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毛囊干细胞的分离培养及鉴定

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毛囊干细胞的分离培养及鉴定

肖锋

【摘 要】毛囊干细胞是皮肤组织工程理想的种子细胞,已成为近年来的研究热点之一.分离培养及鉴定是其研究的基础手段,作者将近年来毛囊干细胞几种常用的分离培养及鉴定方法进行较为系统的分析、总结和归纳,为毛囊干细胞的深入研究提供坚实的基础.

【期刊名称】《中国美容医学》

【年(卷),期】2015(024)019

【总页数】4页(P77-80)

【关键词】毛囊干细胞;鉴定;分离培养

【作 者】肖锋

【作者单位】湖南师范大学第一附属医院整形激光美容外科 湖南 长沙410000

【正文语种】中 文

【中图分类】R329.2

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，存在于胚胎及成体内。在一定条件下，干细胞可以无限增殖而保持未分化状态，也可以分化成多种功能细胞。20世纪，Cotsarel is、Taylor等［1］通过相关研究发现，在毛囊上部由外根鞘形成的明显突起，即隆突区域也有干细胞的存在，这些干细胞被定义为毛囊干细胞。毛囊干细胞与其他成体干细胞一样拥有强大的增殖能力及多向分化潜能［2］。毛囊干细胞能通过自身的分裂增殖产生各种机体所需的细胞，以补充脱落和缺失的细胞；毛囊干细胞不仅能够向下转移到毛囊根部生成毛囊，而且还能从毛囊外根鞘向上迁移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪［3-4］。近年来，毛囊干细胞的研究备受关注，已成为研究热点之一。目前，存在多种毛囊干细胞的分离培养及鉴定方法，为毛囊干细胞的深入研究提供了坚实的基础，作者就毛囊干细胞常用的分离培养及鉴定作一简要综述。

此前，已有许多研究者采用不同的方法来分离毛囊干细胞，并成功地进行传代培养，进行后续更深入的研究。目前对毛囊干细胞分离纯化常用的有以下几种方法：

1.1 组织块培养法

取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用PBS液冲洗，将皮肤切成小块，表皮朝上贴于加入适量培养基的培养器皿中，置于5%CO2培养箱中，37℃，饱和湿度条件下培养。组织块培养法分离的干细胞能持续保持增殖趋势，没有明显的平台期，并且随着不断传代纯化，此方法获得的毛囊干细胞纯度明显增加。但是组织块培养法分离获取毛囊干细胞的效率较低。史明艳等［5］使用该方法成功获得毛囊干细胞，并分析指出该方法的优势在于组织块培养时从组织块中迁移出来其他细胞为毛囊干细胞创造了一个类似于体内的微环境，使毛囊干细胞能最大程度地保留增殖分化能力。

1.2 显微分离技术

取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高浓度青、链霉素的PBS液反复冲洗3次；在超净工作台内，显微镜下显微镊钝性分离单个毛囊组织，收集形态完好且处于生长期的毛囊。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入含培养基培养皿，于37℃、5%CO2孵箱中培养。显微分离技术能从样本直接选取毛囊干细胞相对富集区域，有利于后续进一步的纯化［6］。王祝迁等［7］使用此方法成功分离出大鼠毛囊干细胞，但单纯应用显微分离技术获取高纯度的毛囊干细胞需花费大量的时间和精力，效率偏低。 1.3 酶消化法

取含有待培养毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用含双抗PBS液冲洗，将皮肤样本剪成小块，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃摇床消化2h。取出组织用PBS冲洗3遍，置于胰蛋白酶（质量浓度为2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃摇床消化1h后，过200目钢网。收集滤液离心（1

500r/min）10min，弃去上清，加入细胞培养液培养。此方法获得的毛囊干细胞克隆形成能力强，获取效率高。郑宣等［8］用此法获得较纯的毛囊干细胞，但获得的毛囊干细胞经历增殖期后生长速度逐渐减慢，且细胞存活率下降，可能与酶消化法破坏了毛囊干细胞生长微环境有关。

1.4 差数贴壁法

将收集的细胞接种于Ⅳ型胶原包被的培养皿中，静置20min后，收集上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一培养皿中，贴附皿底的毛囊干细胞，置于体积分数为5%CO2、37℃孵箱中培养，每3d换液一次。与单纯使用某种毛囊干细胞分离方法相比较，联合差数贴壁法将更进一步纯化，获得纯度更高的毛囊干细胞。彭彧等［9］使用酶消化法联合差数贴壁法获得了形态典型且均匀一致的毛囊干细胞。目前此方法已被广泛使用。

1.5 免疫磁珠法

免疫磁珠法主要用来纯化分离培养获得的毛囊隆突区细胞中某种标记物阳性的细胞。首先制作细胞悬液，并加入FITC标记的某种标记物单抗，室温孵育30min，离心后弃上清中未结合的抗体，加入磁珠分选缓冲液重悬细胞，再次离心后弃上清，PBS缓冲液清洗2次，取重悬后细胞与免疫磁珠混合，室温反应30min。磁珠分离器分离8min，去除未与磁珠结合的细胞。将结合了靶细胞的免疫磁珠用磁珠分选缓冲液洗5次。体积分数为5%CO2、37℃孵箱培养48h，使细胞与磁珠分离，即可获得较纯的毛囊干细胞。谭挺等［10］用此法获得高纯度毛囊干细胞，他们指出此方法与显微分离技术连用有单次操作分离细胞数量大且纯度较高、能与细胞培养、流式细胞术、荧光显微镜等分子生物学技术兼容等特点。黄恩毅等［11］用此法有效分离并成功培养CD34+毛囊干细胞，发现分选后的细胞仍具有较好的活性，且增殖速度快，增殖期长。卢葳等［6］通过实验证实，免疫磁珠分选后毛囊干细胞活力较好，分离获得的毛囊干细胞适合用于细胞培养、诱导等后续试验。

1.6 流式细胞仪分选法

通过毛囊干细胞表达的某些特异性标记物，利用流式细胞仪可以将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来，获得较高纯度的特异性细胞。常用的是荧光激活细胞分选器。卢葳等［6］使用流式细胞仪分选CD34+毛囊干细胞，获得的毛囊干细胞纯度很高、污染机会小，但是分选过程费时，细胞分选后活力稍差。此方法适合于需要做免疫组化，蛋白质组织学等对细胞纯度要求高的实验。

干细胞的鉴定一直是干细胞研究的难点，常用干细胞的标记物辅助方法进行鉴定。毛囊干细胞有多种明确的分子标记物，如CD34、K15、K19［12］。

2.1 角蛋白家族

角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。在表皮细胞中，它们以微丝的状态在细胞内形成广泛的网状结构。在上皮组织中有20多种不同种类的角蛋白表达。在表皮细胞中，随着分化程度的不同其所表达的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作为毛囊干细胞的鉴定手段。1998年，lyle等［13］通过表达克隆发现K15是毛囊干细胞表面标记之一，此后K15一直被当做较为公认的毛囊干细胞标记物。20世纪末，有研究者通过实验发现滞留细胞所在的毛囊隆突部细强表达K19［14］；同时有实验发现毛囊隆突部K19高表达细胞缺乏特异性分化标志，进一步证实K19高表达细胞为毛囊干细胞，因此，认为K19也可作为毛囊干细胞表面标记物［15］。在毛囊干细胞分化过程中，K15表达减弱较K19早，K19表达阳性而K15阴性的细胞仍有可能为处于早期阶段的增殖细胞，因此推测，检测毛囊干细胞时K15更准确［13］。

2.2 钙黏蛋白家族

钙黏蛋白是一种同亲型结合、Ca2+依赖的细胞黏着糖蛋白，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有重要作用。不同细胞及发育不同阶段其细胞表面的钙黏蛋白的种类与数量均有所不同，目前已经发现几十种钙黏蛋白。CD34抗原是钙黏蛋白中的一种，是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，为阶段特异性白细胞分化抗原，CD34表达于人类造血干细胞，CD34是目前公认的造血干细胞标志物。Ohyama等［16］通过对鼠毛囊的研究，发现鼠毛囊中CD34阳性细胞与毛囊隆突部滞留细胞和K15阳性细胞在毛囊处位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干细胞标记物。Trempus等［17］通过动物实验首次证实了CD34表达于小鼠毛囊干细胞。但CD34在人毛囊干细胞不表达，Shu Jiang等［18］通过对人头皮进行原位免疫组化和多色免疫荧光标记，发现CD34特异性表达于毛囊间表皮基底部。

2.3 整合素家族

整合素是机体重要的黏附分子，是广泛存在于动植物细胞表面的一类细胞跨膜蛋白，在细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间起黏附作用，整合素是由α和β两个亚单位组成的异源二聚体，它们按不同的组合构成20余种整合素。目前，整合素也被广泛用于毛囊干细胞的鉴定，常用的整合素为整合素β1。1995年，Jones等［19］根据表皮细胞表达整合素β1的水平将其进行分组培养，结果发现整合素β1高表达的表皮细胞比低表达者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Wat

t等［20］发现，富含整合素β1的皮肤基底细胞比整合素β1含量少的皮肤基底细胞能更快速的黏附细胞外基质蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述发现均为整合素β1作为毛囊干细胞特异性表面标记物提供有力支持。

综上，目前常用的分离培养方法主要包括：组织块培养法、显微分离技术、酶消化法、差数贴壁法、免疫磁珠法、流式细胞仪分选法，每种方法均有各自的优势及缺陷；组织块培养法简单，但是分离纯度不高，分离效率低下；显微分离技术相对其他方法而言，分离纯度高，但是分离过程比较费时费力；酶消化法效率高，但是酶消化过程同时会破坏细胞微环境，影响细胞存活率；差数贴壁法一般联合其他分离纯化方法，能进一步纯化所获毛囊干细胞；免疫磁珠法获得的毛囊干细胞纯度高、活性强，但是分离方法较复杂；流式细胞仪分选法所获得毛囊干细胞纯度高，但细胞活性低。因此，在选择毛囊干细胞分离培养方法时一定要根据实验的特殊要求及实验条件选择合适的方法。毛囊干细胞的鉴定方法常用的包括：角蛋白家族、钙黏蛋白家族、整合素家族；实验条件允许的情况下，同时检测两种以上的标记物来鉴定毛囊干细胞是较为准确的一种方法。

毛囊干细胞具有其他干细胞的共同特征，具有多向分化潜能。目前，已有实验证实毛囊干细胞能用于尿道缺损、神经损伤的修复；能够分化成为脂肪细胞和成骨细胞［1，21-22］；能有效促进创面愈合，将其作为工程皮肤中的种子细胞，有利于表皮细胞及汗腺、毛囊等附属器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干细胞有利于瘢痕的修复，但该研究仍处于起步阶段，相信经过研究者们的不懈努力，其必将为瘢痕治疗这一世界性难题提供一种有效的新方法。

【相关文献】

［1］赵奎，贾宗菲，弓慧敏，等.毛囊干细胞的分离方法及应用［J］.中国畜牧兽医，2010，37（12）：82-85.

［2］Wu JC，Yang TT，Xu X，et al.Research on differentiation of human bonemarrow-derived mesenchymal stem cells into chondrocytes invitro［J］.JMed Postgra，2010，23（2）：128-132.

［3］原璐，王春生，安铁洙，等.毛囊干细胞研究进展［J］.中国生物杂志，2009，29（1）：75-79.

［4］Jaks V，Barker N，Kasper M，et al.Igr5 marks cycling，yet long-lived，hair follicle

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成年大鼠毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及初步诱导分化

成年大鼠毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及初步诱导分化

ＣＨＩＮＥＳＥ　ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＮＡＴ【）ＭＹ　Ｖｏｌ＿２９　Ｎｏ．５　２００６　解剖学杂志２００６年第２９卷第５期　

成年大鼠毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及初步诱导分化　

刘　芳许家军　张传森　党瑞山　陈尔瑜　

（第二军医大学解剖学教研室，上海２００４３３）　

目前多以施万细胞（Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌｌ，ＳＣ）ｌ】］、神经干细胞　

（ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ，ＮＳＣ）［　、骨髓基质细胞（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ　

ｓｔｒｏｍａｌ　ｃｅｉｌｓ，ＢＭＳＣｓ）［３ｌ为种子细胞构建组织工程化周　

围神经。然而ＳＣ传代后形态和功能逐渐改变，ＮＳＣ来　

源受限，ＢＭＳＣｓ向神经细胞的分化率相对较低，因此寻　

找理想的种子细胞势在必行。毛囊神经嵴干细胞（ｎｅｕ—　

ｒａｌ　ｃｒｅｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ，ＮＣＳＣ）可来源于自身，取材方便，损　

伤小，不涉及免疫原性和伦理道德问题，且可以自我更　

新，并具备向神经细胞分化的优势。但是，关于毛囊　

ＮＣＳＣ国内罕见相关文献报道，而国外的研究对象多为　

小鼠。本研究拟从成年ＳＤ大鼠触须垫毛囊中分离培养　

出毛囊ＮＣＳＣ，为组织工程化周围神经的构建提供一种　

新的种子细胞。　

１材料和方法　

１．１毛囊ＮＣＳＣ的原代及传代培养　

雄性ＳＤ大鼠（第二军医大学实验动物中心提供），体　

质量１ｏ０～１５０　ｇ。颈椎脱臼致死，无菌条件下取其触须　

垫，解剖显微镜下解剖出完整毛囊（裹有结缔组织鞘）。显　

微解剖刀片切除毛囊球部，剖开结缔组织鞘，以显微外科　

镊取出毛囊外根鞘，保持隆突部的完整。贴附于３５一培　

养皿（事先涂以鼠尾胶），３０　ｍｉｎ后加入培养液（含ＤＭＥＭ／　

Ｆ１２　１：１，１　Ｎ２，２　Ｂ２７，２０　ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ，２０　ｎｇ／ｍｌ　ｂＦ—　ＧＦ），３７℃、９５　ＣＯ２／５　Ｏ２静置培养。６　ｄ后剔除毛囊，　

０．２５　胰酶消化传代培养，培养液同前，每隔２　ｄ换一半　

培养液。　１．２毛囊ＮＣＳＣ的鉴定一ｐ７５、Ｎｅｓｔｉｎ免疫荧光细胞化学　

自体脂肪颗粒加毛囊干细胞移植在脱发治疗中的应用

自体脂肪颗粒加毛囊干细胞移植在脱发治疗中的应用

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自体脂肪颗粒加毛囊干细胞移植在脱发治疗中的应用

作者：孙凯 甄永环 刘永葆

来源：《中国美容医学》2014年第13期

[摘要]目的：观察自体脂肪颗粒加毛囊干细胞移植治疗脱发的疗效。方法：自体脂肪颗粒分离纯化后， 加毛囊干细胞第一代培养细胞，对头顶脱发部位进行注射治疗。结果：36例患者，经过多次注射干细胞移植，均获得了明显改善，可见新生头发，效果满意，没有出现特殊并发症。结论：对于大面积脱发患者，应用自体脂肪颗粒加毛囊干细胞移植是一种安全、有效的方法，值得临床推广应用。

[关键词]毛囊干细胞移植；脂肪移植；脱发

[中图分类号]R622+.9 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）13-1053-02

自体颗粒脂肪注射移植治疗半面部萎缩、面部凹陷、隆乳等，在我国的整形美容手术中已有许多报道，但国内在治疗脱发方面未见报道[1]。有很多因素影响头发的生长，如头皮变薄，病理可见毛囊萎缩， 皮下脂肪变薄，甚至消失等，就会使人看起来苍老。目前，有多种方法来刺激毛囊，增加头皮的血供， 如：梅花针、艾灸等，但各有优劣， 效果不尽人意。自2012年以来，笔者应用自体脂肪颗粒加毛囊干细胞移植来填充头皮下脂肪层共36例患者，均取得了良好效果，现报道如下。

1 临床资料

36例脱发患者，其中男性20例，女性16例，年龄23～46岁，脱发面积20～40cm2，发软，质干枯， 绒毛状，细小， 脱发部位以头顶为主，采用脂肪移植加干细胞注射治疗。

2 手术方法

2.1脂肪供区的选择：患者脂肪供区多选择腹部及腰背部。龙胆紫标记范围，用膨胀麻醉液皮下注射（配制方法为每1000ml生理盐水加2%利多卡因25ml，肾上腺素1mg），局部注射至皮肤发白，采用普通的注射器抽吸颗粒脂肪。用20ml注射器连接16～18号针头，将针头插入抽吸部位后回抽针芯，使针筒内形成负压，并保持负压，采用扇形往复抽吸技术，取得脂肪颗粒200～250ml[2]。

干细胞在临床医学中的应用

干细胞在临床医学中的应用

干细胞在医学中的应用

摘要：干细胞(stem cells, SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)和成体干细胞(somatic

stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem

cell,TSC)、多能干细胞（pluripotent stem cell）和单能干细胞（unipotent stem

cell）。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。

关键字：胰岛干细胞、神经组织细胞、皮肤干细胞、干细胞、脐血干细胞、成人干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞

前言：干细胞即为起源细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。

胚胎干细胞（Embryonic stem cell）的发育等级较高，是全能干细胞（Totipotent stem cell），而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。据文献报导干细胞是一类具有自我更新和分化潜能并保持未分化状态的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。

在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。胚胎的分化形成和成体组织的再生是干细胞进一步分化的结果。胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力。而成体组干细胞在医学中的应用

Wnt信号通路与毛囊干细胞

Wnt信号通路与毛囊干细胞

第27卷　第4期2010年　8月 生物医学工程学杂志JournalofBiomedicalEngineering Vol.27　No.4August　2010Wnt信号通路与毛囊干细胞＊邵　勇1　倪振洪1　综述　李玉红2Δ　审校1(解放军第三军医大学学员旅,重庆400038)2(解放军第三军医大学基础部细胞生物学教研室,重庆400038)摘　要:毛囊干细胞(FSC)具有慢增殖特性和多向分化潜能,维持着毛囊的变化和稳定以及皮肤创伤后的修复。FSC增殖分化机制的研究为毛发再生、皮肤疾病的治疗提供了新的途径。目前已知Wnt信号通路在调控FSC增殖分化中发挥着重要作用,而且不同的Wnt蛋白表现出不同的调控作用。现就Wnt信号通路对FSC的调控及不同Wnt蛋白的不同作用予以综述。关键词:毛囊干细胞;Wnt信号通路;增殖;分化中图分类号　R329.2+8 文献标识码　A 文章编号　1001-5515(2010)04-0945-04WntSignalTransductionPathwaysandHairFollicleStemCellsShaoYong1　NiZhenhong1　LiYuhong21(BrigadeofStudents,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)2(DepartmentofCellbiology,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)Abstract:Hairfolliclestemcells(FSCs),whichhavecharacteristicsofslowcyclingandmultipotentialdifferentia-tions,playanimportantroleinmaintaininghairfolliclecyclingandrepairingtheepidermisduringwoundhealing.Theresearchesinthissubjectmaybehelpfultoprovidenewidealsintreatingthediseasesofhairandskin.Asweknow,theWntsignaltransductionpathwayhasasignificantmeaningincontrollingtheproliferationanddifferentia-tionofFSCs,anddifferentWntproteinshavedifferentfunctionsinthisprocess.Inthispaper,wereviewhowtheWntsignaltransductionpathwaycontrolstheFSCsandwhatthefunctionsofdifferentWntproteinsare.Keywords:Hairfolliclestemcell(FSC);TheWntsignaltransductionpathway;Proliferation;Differentiation引言毛囊干细胞(hairfolliclestemcell,FSC)具有慢增殖特性和多向分化潜能,位于毛囊的隆突区,即皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘[1]。它不仅在毛囊周期生长中起重要作用,同时也是表皮和皮脂腺自我更新的细胞来源,对毛发再生及促进皮肤损伤后的修复有重要意义。一定条件下FSC能分化成表皮、黑素细胞、皮脂腺、毛囊以及神经元、星状细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞等不同类型的细胞[1]。FSC的增殖分化是发挥FSC生物学功能的关键步骤,因此其分子调控机制成为了近年的研究热点。Wnt信号通路、BMP/TGF-β通路、Notch通路、Shh通路及FGF通路都参与了FSC＊国家自然科学基金资助项目(30871888)Δ通讯作者。E-mail:leo61999@增殖分化的调控[1]。而大量研究表明Wnt信号通路对FSC的调控至关重要。现就Wnt信号通路对FSC增殖分化的调控,及不同Wnt蛋白的不同调控作用作如下综述。1　Wnt蛋白与Wnt信号通路Wnt蛋白是一种分泌性糖蛋白,通过自分泌或旁分泌的方式发挥作用。从线虫到人类已分离、鉴定了近100个Wnt基因。Wnt信号通路参与细胞的增殖、分化、迁移、极性化和凋亡等过程,以及邻近细胞间的相互作用[2]。它是一条十分保守的信号传导通路,与胚胎的发育过程及多种肿瘤的发生过程有密切关系。已知多种高发性恶性肿瘤与Wnt信号通路的失调密切相关,包括结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞癌等[3]。目前研究认为Wnt信号通路在细胞内至少有3条:①Wnt/β-catenin信号通路(canonicalWntsig- 生物医学工程学杂志 第27卷naltransductionpathway):为经典途径,可被Wnt1、Wnt3a和Wnt10b等(见表1)激活。此通路激活后将提高细胞质内β-catenin浓度,后者转移入细胞核,激活特定基因的转录。β-catenin是此通路中最关键的转录因子,结合的β-catenin在细胞连接处与钙粘蛋白(E-cadherin)结合形成粘合带,游离的β-catenin可进入细胞核调节基因表达[4]。②Wnt/polarity细胞极性信号通路(planarcellpolaritypathway):为非经典途径,在脊椎动物中又称Wnt/Jun激酶途径,包括RhoA蛋白和Jun激酶。该通路不依赖于β-catenin,主要参与细胞极性的建立和调控细胞骨架的重排,并参与原肠胚形成。迄今为止尚无此通路涉及肿瘤事件的报道[4]。③Wnt/Ca2+信号通路:为非经典途径,可被Wnt5a、Wnt11等激活。此通路可能通过钙依赖性激酶、钙调蛋白和转录因子NF-AT调节细胞黏附发挥抑癌作用。其机制为激活卷曲蛋白受体,释放Ca2+并激活蛋白激酶C,诱导细胞内Ca2+浓度增加,活化T细胞核因子[4]。表1　Wnt蛋白与Wnt信号通路Tab.1　WntprotainsandWntsignaltransductionpathwaysWnt信号通路Wnt蛋白经典途径[5]Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt5a[6]、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、Wnt10b非经典途径[7]Wnt4、Wnt5a、Wnt112　Wnt信号通路对FSC的作用2.1　Wnt信号通路在FSC增殖中的作用FSC增殖是维持毛囊周期性生长和皮肤自我更新的基础。Wnt经典信号通路可以促进FSC的增殖。Zhu等利用逆转录病毒转染角朊细胞,使细胞表达不同的β-catenin突变体[8]。研究结果显示,氨基端截短的β-catenin突变体(因无GSK-3结合位点而无法被降解)可增加培养细胞中干细胞克隆的比例,且与TCF/LEF转录因子的活性改变密切相关,表明Wnt信号通路可以使FSC增殖。张艺等[9]采用ICC的方法观察β-catenin在不同培养时相FSC中的定位表达变化。结果显示,伴随β-catenin由胞膜转向胞质再转入胞核的过程,ki67(细胞增殖标志物)在核内表达增加,细胞增殖加速,表明β-catenin的核内转位是FSC增殖的重要信号调节机制。2.2　Wnt信号通路在FSC分化中的作用FSC分化时首先形成短暂扩充细胞,后者快速增殖3～5代后定向分化成终末分化细胞。FSC具有多向分化潜能,可分化形成表皮、皮脂腺和毛囊等。FSC的分化受内源性调控因素和外源性调控因素的调控。在成体干细胞的定向分化调控中,外源性因素更为重要。Wnt信号通路促进了FSC进入细胞周期并根据不同的调控信号向相应的细胞分化[10]。其中β-catenin作为调控FSC分化的外源性因素作用巨大。高度激活β-catenin可导致FSC向毛囊分化,缺少或者低强度激活β-catenin则促进其分化成为皮脂腺或表皮方向细胞。Huelsken等[11]研究发现,毛囊缺失后β-catenin突变皮肤的FSC的存在和分布受到影响,失去了向毛囊分化的特征,而是朝着上皮角化细胞的方向分化,表明在β-catenin突变皮肤的FSC不再参与突变上皮毛发的自我更新,而只具有上皮分化倾向。Das等[12]在出现上述现象后,改变其转基因形式,使β-catenin过度表达。结果上述过程被翻转,即本来分化成上皮方向的细胞反而朝毛发方向分化了。Gat等利用转基因技术使β-catenin磷酸化位点缺失从而增加其稳定性,结果发现转基因小鼠出现多毛现象,毛囊间表皮出现了新的毛囊,而转基因成年鼠只有在毛囊新周期开始时才出现新毛囊[8]。β-catenin短暂激活于成年小鼠的毛囊中,可以诱导新的毛囊形成,但持续的激活将导致毛囊肿瘤的发生。2.3　Wnt信号通路对FSC的作用机制通常在没有Wnt信号的情况下,细胞质中游离的β-catenin与大肠腺瘤息肉蛋白(APC)、轴素(ax-in)、酪蛋白激酶(caseinkinase,CK)、糖原合成激酶(GSK-3β)一起形成多蛋白复合物。GSK-3β和CK可以对β-catenin残基进行磷酸化,而磷酸化后的β-catenin将启动泛素化依赖的蛋白降解过程,使β-catenin降解。当Wnt蛋白通过自分泌和旁分泌的形式作用于FSC时,FSC的跨膜受体frizzled与之形成特异性结合,使Wnt通路经典信号途径被激活。经过一系列过程使GSK-3β激酶失活,多蛋白复合物不能形成,阻止了β-catenin发生磷酸化而降解,导致细胞质内的游离β-catenin水平升高。当β-catenin在细胞内的堆积达一定量时,可以通过核孔946第4期 邵　勇等:Wnt信号通路与毛囊干细胞 进入细胞核,完成β-catenin的转移分布。进入核内的β-catenin与T细胞因子(TCF)/淋巴细胞因子(LEF)结合形成复合物,激活c-myc(促进细胞从G0期进入S期,认为与细胞的增殖分化密切相关)、cy-clinD1等基因的转录,从而促进细胞增殖以及起到维持FSC群落的作用[13,14]。3　各种基因编码的Wnt蛋白对FSC的不同作用 目前,在人和小鼠体内已发现19种不同基因编码的Wnt蛋白,所有的Wnt基因及其相应受体的功能都不尽相同。这种基因的多样性导致动物体内不同的细胞在不同的时间接受不同的信号,从而发挥精细的调控作用。研究不同的Wnt蛋白,将使FSC增殖分化的各种调控更为清楚,使今后人为调控更加精确。Wnt1:李元朝等[15]将重组腺病毒转入人表皮干细胞中,并以正常人表皮干细胞作对比进行培养研究。结果发现培养上清液中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-7的含量均明显高于对照组,表明Wnt1重组腺病毒有诱导人表皮干细胞向腺样上皮细胞分化的作用。Wnt3:旁分泌因子Wnt3表达于发育中和成熟的毛囊,可能涉及毛囊生长的调节。当它在转基因小鼠皮肤中过表达时,由于改变了毛干前体细胞的分化,会使小鼠出现一种短毛的表现型。而且由于毛干结构的缺失以及毛干中异常轮廓蛋白的表达,会使小鼠出现周期性的秃毛。进一步的实验发现,细胞质中的散乱蛋白-2可能是Wnt3途径的效应分子[16]。Wnt3a:Li等[17]研究了Wnt3a和Wnt/β-cate-nin信号在人胎儿表皮干细胞增殖分化的效应,发现两者都能表达于人胎儿表皮和表皮干细胞。且用溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine)标记其增殖,外皮蛋白(involucrin)标记其分化,结果显示Wnt3a蛋白可以在体外培养过程中促进表皮干细胞的增殖而抑制其分化,表明Wnt3a和Wnt/β-catenin信号在人胎儿表皮干细胞发育和稳定中起到重要作用。Wnt5a:可溶性的Wnt5a蛋白既能抑制经典通路也能激活经典通路,这取决于哪一种受体组合表达于细胞表面。当Wnt5a与酪氨酸激酶样孤儿受体Ror2相互作用时,下调β-catenin诱导的信号基因表达,经典通路中的Wnt/β-catenin途径就会被抑制;而当Wnt5a与Fz4和LRP5结合时,β-catenin途径就被激活[5]。有研究表明,牛皮癣患者Wnt5a与其他Wnt蛋白的表达有着明显的差别:Wnt5a呈高表达,而Wnt4、Wnt16没有改变,Wnt7b呈低表达。这项研究对牛皮癣的病理生理学研究有一定帮助[18]。Wnt5a还可以调节真皮层的形成。Wnt10b:张坤等[19]研究了wnt10b在小鼠毛囊周期中的表达,发现Wnt10b的表达具有严格的时空特异性,生后第一周期特异性表达于生长期毛囊的毛母质细胞,提示Wnt10b与毛囊的周期性生长有关,并可能参与毛囊周期启动。Yukiteru等[20]采用基因工程技术获得Wnt10b重组体,研究Wnt10b对成年小鼠衍生原始表皮细胞的作用。培养最终导致小鼠衍生表皮细胞形态学上的改变,从立方型变为纺锤状,而且抑制了其增殖,研究发现Wnt10b激活了经典Wnt信号通路。应用AyoubShklar染色和免疫细胞化学方法观察到,被Wnt10b作用的小鼠衍生表皮细胞表现出毛干和毛根内鞘的一些特性。深入研究发现,细胞出现出分化表皮细胞的mRNA。结果表明,Wnt10b抑制了小鼠原代表皮细胞的增殖,促进了其分化,使分化朝着毛干和毛囊内鞘的方向进行。之后他们[21]又对比研究了Wnt10b及其他Wnt信号(Wnt3a、Wnt5a、Wnt11)对表皮分化和毛干生长的作用,结果显示只有Wnt10b表现出明显的促进表皮细胞分化和毛干生长的作用。Wnt11:抑制了Wnt3a引起的经典信号途径而影响FSC。其抑制作用与Wnt5a的抑制作用相同,即在细胞内表现在β-catenin下游区,在细胞外表现在细胞膜表面[21]。非经典途径中Wnt11通过调整E-钙粘素而控制组织形态形成[22]。Wnt基因家族中与人及小鼠相关的还有Wnt2、Wnt2b/13、Wnt4、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt16。其中只有Wnt10b、Wnt10a、Wnt5a于毛发形成早期呈高表达状态;Wnt4作用于上皮-间叶细胞间的相互联系;Wnt7a调节细胞发育的极性。有报道显示,Wnt4、Wnt5a和Wnt11在创伤后呈暂时性的高表达状态[23]。4　前景展望研究Wnt通路与FSC的增殖分化及其调控机制,为脱发患者带来福音。Morrell等[24]研究发现含有脂质的Wnt蛋白方可表现出生物活性,于是他们在脂肪囊中包装纯的Wnt3a蛋白进行实验。当947