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一种土壤微生物总DNA的高效提取方法

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土　壤 (Soils), 2004, 36 (6): 662~666一种土壤微生物总DNA的高效提取方法①黄婷婷１ 曹 慧１ 王兴祥２ 崔中利１，　２＊　（1 南京农业大学农业部环境微生物工程重点开放实验室南京210095；2 中国科学院南京土壤研究所南京210008）摘 要 获得高浓度、大片段、多样性程度高的土壤微生物总DNA 是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。

本文采用间接法(菌体细胞回收法)提取红壤地区两种土壤类型的土壤微生物总DNA，定量计算其回收率，并与直接法(细胞原位裂解法)比较了提取效率和纯度。

结果表明：红壤地区2种土壤每克干土的总DNA 提取量，间接法约为0.34和0.53µg/g干土，直接法约为13.62和24.32µg/g干土；间接法的提取效率低于直接法，但所得DNA片段较大，且Sau 3AⅠ酶切和16 S rDNA通用引物PCR扩增结果显示，间接法比直接法更能有效地去除土壤中的某些抑制剂，所得总DNA的纯度更高，有利于后续操作。

关键词土壤微生物；总DNA提取；细胞回收；粗DNA纯化中图分类号 S154土壤微生物生态系统极为复杂，在很大程度上还是未知的。

土壤微生物不仅是土壤中物质循环的驱动力，其代谢物也是植物的营养成分，其活动能直接影响到土壤的物理、化学性质[1, 2]。

可以说，土壤微生物生态系统是一个巨大的、潜在的科研和经济价值远未得到开发的微生物资源库。

目前可在实验室培养的微生物还不到自然界中微生物总数的1%，还有相当多的菌种因为无法人工培养而未被人类所认识[3]。

随着分子生物学技术的发展，PCR的指纹技术、DNA文库、FISH、Microarray等技术被广泛应用于土壤微生物群落结构以及基因资源的开发利用，丰富拓展了人们对土壤中不可培养微生物的认识[4, 5]。

分子生物学技术研究土壤微生物群落结构的实质是用土壤微生物DNA的不均一性来反映土壤微生物的种群结构特征。

因此，获得高浓度、大片段、多样性程度高、具有代表性的土壤微生物总DNA 是研究土壤微生物群落结构的分子生态学基础。

由于土壤样品中含有较多的腐质酸和粘粒等抑制物质，这些物质可对内切酶消化、PCR扩增、杂交等后续操作产生强烈的影响[6, 7]，因而提取与纯化土壤微生物总DNA在研究中尤为重要[8, 9]。

已报道的从土壤样品中提取DNA的方法有很多种，主要可分为直接法和间接法两类。

直接法是直接对样品进行裂解，然后从裂解物中获得DNA；而间接法则是先从土壤中回收细胞再提取DNA。

和直接法相比，间接法获得的DNA分子量更大，纯度更高，但不可避免的，该法得到的DNA产率有所降低。

由于人们普遍认为较高的DNA得率更能代表大部分的土著微生物种群和遗传多样性[10]，目前进行基因文库构建时大多仍采用直接法提取土壤总DNA。

但最近研究显示，直接法包含的高DNA 得率并不一定代表了种群的丰富度，并且序列的代表性也受到所采取的不同提取方法的影响，且有研究发现由直接法建立的基因文库中还包含了大量真核生物的基因片段。

由于真核生物基因增加基因文库的大小但其遗传信息并不能在原核宿主载体中表达，因此间接法为构建更高质量的基因文库提供了条件[11]。

本文采用间接提取法对两种植被条件下红壤的总DNA进行提取，并与直接提取法比较了提取和纯化的效率，为红壤地区微生物群落结构多样性分析以及功能性基因的获得奠定了基础。

１ 材料与方法　１．１ 研究区域概况与土壤样品采集　研究区域位于江西省鹰潭市余江县。

该区域具有中亚热带温暖湿润的季风气候，年均温为17.8℃，年均降雨量为1785 mm，且主要集中在4~6月；地①国家自然科学基金项目（40371069），中国博士后科学基金项目（2003033495）和中国科学院创新项目( KZCX3-SW-417)资助。

*通讯作者(czl@)第6期黄婷婷等：一种土壤微生物总DNA的高效提取方法 663形为低丘岗地，海拔35.0~54.6 m，坡度为5°~8°；土壤为第四纪红粘土发育的红壤[12]。

选择旱地和水田两种红壤粘土类型。

土壤样品为5点混合样品，采样深度为0~20cm，每个土壤样品重1 kg。

土壤采集后，用布袋封装，以增加样品的通气性。

样品带回室内，除去根系、石块等杂物，再过4mm筛，保存在4℃冰箱，1周内完成土壤总DNA的提取。

供试土壤理化性质见表1。

表１ 供试土壤的理化性质　Table 1 Physico-chemical properties of soils testedpH 含水量全N 全P 全K 有机质土壤类型（KCl）（g/kg）（g/kg）（g/kg）（g/kg）（g/kg）水田红粘土 3.98 304.8 1.30 0.52 11.85 24.57 旱地红粘土 4.41 214.9 1.32 0.67 11.43 20.99１．２ 主要试剂　DNA 提取液：100 mmol Tris·HCl（pH8.0），100 mol EDTA·Na（pH8.0），100 mmol 磷酸钠（pH8.0），1.5 mol NaCl，10 g/L CTAB。

1×匀浆缓冲液：100 mmol Tris·HCl（pH8.0），100 mmol EDTA·Na（pH8.0）， 200 g/L SDS，10 g/L CTAB。

洗涤缓冲液：0.33 mol Tris·HCl（pH8.0），1 mmol EDTA·Na（pH8.0）。

裂解缓冲液：100 mmol Tris·HCl（pH8.0），100 mmol EDTA·Na（pH8.0），1.5 mol NaCl，10 g/L CTAB；1 g/L 焦磷酸钠；200 g/L SDS；蛋白酶K（20 mg/ml）；溶菌酶（50 mg/ml）；氯仿：异戊醇（v:v = 24:1）；异丙醇；3 mol 醋酸钠（pH5.2）。

核酸电泳缓冲液：1×TAE缓冲液。

１．３ 土壤ＤＮＡ的提取方法　１．３．１ 间接法提取自然土壤总DNA 参考Esther M. Gabor的Blending method[11]并进行了适当修正。

具体步骤如下：称取50 g左右土壤样品，加入50ml 预冷的无菌水混匀后匀浆机匀浆，匀浆过程中要有时间间隔以防温度过高，然后补加2×blending buffer，充分振荡混匀；低速（200~300g）室温离心10 min，收集上清液转移至另一离心瓶中。

沉淀再用100ml 1×blending buffer 洗涤重悬，离心取上清液，与前次合并；所得上清液室温下高速（10000g）离心30min以回收菌体细胞；所得细胞依次用150 ml 1 g/L 焦磷酸钠和100 ml chrombath buffer洗涤，离心取沉淀；8 ml lysis buffer 重悬沉淀，加160 µl 溶菌酶（50 mg/ml）和20 µl蛋白酶K（20 mg/ml），37℃水浴30 min；加1 ml 200 g/L SDS，65℃水浴2h，其间每隔15~20 min轻轻颠倒混匀；反应完成后氯仿-异戊醇抽提，异丙醇沉淀；回收沉淀洗涤，吹干后溶解于200 µl 灭菌的超纯水。

１．３．２ 直接法提取自然土壤总DNA[13, 14]称取5克土壤样品，与13.5 ml DNA extraction buffer混合，迅速置于-70℃冰冻30 min，取出后于65 ℃水浴融化，如此反复2~3次裂解细胞；加入100 µl蛋白酶K（10 mg/ml），于37℃摇床上振荡30min（225 r/min）；加入1.5ml 200 g/L SDS，65℃水浴2h，其间每隔15~20 min轻轻颠倒混匀；室温离心（6000 g）10 min，收集上清液，转移到50 ml离心管中，土壤沉淀再加入4.5 ml提取液和0.5 ml 200 g/L 的SDS，涡旋10s，65℃水浴10min，室温离心（6000 g）10 min，收集上清液并与前次上清液合并。

上清液用等体积的氯仿-异戊醇（v：v=24：1）抽提，离心后吸取水相转移至另一50ml离心管中，以0.6V 异丙醇室温沉淀1h，室温离心（6000 g）20 min，收集核酸沉淀，用冷的700 ml/L 乙醇洗涤沉淀，吹干，溶解于灭菌的超纯水中，最终体积为300 µl。

１．４ 土壤ＤＮＡ的纯化　采用透析袋电洗脱纯化回收法对土壤中提取的微生物总DNA进行纯化。

具体回收步骤参照参考文献[15]。

１．５　土壤微生物总ＤＮＡ的定量及提取和纯化效率 的计算　采用紫外分光光度法测波长260nm的吸光度值对土壤总DNA进行定量，参见参考文献[5]。

吸取20µl的标准ëDNA（0.0569µg/µl），按上述回收方法回收，回收后，核酸沉淀再溶于20µl无菌水中，然后回收DNA与标准ëDNA（0.0569µg/µl）同时电泳后经溴化乙锭染色，用TANON软件进行定量，计算纯化回收效率。

提取效率= (粗提DNA总量×稀释倍数) /干土% ×100%664 土壤第36卷回收效率=纯化后DNA总量/粗提DNA总量× 100%１．６ 提取ＤＮＡ的酶切和ＰＣＲ扩增　用Sau3A Ｉ对总DNA进行酶切；用细菌的16S rDNA通用引物对纯化后的土壤总DNA进行扩增。

扩增16S rDNA 的引物1序列为: 5’-agagtttgatc- ctggctcag-3’ ( E. coli bases 8 to 27)；引物2序列为: 5’-taccttgttacgactt-3’ ( E. coli bases 1507 to 1492)。

PCR 扩增反应体系: 10 ×缓冲液2.5 ìl，dNTP (25 mmol/L) 2 ìl，引物1 (25pmol/ìl )1 ìl，引物2 (25 pmol/ìl) 1 ìl，Mg2 + (25 mmol/l ) 2.5 ìl ,模板(适当稀释的土壤DNA)2 ìl , Taq DNA聚合酶2.5U, dd H2O 13.5 ìl，总体积25 ìl 。

反应参数：95 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

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一种高效经济的土壤微生物DNA提取方法[发明专利]

一种高效经济的土壤微生物DNA提取方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811285548.X(22)申请日 2018.10.31(71)申请人 河北工业大学地址 300130 天津市红桥区丁字沽光荣道8号河北工业大学东院330#(72)发明人 李亮　郭子渝　崔忠信　胡海诚　常乐乐　蒋雨萌　(74)专利代理机构 天津翰林知识产权代理事务所(普通合伙) 12210代理人 赵凤英(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种高效经济的土壤微生物DNA提取方法(57)摘要本发明为一种高效经济的土壤微生物DNA提取方法。

该方法包括如下步骤：步骤一：获取微生物悬液；称取1克土壤,加入2 ml悬浮缓冲液Buffer C1，并加入1克粒径0.09-0.12 mm的玻璃珠,加入500μL的腐殖酸吸附剂Buffer C2，加入10μL蛋白酶K(10 mg/mL)，混合后震荡；步骤二：获取微生物DNA；步骤三：获取粗制DNA；将上步得到的物质搅拌下置于60℃下水浴,然后4℃条件下高速离心,收集第一上清液；步骤四：获取精制DNA。

本发明立足于土壤污染微生物检测的需要，能从土壤、粪便等复杂环境样品中提取不含抑制因子的DNA，提取速度快、分析结果准确。

权利要求书1页 说明书5页CN 109337900 A 2019.02.15C N 109337900A1.一种高效经济的土壤微生物DNA提取方法，其特征为该方法包括如下步骤：步骤一： 获取微生物悬液；称取1克土壤 ,加入2 ml悬浮缓冲液Buffer C1，并加入1克粒径0.09-0.12 mm的玻璃珠,加入500μL的腐殖酸吸附剂Buffer C2，加入 10 μL蛋白酶 K (10 mg/mL)，混合后震荡10 min；步骤二：获取微生物DNA；将步骤一所得溶液再加入裂解液2 ml的Buffer C3并涡旋振荡20~30 S；步骤三：获取粗制DNA；将上步得到的物质搅拌下置于 60℃下水浴 20~30 min , 然后4℃条件下高速离心, 收集第一上清液；步骤四：获取精制DNA；将步骤三所得第一上清液与等体积的buffer C4混合,高速离心15-20 min , 然后吸取水相转移至离心管中,加入与吸取的水相等体积的 buffer C5,高速离心10-15 min ,得到第二上清液；以 0.6倍第二上清液体积的buffer C6，在-20℃条件下沉淀 30-45 min ,4℃高速离心20-30 min ,收集核酸沉淀, 分别用在-20℃预冷的 WB1和WB2依次洗涤沉淀,最后用TE溶液溶解沉淀；所述的BufferC1试剂为：浓度为0.10~0.30 mol/L磷酸钠溶液；所述的BufferC2试剂的制备方法，包括以下步骤：称取3.2000 g光谱纯二氧化钛于容器中,加入12.8 g硫酸铵,32 mL硫酸,并称取0.2 g活性炭，加热至溶解，冷却至室温,加水稀释至200 mL ,摇匀,备用；所述的BufferC3试剂为含有2% CTAB、1.4 M NaCl、0.02 M EDTA、0.1 M Tris -Cl、0.2% 巯基乙醇和20% SDS的水溶液；所述的Buffer C4试剂的组成为酚、氯仿和异戊醇，体积比为酚：氯仿：异戊醇=25：24：1；所述的buffer C5试剂的组成为氯仿和异戊醇，其中体积比氯仿：异戊醇=24：1；所述的buffer C6试剂为异丙醇；WB1试剂为纯度95%的乙醇；WB2试剂为纯度75%乙醇。

土壤dna提取方法

土壤dna提取方法

土壤dna提取方法土壤DNA提取是指从土壤样本中获取土壤微生物DNA的过程。

它是研究土壤微生物群落结构和功能的关键步骤之一。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，对土壤养分循环、生物地球化学循环和土壤质量具有重要影响。

因此，研究土壤微生物DNA有助于深入了解土壤生态系统的功能和稳定性。

土壤DNA提取方法可以根据不同的研究目的选择不同的方法。

下面我将介绍几种常用的土壤DNA提取方法。

1. CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法是最经典的土壤DNA提取方法之一。

它的原理是利用CTAB与DNA形成离子对，离子对会与蛋白质、多糖等溶于水的杂质结合，然后通过离心去除杂质，最后用溶剂将DNA沉淀下来。

这种方法的优点是提取得到的DNA质量较高，适用于较小的土壤样本。

但是，它的缺点是操作步骤繁琐，耗时长。

2. 磁珠法：磁珠法是一种常用的高通量土壤DNA提取方法。

它利用表面带电的磁珠与DNA结合，通过磁场将DNA捕获在磁珠上，然后用洗涤缓冲液去除杂质，最后用洗脱缓冲液将DNA从磁珠上溶解下来。

这种方法的优点是操作简单、快速，适用于大规模样本处理。

然而，提取得到的DNA质量可能较低，因为磁珠结合的特异性可能不如其他方法。

3. 快速法：快速法是一种在提取过程中省去DNA纯化步骤的方法。

其中，一种常用的快速法是表面粘贴法。

该方法通过在提取缓冲液中添加琼脂糖，并将土壤样本与缓冲液充分混合，将DNA留在微粒的表面上，然后通过离心将DNA粘在微粒上，最后用洗涤缓冲液去除杂质。

快速法的优点是操作简单、快速，适用于大规模样本处理。

但是，提取得到的DNA可能带有较多的杂质，对后续分析可能产生影响。

除了上述介绍的几种常用的土壤DNA提取方法外，还有其他一些特殊情况下使用的方法。

例如，对于硅酸盐土壤样品，可以使用硅酸盐法提取DNA；对于高含沙量的土壤样品，可以使用聚乙二醇（PEG）沉淀法提取DNA。

这些方法在不同的研究条件和样品类型下都有着特定的优势。

一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取方法

一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤DNA提取方法

江西农业学报2010，22(10)：1～5A ct a A gf i cuhur ae J i an gxi一种用于评价植物根系微生物群落多样性的土壤D N A提取方法王金斌1’2，赵凯1’。

，谭芙蓉1”，蒋玲曦1”，王利刚1，杨奇1，唐雪明1’2’(1上海市农业科学院生物技术研究所，上海201106；2．农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心，上海201106)摘要：建立了一种有效提取根际土壤微生物基因组D N A提取方法。

提取的基因组D N A能够有效进行根际土壤微生物分子生态学相关的分子操作。

该方法提取了12份不同作物根系土样的基因组D N A，每克土样都能够获得l O峭以上的基因组D N A，片段大小在20l【b左右。

A瑚／如。

平均值为1．505，A抛／A珈平均值为1．780，全波长吸收曲线与纯核酸--i t。

PC R扩增，均能得到清晰的单一目标条带。

不同稀释浓度的基因组D N A污染物都能进行限制性酶切操作。

稀释100倍土样D N A I．,a／nbda D N A酶切效果和在dd H，0中酶切效果一致。

关键词：土壤D N A提取；D N A质量；PC R扩增；土壤微生物中图分类号：S154．3文献标识码：A文章编号：11301—8581(20l o)10—0001—05A D N AExt r a ct i on M e t hod U s ed f or Eva l ua t i on of D i ve r si t y of Soi lM i cr obi aI C om m uni t y ar ound Pl a nt R oot Sys t emW A N G Ji n—bi nl”，ZH A O K a i l”，TA N F u—ron91”，J1A N G Li ng—xi l”，W A N G Li—gang‘，Y A N G Q i l，TA N G X ue—m i ng‘，2’(1．B i ot ec hnol ogy R e sear c h I ns t i t ut e，Shanghai A cadem y of A gr i cul t ur M Sci ences，SI l all gh8i201106，C hi na；2．Su per vi si on，I n-s pect i on a nd T es t C en t er f or E n vi r o nm e nt al Saf et y of G M C r ops，M i m st r y of A gr i cul t u r e，Sh anghai201106，C hi m)A b st r act：I n t hi s s t u dy，al l eff ecti ve m e t ho d f or t he extr act ion of pl ant r hi zos pher e m i cr obi a l genonf i c D N A w a s est a bl i she d．H i gh —puri t y nucl ei c aci ds w i t}l cons i de r abl e yi el d f r om s oi l sa m pl e s coul d be use d t o st ud y t he m ol ecul ar ecol og y of soi l m i cr oor gani s m．G enom i c D N A s w e r e ext r act ed f r om12soi l sam pl es ar oun d t Il e ro o t syst em of dif f erent cr ops．M or e t han10l a g genom i c D N A cou l d be i s o l at ed f r o m l g soi l sa m pl e w i t h about20kb f r ag m ent l en gt h．T he aver ag e val u e of A瑚／A瑚w as1．505，w hi l e t hat of A狮／A抛W as 1．780．r nl e abs or pt i on cur ve w i t h i n ful l w av el eng t h of D N A ext r act ed f r om s oi l s am pl es惴cons is tent w i t h t ha t of pu r e nucl ei c aci d．Si ngl e am pl i f i cat i on pr od uct s w er e obse r ved i n PC R a ssa ys．D N A s f r o m dif f erent pol lut ant di lut i o ns w e r e appl i cabl e f or t he r es t ri c ti onenzyl n e di ges t i on ana l ysi s．T he I zar d xl a D N A i n100一f ol d di l ut ed soi l sa m p l es had t he s锄e r es t ri c ti on el坦yl l l edi ges t i on r esul t s asi nddH20．K e y w or ds：D N A extr act ion f r om s oi l s am pl e s；D N A qua l i t y；P CR am pl i f i cat i on；Soi l m i cr o or gan i sm土壤微生物是土壤生物中的一个重要类群，是气候和土壤环境条件变化的敏感指标，土壤微生物群落结构和多样性及其变化在一定程度上反映了土壤的质量…。

一种高效提取土壤微生物DNA的方法[发明专利]

一种高效提取土壤微生物DNA的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011618913.1(22)申请日 2020.12.31(66)本国优先权数据202010628512.8 2020.07.02 CN(71)申请人 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司地址 201109 上海市闵行区剑川路468号(72)发明人 崔大祥　李雪玲　王亚迪　曹长风　田静　梁辉　金彩虹　(74)专利代理机构 上海东亚专利商标代理有限公司 31208代理人 董梅(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种高效提取土壤微生物DNA的方法(57)摘要本发明公开了一种高效提取土壤微生物DNA的方法。

结合玻璃珠和蛋白酶K、溶菌酶溶液能够促使微生物与土壤颗粒充分分开并释放DNA；此外，磁珠法配合洗涤缓冲液的使用可降低有机质的干扰，可以大幅度提高DNA提取质量。

本发明方法可广泛适用于水塘底泥、植物根际土壤等土壤样品微生物DNA的提取。

权利要求书1页 说明书3页CN 112430594 A 2021.03.02C N 112430594A1.一种高效提取土壤微生物DNA的方法，其特征在于，结合玻璃珠和蛋白酶K、溶菌酶溶液促使微生物与土壤颗粒充分分开并释放DNA；此外，磁珠法配合洗涤缓冲液的使用降低有机质的干扰，以大幅提高DNA提取质量，包括以下步骤：（1）将适量土壤装入离心管中，加入1mLDNA提取缓冲液，混匀后加入100µL浓度为25mg/mL的蛋白酶K、200µL浓度为20mg/mL的溶菌酶和10mg玻璃珠，37℃温育20分钟，剧烈振荡2分钟，然后取上清到洁净的离心管中；（3）取20 μl充分混匀的磁珠混合液加到离心管中，充分混匀后将离心管置入磁力架中，待磁珠被吸到管壁，吸出所有液体弃去；（4）加500 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加500 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；加500 μl洗涤缓冲液到离心管，从磁性架子中取下离心管，混匀后再将离心管放回磁性架子中，然后吸出所有液体弃去；（5）加200 μl 0.1×TE缓冲液或灭菌去离子水到离心管，混匀，在45℃条件下保温3分钟后，转入冰浴1-3分钟，得到DNA溶液；（6）将离心管插入磁性架子中，小心地取出下面的DNA溶液到一个洁净的离心管，即得DNA。