬菌体（phage）侵染大肠杆菌，然后将这些大肠杆菌涂到平板上。
接着进行转膜，将膜泡于IPTG水溶液中数小时，然后将该膜放于平板上，培养数小时（IPTG能诱导大肠杆菌表达文库蛋白）。
将膜取出，进行变性、复性和封闭（过夜），然后与放射性标记的DNA探针进行反应，最后洗膜、晾干并用胶片曝光。
如果胶片上出现了条带，说明该文库蛋白与DNA探针有相互作用；反之则说明两者无相互作用。
④酵母单杂交系统（in vivo）
酵母单杂交系统的原理与双杂交一样，不同的是它主要用于考察cDNA文库中的蛋白与DNA（即特异的已知靶因子）是否有相互作用。
其原理如下图所示。
首先需要构建一段序列（黑框），它含有至少3个拷贝的特异的已知靶因子以及报告基因的序列。
将该序列整合到酵母的基因组中，得到重组酵母。
接着构建一个融合表达载体，它含有待考察蛋白的基因序列与转录激活结构域的序列。
将该融合表达载体转入酵母中，观察报告基因是否能正常表达。
如果报告基因正常表达，说明该cDNA文库蛋白与已知的靶因子间可能有相互作用；反之，则说明两者无相互作用。
