食物中的亚硝酸盐含量测定实验

实验二食品中亚硝酸盐含量的测定

一、实验目的

1. 了解亚硝酸盐的危害，掌握测定食品中亚硝酸盐含量的方法。

2. 掌握色谱法和分光光度法的原理和操作方法，学会利用这两种方法测定食品中亚硝酸盐的含量。

二、实验原理

1. 亚硝酸盐的危害

亚硝酸盐是一种常见的致癌物质，它在在一定条件下可以转化为亚硝胺，而亚硝胺是一种强致癌物。人体摄入过量的亚硝酸盐会导致亚硝胺的形成，从而增加患癌症的风险。

2. 色谱法测定亚硝酸盐含量

色谱法测定亚硝酸盐含量的原理是利用反相色谱分离亚硝酸盐，并通过紫外检测器检测样品中亚硝酸盐的含量。具体步骤如下：

（1）样品制备：将待测样品加入水中，同时加入明矾和硫酸铜，使亚硝酸盐被还原为亚硝酸钠。

（2）色谱柱处理：用反相色谱柱，在样品进样口处注入样品，经过一定的进样残留时间后，以一定的流速进行柱洗脱。柱洗脱时，先用无机盐水拉平基线，再用有机溶剂进行洗脱。

（3）检测：用紫外检测器检测亚硝酸盐的吸光度，从而得到亚硝酸盐的含量。

分光光度法测定亚硝酸盐含量的原理是利用亚硝酸盐和硫酸铁（Ⅱ）发生化学反应，在一定的酸性条件下生成的重氮化合物与磺基苯二胺反应，生成紫色产物，其最大吸收波长为540 nm。具体步骤如下：

（2）反应：加入磺基苯二胺后，放置反应10-30min，其间温度保持在5℃-25℃之间。

（3）检测：利用分光光度计测定紫色产物在540nm处的吸光度，计算出亚硝酸盐的含量。

三、实验步骤

1. 应注意的问题

（1）亚硝酸钠充分还原后，一定要在酸性环境下进行测定。 （2）在反应中要控制好温度，以保证反应的准确性。

（3）样品应尽量少受光照，以防止光照影响样品的含量。

2. 实验器材和试剂

（1）色谱仪、分光光度计

1 实验十 食品中亚硝酸盐含量的检测

1.实验目的

掌握盐酸萘乙二胺法检测肉制品中食品添加剂——亚硝酸盐的基本操作技术。

2.实验原理

在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸奈乙二胺偶合生成紫红色化合物，颜色的深浅与亚硝酸盐含量成正比，其最大吸收波长为538nm，可测定吸光度并与标准比较定量。

2HCl+NaNO2+H2N--SO3H重氮化H3SO--Cl----+NaCl2H+2O

2HCl.H2NH2CH2CHN-+--N-ClN--SO3H偶合-CHN2CH2NH2H.2HCl-N-H3SO--N+HCl盐酸萘乙二胺紫红色

3.仪器、试剂及材料

3.1仪器

50mL小烧杯，752型分光光度计，250mL容量瓶，1mL移液管，25mL具塞试管，洗耳球

3.2试剂

（1）饱和硼砂溶液：溶解5g硼酸钠于100mL热水中，冷却后备用。

（2）硫酸锌溶液：溶解30g硫酸锌于100mL水中。

（3）对氨基苯磺酸溶液（0.4%）：溶解0.4g对氨基苯磺酸于100mL20%盐酸中，避光保存。

（4）盐酸奈乙二胺溶液（0.2%）：溶解0.2g盐酸奈乙二胺于100mL水中，避光保存。

（5）亚硝酸钠标准溶液：精确称取0.1000g亚硝酸钠（硅胶干燥中干燥24小时），加水溶解，移入500mL容量瓶，并稀释至刻度，混匀，临用前吸取5.00mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，此溶液每毫升相当5μg亚硝酸钠。

（6）亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾于100mL容量瓶中定容。

3.3材料

火腿肠

4.实验步骤

4.1亚硝酸钠的提取

肉制品绞碎混匀 取1g~1.5g左右于50mL小烧杯中

加入6.3mL硼砂溶液搅拌 用150mL70℃左右热水将样品洗入250mL容量瓶中

沸水浴15min 冷却至室温

边转动边加入5mL亚铁氰化钾和4mL硫酸锌溶液 加水定容至250mL

2

4.2 测定

午餐肉中亚硝酸盐的测定

午餐肉是一种常见的加工肉制品，亚硝酸盐是一种常用的食品添加剂，被用于午餐肉的保鲜和着色。然而，过量的亚硝酸盐摄入可能对人体健康造成危害，因此需要进行亚硝酸盐的测定。

亚硝酸盐的测定方法有多种，常用的方法包括高效液相色谱法（HPLC）、催化分析法、光谱法等。下面将介绍其中的两种常用方法。

一、高效液相色谱法（HPLC）

HPLC是一种高效、精确的物质定量分析方法，常被用于食品中亚硝酸盐的测定。具体步骤如下：

1. 样品制备：将午餐肉样品取一小块，加入适量的蒸馏水中搅拌均匀，取适量的稀释液，经过滤后得到样品。

2. 色谱柱选择：根据分析目标，选择合适的色谱柱。常用的是反相色谱柱，比如C18柱。

3. 优化测定条件：通过调整流速、流动相组成等条件，找到合适的分析条件。一般流动相选用水和有机溶剂的混合物，比如乙腈和水。

4. 样品进样：将制备好的样品注入色谱仪，确定进样量。

5. 柱温控制：根据色谱柱的要求，控制柱温。

6. 检测波长选择：选择合适的检测波长。亚硝酸盐一般在220nm左右有较强的吸收。

7. 分析测定：运行色谱仪，记录并分析峰面积。

8. 定量计算：根据标准曲线，计算样品中亚硝酸盐的含量。

二、催化分析法

催化分析法是基于亚硝酸盐与某些物质发生反应，生成显色产物，通过测定显色产物的吸光度来确定亚硝酸盐含量的一种方法。常用的试剂是磷钼酸盐和硫酸。具体步骤如下：

1. 标准曲线制备：根据亚硝酸钠的溶液，制备一系列不同浓度的标准溶液。

2. 样品制备：将午餐肉样品取一小块，加入适量的蒸馏水中搅拌均匀，取适量的稀释液。

3. 反应试剂制备：将磷钼酸盐和硫酸按一定比例混合，制备催化试剂。

4. 反应体系调整：将制备好的样品与催化试剂混合，调整pH值和反应温度。

5. 显色反应：在适当的条件下，亚硝酸盐与催化试剂发生反应，产生显色物。

6. 吸光度测定：通过分光光度计测定显色物的吸光度。

Sep. 2016 CHINA FOOD SAFETY 115分析与检测

基于酸性条件下亚硝酸盐与邻苯二胺反应生成的显色物质苯并三氮唑，本研究建立了一种紫外分光光度法测定食品里的亚硝酸盐含量的方法，亚硝酸根含量标准曲线为ｙ＝０．２３７　３ｘ－０．００１　７，Ｒ²＝０．９９９　９，其拟合度较高，线性范围为０～６　μｇ／ｍＬ，且精密度、回收率均较好，ＲＳＤ均小于５％。以此方法对市售散装卤猪肉、豆干、甜面酱和咸菜的亚硝酸盐含量进行检测，结果指出４种食物的亚硝酸根含量分别为（３２．１±１．３）、（２７８．５±１１．２）、（８７４．２±３４．６）、（８２．１±４．０）μｇ／ｍＬ，亚硝酸钠含量均超标，其中豆干、甜面酱严重超标。亚硝酸盐广泛存在于环境中，某些天然的农副产品本身含有亚硝酸盐，并可用做肉类加工中的着色剂和防腐剂，造成亚硝酸盐在食物中普遍存在。亚硝酸盐可使人体的血红蛋白失去输送氧气的能力，且其能与蛋白分解产生的仲胺类生成具有强致癌性的物质，对食品中的亚硝酸盐含量进行测定具有重要的意义。目前，国家标准规定食物中的亚硝酸盐测定方法为盐酸萘乙二胺法，其操作繁琐，使用较不方便。本研究基于检测酸性条件下亚硝酸盐与邻苯二胺反应生成的显色物质苯并三氮唑，从而建立一种简易、快捷的食品中亚硝酸盐含量检测的紫外分光光度法。材料与方法实验材料市售散装卤猪肉、豆干、甜面酱和咸菜。仪器与试剂ＵＶ－１２００紫外／可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），ＪＪ１００Ｂ电子分析天平（美国双杰公司），ＨＨ－２恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）。５０　ｍｇ／Ｌ亚硝酸根（亚硫酸钠）标准储备液、４　ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液、１％（ｗ／ｖ）邻苯二胺溶液、１．０６　ｇ／Ｌ亚铁氰化钾溶液、２．２０　ｇ／Ｌ乙酸锌溶液、饱和四硼酸钠溶液，均以国产分析纯配制。标准曲线制备分别准确吸取亚硝酸根标准储备液１、２、３、４、５　ｍＬ和６　ｍＬ于５０　ｍＬ容量瓶内，分别加入１ｍＬ邻苯二胺溶液和１　ｍＬ盐酸溶液，定容，于２６０　ｎｍ下测定吸光度。以吸光度对应亚硝酸根含量做线性回归标准曲线。样品制备将上述４种食物在研磨内捣碎，各准确称取１０．０　ｇ样品，放入２５０　ｍＬ的烧杯内，加约１００　ｍＬ的水搅拌和浸泡，再依次加入饱和四硼酸钠溶液１０　ｍＬ、乙酸锌溶液４　ｍＬ、亚铁氰化钾溶液２　ｍＬ，摇匀，静置过夜。待蛋白质沉淀后以滤纸过滤，上清液定容至２５０　ｍＬ待测。结果与讨论亚硝酸根含量标准曲线按１．３制备亚硝酸根含量标准品，以吸光度对应亚硝酸根含量做线性回归标准曲线，标准曲线为ｙ＝０．２３７　３ｘ－０．００１　７，Ｒ²＝０．９９９　９，其拟合度较高，线性范围为０～６　μｇ／ｍＬ。精密度实验准确吸取亚硝酸根标准储备液３　ｍＬ于５０　ｍＬ容量瓶内，分别加入１　ｍＬ邻苯二胺溶液和１　ｍＬ盐酸溶液，定容，于２６０　ｎｍ下测定吸光度，进行５次重复，结果指出精密度ＲＳＤ为２．７７％，本方法精密度良好。回收率实验准确吸取亚硝酸根标准储备液３　ｍＬ于５０　ｍＬ容量瓶内，分别再加入１、２、３　ｍＬ亚硝酸根标准储备液，加入１　ｍＬ邻苯二胺溶液和１　ｍＬ盐酸溶液，定容，于２６０　ｎｍ下测定吸光度，各进行３次重复，实验结果见表１。亚硝酸根标准品溶液回收率在９９．００％～１０２．８３％，平均ＲＳＤ仅为１．２０％，本方法的回收率较好。样品检测结果将市售的散装卤猪肉、豆干、甜面酱和咸菜按１．４制备的待测液进行紫外分光光度法测定食品里的亚硝酸盐含量□ 张小梅 济阳县综合检验检测中心