结核分枝杆菌耐药分析与基因检测分析

中国病原生物学杂志　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２Ｏｌ５年５月　第１Ｏ卷第５期　Ｍａｙ　２０１５，Ｖｏ１．１０，Ｎｏ．５　

ＤＯＩ：１０．１３３５０５．ｃｊｐｂ．１５０５１６　临床研究　

结核分枝杆菌的病原学检测及耐药性分析＊　

陈少文　，林种¨　，林明冠　，廉芳　，苏应仙　，何晶。　（１．海南省农垦总医院检验科，海南海口５７０３１１；２．海南省农垦总医院感染科）　

【摘要】　目的探讨结核分枝杆菌的病原学检测及耐药情况。　方法　回顾性分析２００９年１月一２０１３年１２月在本院　作痰涂片检查的２Ｏ　０５４例患者临床资料，对２Ｏ１２—２０１３年确诊的１６０例结核患者作痰涂片抗酸染色检查、结核菌素　（ＰＰＤ）试验和结核抗体试验，并对阳性标本做异烟肼（ＩＮＨ）、利福平（ＲＦＰ）、链霉素（ｓＭ）、乙胺丁醇（ＥＭＢ）药敏试验。　结果２００９—２０１３年作痰涂片检查标本结核分枝杆菌的阳性率分别为１１．３　、１０．１　、８．９　、８．３　、７．７　，呈逐步下　降的趋势（Ｙ　：３７．３９６，Ｐ＜Ｏ．０５），合计阳性率为９．２　（１８３９／２００５４）。其中阳性结果以（＋）为主（占５９．７　），男女比例　约为１．７：１（１　１６１／６７８），好发年龄为２５～５４岁（男女分别占６０．９　和６０．５　）。与ＰＰＤ试验（７９．４　、４７．８　）和结核　抗体试验（７６．９　、８３．３　）相比，痰涂片抗酸染色的灵敏度（２８．１　）较低（Ｐ＜Ｏ．０５），但特异度（１００　）较高（Ｐ＜０．０５）。　９９株分离菌中有８６株为多耐药菌株，其中耐ＨＲ　３０株（占３４．９　），耐ＨＲＳ　１８株（占２Ｏ．９　），耐ＨＲＥ　１０株（占　ｌ１．６　），耐ＨＲＳＥ　２８株（占３２．６　），其好发年龄为２５～５４岁，占５８．２　。　结论　痰涂片检查是特异性较强的肺结　核诊断方法，联合血清学方法用于诊断肺结核有重要的临床意义。本组资料中痰涂片结核分枝杆菌阳性率逐年下降，但　耐药率和多耐药率增高，应加强预防管理工作。　【关键词】结核分枝杆菌；痰涂片；药敏试验；回顾性分析　【中图分类号１　Ｒ３７８．１２　【文献标识码】Ａ　【文章编号】１６７３—５２３４（２０１５）０５—０４４６—０４　

结核分枝杆菌耐药分析与基因检测分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药情况及基因检测分析。 方法 从2012年3月～2014年3月我院收治的结核病患者中选取62例为研究对象，按随机数字法对患者进行分组，首次诊治患者39例为观察组，首次诊治失败后行第二次治疗患者23例为对照组，对所有患者结核分枝杆菌进行耐药分析及rpsL、rpoB、embB、KatG基因检测。 结果 62例患者中共19例出现耐药，耐药率为30.65%，对照组患者1种药物耐药率为26.09%，同观察组10.26%比较，差异有统计学意义（P＜0.05），2种药物耐药率为17.39%，同观察组7.69%比较，差异有统计学意义（P＜0.05），3种药物耐药率为8.70%，同观察组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；rpsL、rpoB、embB、KatG基因突变率分别为83.33%，86.11%，88.89%，91.67%，x2检验显示，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 结核分枝杆菌耐药的产生同菌株基因具有较大关联，且耐药率同治疗次数有关，在结核病临床治疗中，需根据患者耐药情况，选择联合用药方案，提高治疗效果。

[Abstract] Objective To investigate the analysis in drug resistance of

bacteriology tuberculosis and genetic testing. Methods 62 cases of TB patients from

March 2012 to March 2014 in our hospital were selected as the objects，and allocated

into an observation group and a control group according to the randomly grouping

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结核分枝杆菌rpoB基因突变检测

作者：尹冬梅

来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第03期

【摘; 要】目的：通过PCR和测序法检测rpoB基因利福平耐药区域（RRDR）是否存在突变并测定其突变位点。方法：收集临床分离结核杆菌DNA检测阳性标本，通过PCR技术扩增其rpoB基因，扩增产物测序，并将测序结果提交至NCBI数据库中对比。结果：30例结核DNA阳性标本中，有25例rpoB 基因PCR 扩增阳性者， 有18例测序成功，与PUBMED

BLAST中标准菌株rpoB基因对比，存在突变的菌株有10例，没有突变的菌株有8例，突变率为55.56%，突变核心区域突变率为90.0%。结论：rpoB 基因PCR 检测在可辅助诊断结核病的同时， 对其产物进行测序可直接判别对利福平耐药与否，能给临床提供快速用药指导。

【关键词】结核分枝杆菌;PCR;rpoB基因;利福平耐药

【中图分类号】R454;;;;; 【文献标识码】A;;;;; 【文章编号】1672-3783（2019）03-0047-02

《淮海医药》２００９年１月第２７卷第１期Ｊ　Ｈｕａｉｈａｉ　Ｍｅｄ，Ｊａｎｕａｒｙ　２００９，Ｖｏ１．２７，Ｎｏ．１　基因芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性　张瑞梅，刘成永，申　涛，刘　汀　【摘要】　目的研究基因芯片在检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性中的应用。方法根据与利福平和　异烟肼耐药相关的４条基因上的１１个位点和３０种单核苷酸多态性设计制作芯片，用芯片检测结核分枝杆菌的基因　突变，从而判断其耐药性。结果　用基因芯片在ｌ１Ｏ株异烟肼耐药株中检测出８５侏（７３．３％），在３Ｏ株异烟肼敏感株　中检测出２２株（７３．３％），在９４株利福平耐药株中检测出７７株（８１．９％），在４６株利福平敏感株中检测出４Ｏ株　（８７．Ｏ％）。芯片检测结果与部分样本的测序结果完全相符。结论用ＤＮＡ芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟　肼的耐药性具有较高的特异性和敏感性，该法快速、精确，可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检测。　【关键词】　寡核甘酸序列分析；分枝杆菌，结核；药物耐受性　【中图分类号】　Ｒ５２０．５；Ｐ０７８．３　【文献标识码】　Ａ　【文章编号】　１００８－７０４４｛２００９）Ｏ１－０００５－０２　Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｃｈｉｐ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｍｎ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｒｉｆａｍｐｉｎ　ａｎｄ　ｉｓｏｎｉａｚｉｄ　ＺＨＡＮＧ　Ｒｕｉ—ｍｅｉ　Ｉ　ＬＩＵ　Ｃｈｅｎｇ－ｙｏｎｇ，ＳＨＥＮ　Ｔａｏ，ｅｔ　ａ１．（Ｘｕｚｈｏｕ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉａｎｇｓｕ　２２１００４，Ｃｈｉｎａ）　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅ　ｃｈｉｐ　ｉｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｒｉｆａｍｐｉｎ　（ＲＦＰ）ａｎｄ　ｉｓｏｎｉａｚｉｄ（ＩＮＨ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐｒｏｂｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃｈｉｐ　ｗａｓ　ｆａｂｒｉｃａｔｅｄ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　３０　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕ—　ｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ａｎｄ　１　１　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　４　ｇｅｎｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＲＦＰ　ａｎｄ　ＩＮＨ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｔｈｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　ｍｙｅｏｂａｅｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｃｈｉｐ　ｔｏ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ＩＮＨ　ａｎｇ　Ｒｍ　Ｒｅｓｕｌｔｓ　８５　ｏｆ　１　１０（７３．３％）ｓｔｒａｉｎｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ＩＮＨ　ａｎｄ　２２　０ｆ３０（７３．３％）ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ＩＮＨ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ。ｗｈｉｌｅ　７７　ｏｆ　９４（８１．９％）ｓｔｒａｉｎｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　ＲＦＰ　ａｎｄ　４０　ｏｆ　４６（８７．０％）ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｔｏ　ＲＦＰ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ—ｃｈｉｐ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｓｏｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｅ　ｇｅｎｅ—ｃｈｉｐ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－ａ　ｆａｓｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ａｃｃｕｒａｃｙ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ。ａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｉｎ　ｏｕｒ　ｓｔｕｄｙ。ｉｓ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ＩＮＨ　ａｎｄ　ＲＦＰ　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｒｒａｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　目前，用于结核分枝杆菌耐药性的检测方法有很多种，但　大部分检测方法所需时间都较长Ｌｌ　Ｊ，以培养为基础的绝对浓　度法或比例法，需要２—３个月时间才能得到药敏结果，放射　性快速诊断技术（ＢＡＣＴＥＣ）法可将耐药检测缩短到２—４周，　但仍不能满足临床的需要。因此，创建快速、简便、准确的检　测方法就成为基础研究领域的一个重要课题，基因芯片是近　年发展起来的一种新方法。基因芯片检测结核分枝杆菌是利　用结核分枝杆菌耐药性与基因突变有关的分子机制，对其与　耐药性相关的突变热点进行检测，根据检测位点的突变情况　判断结核分枝杆菌的耐药性，将耐药性检测的时间缩短到３　—４　ｈ，达到快速、灵敏、准确检测耐药性的目的。本研究根据　利福平（ＲＦＰ）和异烟肼（ＩＮＨ）耐药与基因突变有关的分子机　制，制备检测突变位点的基因芯片，用基因芯片技术检测结核　分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药情况，并与绝对浓度法药　敏结果进行比较。　１材料与方法　１．１材料（１）检测菌株：结核分枝杆菌临床分离株１４０株，　其中４６株为ＲＦＰ敏感株，９４株为ＲＦＰ耐药株，３Ｏ株为ＩＮＨ　敏感株，１１０株为ＩＮＨ耐药株，７０株为ＲＦＰ和ＩＮＨ同时耐药　株，６株为ＲＦＰ和ＩＮＨ同时敏感株，以上菌株均为我院菌株库　标本，所有菌株皆通过绝对浓度法药敏检测。（２）芯片制作及　检测设备：芯片制作所需芯片、点样仪及激光共聚焦扫描仪等　【基金项目】江苏省徐州市科技计划资助项目（ｘｚ２００６２２８）　【作者单位１江苏省徐州市传染病医院结核科，２２１００４　【作者简介】张瑞梅（１９６５一），女，江苏徐州市人，副主任医师，大学。　设备均由中科院上海微系统与信息技术研究所提供。芯片上　所有探针及ＰＣＲ扩增引物均由上海博亚生物技术公司合成。　１．２方法（１）ＤＮＡ制备：采用本实验室自制的标本前处理　试剂盒提取所有菌株的染色体ＤＮＡ，置４￣Ｃ保存。（２）引物设　计：设计４对引物，分别扩增ｒｐｏＢ、ａｈｐＣ、ｉｎｈＡ及、ｋａｔＧ４个基　因的部分片断，每条片断均包含各自基因上的检测位点。（３）　芯片制备：针对ｒｐｏＢ基因５ｌ１、５１２、５１６、５１４、５２６、５３１位点，　ａｈｐＣ基因启动子区域的－６、－１Ｏ位，ｉｎｈＡ启动子ｏｒｆｌ阅读框前一　１５、－８位，以及ｋａｔＧ基因３１５位的野生型和不同突变型共同　设计探针　。］，芯片制作方法见参考文献　］。（４）检测过程：　参见参考文献　ｊ。（５）序列测定：随机抽取编号为１～５０的扩　增后和５株芯片检测结果无信号的ＤＮＡ样品，以及所有敏感　株中检测到突变基因的ＤＮＡ样品，送上海基康（ＧｅｎｅＣｏｒｅ）生　物技术有限公司进行测序。　２结果　２．１　ＩＮＨ耐药株的检测结果在１１０株ＩＮＨ耐药株中，２２株　芯片检测结果为敏感株，８５株芯片检测结果为突变株，总突　变率为７７．３％，基保７５株发生ｋａｔＧ突变；１７株发生ｉｎｈＡ突　变；３株发生ａｈｐＣ突变。其中９株同时发生ｋａｔＧ和ｉｎｈＡ突　变；１株同时发生ｋａｔＧ和ａｈｐＣ突变。另各有２株在芯片ｉｎｈＡ　位点（其中１株ｋａｔＧ位已检测到突变）和ａｈｐＣ位点元信号，　经测序发现芯片上无信号处的２条ｉｎｈＡ基因和２条ａｈｐＣ基　因分别发生了芯片上没有包含的突变。　２．２　ＩＮＨ敏感株的检测结果在３０株ＩＮＨ敏感株中，芯片　检测出８株突变，突变率为２６．７％，其中ｋａｔＧ突变１株、ｉｎｈＡ　突变７株。