GST蛋白纯化

GST bestarose 4FF说明书

默认分类 2010-01-18 09:32:34 阅读257 评论0 字号：大中小

GST bestarose 4FF是专门用于纯化pGEX系列载体表达的GST标签蛋白，其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，操作简单，快速。

GST bestarose 4FF 可直接从预处理的细胞裂解物中纯化GST-tagged蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的生物活性。

GST bestarose 4FF 具有高流动性，易于放大，GST bestarose 4FF有快速方便的预装柱，Ez-Fast

bestarose 4FF 1ml和5ml。

介质性能

谷胱甘肽是通过10碳原子的连接臂偶联到4%高度交联的琼脂糖上。最优的偶联作用使介质具有高GST-tagged蛋白及与谷胱甘肽相互作用蛋白的结合能力。

总的蛋白结合能力约为每毫升填料结合10mg标签蛋白，动态结合能力随着外界因素改变，如不同的目标蛋白，流速等等。

如果需要去除GST部分（天然蛋白分子量为26KD），当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后用位点专一的蛋白酶消化，选用前种方法，可减少额外分离目的蛋白与GST步骤，消化后，目的蛋白直接用结合液洗脱即可。

表1 GST bestarose 4FF性能

配体 谷胱甘肽与10碳原子连接臂

配体浓度 120-320μmol谷胱甘肽/ml填料

蛋白结合能力 ≈ 10mg重组GST-tagged蛋白/ml填料，GST，Mr26000

动态结合能力 ≈11mgGST-tagged蛋白/ml填料，Mr43000

平均颗粒大小 90μm

组成 4%高度交联的琼脂糖

最大流速* 450cm/h（15ml/min），XK层析柱，柱高5cm,水溶性缓冲液，室温纯化

建议的流速** 上样：＜100cm/h（＜3ml/min ，XK层析柱）

洗涤与洗脱：100-300cm/h（3-10ml/min，XK层析柱）

化学稳定性 所有常用的水溶性缓冲液中稳定，如：1M醋酸盐，pH7.4，6M 盐酸胍，室温，1h

pH稳定性 pH3-12

贮存温度 +4-30℃

贮存液 20%乙醇

* 水是室温的。

** 结合力与流速有关，低流速增加结合量，这在上样和洗脱过程中非常重要。蛋白性质，pH，温度也影响结合量。

试剂配制

缓冲液的配制：

用来配缓冲液的水及化学试剂纯度要求很高，建议试剂配好后，用0.45μm滤膜过滤。

结合液：PBS，pH7.3（140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3）

洗脱液：50mM Tris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽，pH8.0）

注意：结合液和洗脱液中可以含有1-10mM DTT。

样品的准备：上样前，样品需离心或用滤膜过滤。 如果样品太稠，用结合液稀释，以防堵塞柱子，如果是batch纯化，则可以不过滤样品。

Batch 纯化

GST bestarose 4FF的准备

1. 确定你所需的介质体积。

注意：介质是贮存在20%乙醇中的，洗净后，配成50%。

2. 轻轻摇匀瓶中的介质。

3. 用移液枪或量筒取适量的介质到一个干净的管子中。

4. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液。

5. 加每毫升介质加5毫升PBS洗涤，颠倒混合。

6.沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液。

7.重复步骤5和6，2-3次。

Batch纯化步骤

1. 将细胞裂解液加入准备好的胶中，旋转仪轻轻转动混合，室温，至少30min,

2. 用移液枪或量筒取适量的介质到一个干净的管子中。

3. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于流穿液），保留一些，用SDS-PAGE电泳检测介质结合能力。

4. 每毫升步骤3沉淀加5毫升PBS洗涤。

5. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于洗涤液），保留一些，跑电泳。

6. 重复步骤4和5，两次。

7. 每毫升步骤5沉淀加0.5ml 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH8.0，旋转仪于室温轻轻转动混合5-10min。

8. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于洗脱液）。

9. 重复步骤7和8，两次。分别检测这三次的洗脱液。

注意：

? GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间。不同的GST融合蛋白结合效率差异显著。

? 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度，洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要是需对流穿液，洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。

? GST检测试剂盒可辅助优化洗脱条件，分析纯化过程的每个步骤，该试剂盒主要用生化或免疫分析检测GST-tagged蛋白。

? A280处的吸收值可用来估算GST-tagged蛋白浓度，约A280~1对应浓度为0.5mg/ml。

? GST-tagged蛋白浓度也可用标准的显色方法测定（如Lowry，BCA，和Bradford法）。如果用Lowry法和BCA法，样品首先要脱盐，或在PBS中透析去除谷胱甘肽，因为谷胱甘肽会干扰蛋白的吸收，而Bradford法不受谷胱甘肽影响。

? 介质的再次使用，主要取决于样品的性质，必须是同一个样品，防止交叉污染。

层析柱层析

建议使用的层析柱：

Tricorn 10/100：柱体积8.5ml，柱高15cm。

XK 16/20：柱体积30ml，柱高15cm。

或者GST Ez-Fast 4FF 1ml和5ml的预装柱也可使用。

装柱

1. 所有的材料都处于纯化时所需的温度。

2. 用pH7.3 PBS冲洗柱底部的垫片，避免垫片下面滞留气泡，在液面低至1-2cm高度时关闭层析柱下端出口。

3. 摇匀瓶中的介质。

4. 估算所需介质的（匀浆的浓度约为60%）。

5. 吸取介质，用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中，这可以减少气泡的产生。

6. 立即用PBS灌满柱子，放上上层垫片，将柱子连接到泵上。

7. 打开下端出口，设置流速。

8. 至少流过三倍柱体积的PBS，直到界面不变，在界面处做上记号。

注意：纯化时的流速不要超过75%的装柱流速。

9. 关闭泵，并关闭柱子下端出口，去除层析柱上层垫片，小心的用PBS封满柱子，在顶部形成一个凸面。

10. 从一角插入转接头，确保网下没有空气残留。

11. 将转接头缓慢向下移动（转接器上接口是打开的），到记号处停止，并锁住转接头，把把柱子连接到泵上或色谱分析系统上，开始平衡。如果需要可重新移动转接头的位置。

层析柱纯化步骤

1. 5倍体积的结合液平衡柱子。

2. 加入以处理好的样品。

3. 5-10倍柱体积的结合液洗涤柱子，直至在流穿液中检测不到东西。保留一些，用SDS-PAGE电泳检测介质结合能力。

4.5-10倍体积的洗脱液洗脱蛋白。

注意：

? 影响GST-tagged蛋白及与谷胱甘肽作用的蛋白结合的最重要因素是介质的流速，GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间。蛋白性质，pH，温度也影响蛋白的结合。

? 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度，洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要是需对流穿液，洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。

? GST检测试剂盒可辅助优化洗脱条件，分析纯化过程的每个步骤，该试剂盒主要用生化或免疫分析检测GST-tagged蛋白。

? A280处的吸收值可用来估算GST-tagged蛋白浓度，约A280~1对应浓度为0.5mg/ml。

? GST-tagged蛋白浓度也可用标准的显色方法测定（如Lowry，BCA，和Bradford法）。如果用Lowry法和BCA法，样品首先要脱盐，或PBS中透析去除谷胱甘肽，因为谷胱甘肽会干扰蛋白的吸收，而Bradford法不受谷胱甘肽影响。

? 介质的再次使用，主要取决于样品的性质，必须是同一个样品，防止交叉污染。

介质的清洁

当沉淀物，变性的及非特异性吸附的蛋白累积时，介质的结合能力会下降。 ? 去除沉淀物及变性蛋白：2倍体积的6M盐酸胍洗涤，然后快速用5倍体积pH7.3，PBS洗涤。

? 去除疏水性结合的蛋白：用3-4倍体积的70%乙醇或2倍体积的1%Triton X-100洗涤，然后快速用5倍体积pH7.3，PBS洗涤。

贮存

贮存于70%乙醇中，+4-30℃。

GST标签的切除

在大多数情况下，融合部分保留它的功能活性，可用完整的GST融合蛋白检测其活性。如果需要切除GST标签，当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后，用位点专一的蛋白酶如PreScission蛋白酶，凝血酶或Xa因子切除。

如果酶切条件需要优化时，建议洗脱后酶切。易于随时取样，通过SDS-PAGE电泳分析产量，纯度及酶切情况。完全酶切的蛋白酶的用量，温度及酶切时间随不同的融合蛋白改变。在中试研究中确定融合蛋白的最适条件，如，加大酶量，酶切时间可以减小。

1. PreScission蛋白酶

PreScission蛋白酶，Mr 46000。

PreScission酶切缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mMEDTA，1mM DTT，pH7.5。

PreScission蛋白酶酶切结合在层析柱上的GST-tagged蛋白

假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料

1. 接着“Batch纯化”步骤1-6或“柱纯化”步骤1-3。

2. 用10倍柱体积的PreScission蛋白酶缓冲液平衡结合带有融合蛋白的柱子。

3. 准备PreScission蛋白酶切体系：每毫升结合融合蛋白的柱体积， 4℃条件下，准备80μl(160个单位)

PreScission蛋白酶和920μlPreScission蛋白酶切缓冲液的混合物。

4. 将准备好的酶切体系加到层析柱上，封住层析柱。如果是batch纯化，PreScission蛋白酶切体系与介质混合即可，轻轻摇动或旋转悬浮液。