蛋白质组学的的研究进展

蛋白质组学的研究进展

摘要：人类基因组计划的完成,标志着基因组时代的来临,在后基因组时代,研究的中心将从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对功能的研究。蛋白质作为基因功能的主要体现者, 对其表达模式和功能的研究成为热点, 出现了蛋白质组学。本文介绍了蛋白质组学产生的背景、蛋白质组学的的概念、研究内容以及蛋白质组学的相关技术。此外, 本文还对蛋白质组学研究的前景作出了展望。

关键词：蛋白质组学; 相关技术; 应用; 展望；双向凝胶电泳;质谱

人类基因组草图2001年的正式发表和2003年4月的最终完成。基于基因组学本身的局限性, 它不能回答诸如：蛋白质的表达水平和表达时间,翻译后修饰,蛋白质和蛋白质分子或其他生物分子的相互作用等问题。科学家们又进一步提出了后基因组计划, 蛋白质组研究便是其中一个很重要的内容。蛋白质组概念的提出, 使研究人员用蛋白质组学这个全新的领域来考虑生命活动的规律。蛋白质组学( Proteomics) 是作为功能基因组学的重要支柱, 并已同基因组学(Genomics)和生物信息学( Bioinformatics) 一起成为新世纪生命科学研究的前沿和热门领域, Nature, Science 杂志在公布基因组序列草图的同时, 分别发表了述评和展望, 将蛋白质组学的地位提到前所未有的高度, 认为它是功能基因组学前沿研究的战略制高点和新世纪最大的战略资源——“有用基因” 争夺战的重要战场。（1,2）

1 蛋白质组学的概念、研究内容及意义

蛋白质组( proteome) 源于protein和genome两词的杂合, 最早是由澳大利亚的W ILK INS等于1995年提出, 其定义为 一种基因组所表达的全部蛋白质。因蛋白质组具有时空性和可调节性, 蛋白质组的概念实际指在特定时刻、特定环境和实验条件下基因组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学的核心在于大规模地对蛋白质进行综合分析, 通过对某种物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质(包括表达水平、结构、分布、功能、丰度变化、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质与蛋白质的相互作用、蛋白质与疾病的关联性) 的研究, 对蛋白功能做出精细和准确的阐述。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理或病理状态中, 发生的相应的变化。 蛋白质组学的研究内容主要有两方面: 结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究, 包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。常规的方法是提取蛋白质，经2-DE ( two dimensional electrophoresis) 分离形成一个蛋白质组的二维图谱， 通过计算机图像分析得到各蛋白质的等电点、分子量、表达量等, 再结合以质谱分析为主要手段的蛋白质鉴定, 建立起细胞或组织或机体在所谓

“正常生理条件”下的蛋白质图谱和数据库。然而, 在此基础上, 可以比较分析在变化了的条件下, 蛋白质组所发生的变化, 如蛋白质表达量的变化、翻译后的加工修饰、蛋白质在亚细胞水平上的改变等, 从而发现和鉴定出特定功能的蛋白及其基因。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究, 包括蛋白质的功能和蛋白质间的相互作用。蛋白质的功能模式的研究是蛋白质组学研究的最终目标,

目前主要集中于研究蛋白质相互作用和蛋白质结构与功能的关系,以及基因的结构与蛋白质的结构功能的关系。对蛋白质组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要部分, 它要求对蛋白质进行表征即对所有蛋白质进行分离、鉴定及图谱化。蛋白质间的相互作用主要包括以下几类: 分子和亚基的聚合; 分子杂交; 分子识别; 分子自组装; 多酶复合体, 而分析一个蛋白质和已知功能的蛋白质相互作用是研究其功能的重要方法。

2 蛋白质组学相关技术

蛋白质组学研究的首要任务是建立获取和分析蛋白质的常规、可靠、有效的技术。为达到这一要求, 就需要样品准备、数据获取标准化及自动化, 也就是要有可重复的高通量的技术。蛋白质组研究的技术手段在不断完善, 其工作流程是多步骤进行, 包括蛋白质样本的制备、分离、定量及鉴定。现阶段蛋白质组的研究可分为3个主要步骤: 应用双向凝胶电泳、“ 双向”高效柱层析分离蛋白质; 应用氨基酸组成分析、C2 或N2末端氨基酸序列分析及质谱分析鉴定所分离的蛋白质; 应用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。所以目前蛋白质组研究技术可以分为以下几个方面: ⑴蛋白质分离技术: 如双向凝胶电泳( 2- DE) 等。⑵蛋白质鉴定技术: 如质谱技术等。⑶蛋白质相互作用及作用方式研究: 如双杂交系统等。⑷大数据量分析: 如生物工程信息学等。 2.1 蛋白质分离技术

2.1.1 样品制备技术

蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步,无论后续采用怎样的分离或鉴定手段, 样品制备都是关键步骤。蛋白质样品制备的一般过程是:对细胞、组织等样品进行破碎、溶解、失活和还原, 断开蛋白质之间的连接键, 提取全部蛋白质,除去非蛋白质部分（3） 。样品制备时必须注意: 简化样品处理过程, 避免蛋白丢失; 减少蛋白降解;避免样品的反复冻融; 防止各种可能的非目标性蛋白修饰;

保证清除所有杂质; 新鲜制备样品裂解液。对较为特殊的样品, 必要时采用特殊助溶剂或分步提取等制备方法（4） 。在进行植物蛋白质组的研究中, 已有多种蛋白质提取方法应用于不同植物的蛋白质制样中, 例如: 硫酸铵沉淀法、三氯乙酸( TCA ) 沉淀法、丙酮沉淀法、TCA -丙酮沉淀法以及用饱和酚提取, 在甲醇中以醋酸铵沉淀的方法等, 这些制样方法各有利弊, 其中,又以TCA - 丙酮沉淀法应用较多。但是, 由于植物材料, 特别是适应恶劣自然环境的植物叶片中常含有大量色素、酚类、有机酸、脂类及其他次生代谢产物, 这些物质常常会干扰叶片蛋白质的提取分离及后续分析。所以, 应该根据自己的材料与实验要求在前人提取方法的基础上, 通过对比试验, 建立起适合自己的蛋白质提取方法(5,6) 。此外,

无论进行蛋白质组研究还是亚蛋白质组分析, 制备样品的过程必须是可重复的,

且适合于随后的蛋白质分离和鉴定。

2.1.2 双向凝胶电泳

双向聚丙烯酰胺凝胶电泳( two dimensional polyacrylamide gel

electrophoresis, 2 - DPAGE) 对蛋白进行分离的原理是: 第一向进行等电聚焦,

蛋白质沿pH梯度进行分离, 至各自的等电点; 再根据分子量的不同, 在第一向基础上, 通过聚丙烯酰胺垂直的方向电泳进行分离。但目前该系统还面临着一些方法学上的问题: 疏水性蛋白( 如膜蛋白) 难溶于样品缓冲液; 高分子量蛋白、极酸和极碱性蛋白易在电泳中丢失; 低拷贝( 拷贝数小于1000) 蛋白无法检测等。2- DPAGE 是蛋白质组学研究的关键技术, 而2DDIGE( two dimensional

fluorescence difference gel electrophoresis) 则在其基础上做了重大的改进。2- DDIGE 在分离蛋白前, 先用荧光素将蛋白样本作上标记, 分离后再用质谱进行分析, 这种方法可以对实验组和对照组的蛋白质的表达, 进行精确且可重复的定量分析。2- DE 获得的数据可以用专门的系统管理。如: PARIS

( proteomic analysis and resources indexation system) 系统, 它储存了电泳图象和信息,供研究者搜索及应用。

2.1.3 高效液相层析(HPLC)

虽然HPLC 在蛋白组分析中未能广泛应用, 但其作为分离蛋白质的第一步,

仍具有很好的前景。双向高效液相层析( 2D- HPLC) 也是一种很好的蛋白质分离纯化方法。其第一相根据分子大小分离蛋白质, 第二相是反向层析。2D- HPLC 分离蛋白质的容量比2-DE大,且速度快。而毛细管柱反相高效液相色谱(RPHPLC)也比2-DE快速、分辨率高。现又出现将不同液相层析联合使用技术, 称之为连续液相层析(tandem liquid chromatograpy),其大大提高了液相层析的效率。

2.2 蛋白质鉴定技术

2.2.1 传统蛋白质鉴定技术

⑴氨基酸组成分析 氨基酸组成分析可提供蛋白质一级结构信息。原理是用酸水解蛋白质, 测定蛋白质中各氨基酸所占摩尔百分数(%) 或各氨基酸的摩尔比率,

与数据库中已知蛋白质的理论值进行比较。氨基酸组成分析经济、快速, 但灵敏度低。

⑵C-或N-端氨基酸序列分析N-端氨基酸序列分析常用Edman 降解法测定蛋白质N

端氨基酸序列,C-端氨基酸序列分析常用羧肽酶法、化学降解法测定蛋白质C-端氨基酸序列。目前均可用自动测序仪。N-端4个氨基酸残基序列即可鉴定43%～83%蛋白质、C-端5个氨基酸残基序列即可鉴定74 %～97 %蛋白质, 若两者结合使用,

判断结果的准确性会更高。

2.2.2 质谱技术

质谱(Mass Spectrometry) 的基本原理是样品分子离子化后, 根据不同离子间的质荷比(mPz) 的差异来分离并确定分子量。在离子化方法上, 多采用电喷雾离子化(electrospray ionization,ESI) 和基质辅助的激光解吸离子化(Matrix assisted laser desorption ionization, MALDI) 的“软电离”方法。即样品分子电离时, 保留整个分子的完整性, 不会形成碎片离子。

⑴肽质图谱(Peptide mass mapping) 用特定蛋白酶( 最常用胰酶) 将分离蛋白在胶上或膜上于精氨酸或赖氨酸的C末端处断裂, 通过MALD-2MS或ESI-MS来得到精确的肽分子量。

⑵肽片段的部分测序为进一步鉴定蛋白质, 可将液相中的肽段经电喷雾电离后,

进入串联质谱(Tandem MS),肽链中的肽键断裂,形成N-端碎片离子系列(B系列)

和C-端碎片离子系列(Y系列) 。综合分析这些碎片离子系列, 可得出肽段的氨基酸序列。这样, 联合肽片段的分子量和肽段序列信息将足以鉴定一个蛋白质。当然, 尽管肽质指纹谱(Peptide Mass Fingerprint) 已成为蛋白质鉴定的支柱技术,N-末端Edman 降解、氨基酸组分分析仍然是目前鉴定蛋白质的常用手段。

2.2.3 同位素标记亲和标签技术(ICAT)

此为采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术, 其灵敏度和准确性高,

能分析低表达的蛋白质。目前是蛋白质组研究技术中的核心技术之一,主要用于研究蛋白质组差异。它的优点在于可以对混合样品直接测试; 能够快速定性和定量鉴定低丰度蛋白质,尤其是膜蛋白等疏水性蛋白等;还可以快速找出重要功能蛋白质(疾病相关蛋白质及生物标志分子),其具有巨大应用价值。但ICAT技术由于其标签试剂本身是种相当大的修饰物,并在整个MS分析过程中保留在每个肽段上, 这使得数据库搜索的算法复杂化,并且对不含Gys的蛋白质无法分析(7)。