(可修改)病毒的鸡胚培养法.ppt

是否有血丝？
一、原理
鸡胚为活的动物机体，组织分化程度低，病毒易 于增殖，可选择不同的日龄和接种途径，感染病毒的 组织和液体中含大量病毒。
二、实验目的
了解鸡胚的基本结构与功能，掌握常用的鸡胚 接种方法。
三、鸡胚的结构与功能
➢卵壳 ➢壳膜 ➢气室 ➢绒毛尿囊膜
➢尿囊腔 ➢羊膜与羊膜腔 ➢卵黄 ➢卵白
五、受精卵的选择
➢最好是来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响 ➢受精卵的壳最好是白色的 ➢受精卵必须新鲜，保存在5-20℃不要超过10天，
保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。
六、孵育
➢温度：37.5-38.5℃ ➢相对湿度：50%-60% ➢新鲜空气流通，特别是在孵化5-6天以后 ➢翻卵：从孵育后第3天开始，每天翻卵一次。
十一、NDV接种鸡胚后对鸡胚的影响
NDV以尿囊腔接种于9-10日龄鸡胚，强毒株 在30-60h死亡，弱毒株3-6d死亡。死亡的鸡胚 以尿囊液含毒量最高，胚胎全身出血，以头部、 足趾、翅膀出血尤为明显。
十二、收毒
收毒前将鸡胚直立放置于4℃冰箱半小时以上，冻死 胚胎，防止出血。
根据接种途径的不同，收获相应的材料 1. 绒毛尿囊膜接种 收获接种部位绒毛尿囊膜 2. 尿囊腔接种 收获尿囊液（5-8ml） 3. 卵黄囊接种 收获卵黄囊或胚体 4. 羊膜腔接种 收获羊水（0.5-1ml）
• 实验结果观察：周四下午3:50 • 走之前签到，不能代签 • 实验报告选择思考题中3题作答
6.用1ml注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上。
7.用透明胶纸封住卵窗，或用玻璃纸盖于卵窗中， 周围涂上熔化的石蜡密封，气室中央的小孔用 石蜡密封。
8.胚横卧于卵箱中，不许翻动，保持卵窗向上。
（三） 尿囊腔接种 主要用于正粘病毒和副粘病毒，如流感病

篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
接种步骤与方法
取9~11日龄的鸡胚，标记气室与胚胎位置，并在胚胎面 与气室交界之边缘上约1mm处避开血管作一标记，此即为 注射点。
将鸡胚竖放在卵杯上，钝端向上。消毒气室的蛋壳，用 开孔器钻开一长约2mm小口。
第三节 鸡胚接种途径及方法
（一）羊膜腔接种
应用于从临床材料中分离流感病毒等，病 毒感染后可收集羊水和尿囊液。
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接种步骤与方法
将10~12日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。 消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约10mm×6mm的长方
接种步骤与方法
取5～8日龄鸡胚，标记气室和胚胎位置，垂直放置在卵 架上，钝端朝上，消毒气室端。
用开孔器在气室中央的卵壳上钻一小孔，用带有6号针头 的1m1注射器将样品从小孔处沿胚的纵轴迅速刺入约3cm， 注入0.2～0.5ml待接种的病毒于卵黄囊内，随后用胶带 或溶化的石蜡封孔。
置孵化箱内继续孵育3～8d，时间长短应根据病毒或立克 次体的种类而定，每天翻卵2次，弃掉24h内死亡的鸡胚 (但东方型和西方型马脑炎可能在接种后15～24h内死亡)。
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（四）卵黄囊接种
主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体 等的分离和繁殖。这些大的病原体主要 在卵黄囊的内皮细胞生长，且生长速度 很快，立克次体染色后也可看到。

一般按维持液的1％～10％(V／V)量接入。 接种量小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价； 接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。 (5) 病毒接种方法：异步接毒和同步接毒。
6. 病毒增殖指标与收获
细胞病变(CPE)：
(2) 真菌①污染细：念胞珠菌圆或酵缩母菌，。 如痘病毒和呼肠孤病毒等；
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性 • 原代细胞(primary cell) • 细胞株(cell strain) • 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)
（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
•中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯－丙烯复合物或多聚碳酸硅 等材料制成，外径50~100µm，壁厚25~75µm，壁呈海绵状， 上面有很多微孔。
•中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质 和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有 滞留作用。
•培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高 度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度 可达60％～90％；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。

• 尿囊腔接种： • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种： • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种： • 羊膜腔接种 • 静脉接种
④ 鸡胚接种的方法：
实验九 新城疫病毒的鸡胚培养 与病毒滴度检测
一、目的要求
1. 掌握鸡胚接种的常规方法；背景知识介绍
1. 病毒的鸡胚培养
① 鸡胚是正在发育的活体：
• 组织分化程度低； • 细胞代谢旺盛； • 适于许多病毒的生长增殖，
尤其是禽类病毒。
④ 鸡胚接种的方法：
5. 封孔
• 用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。
6. 孵育与观察
• 气室朝上于37℃温箱中孵育； • 以后每天检卵1~2次。 • 弃去24h内的死亡鸡胚：
– 机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。
7. 病毒的收获与鸡胚的观察
① 收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血; ② 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面； ③ 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜；
四、实验内容
以尿囊腔接种为例，介绍新城疫病毒的接种方法： 1. 照胚：
取9~12日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置， 标出气室底边，在无大血管处标出尿囊腔注射部位。
4. 注入病毒材料
• 用1mL注射器抽取接种物； • 针头垂直刺入注射部位1-1.2cm即达尿囊腔内； • 注入待接种的新城疫病毒：接种量为0.1~0.2mL。
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种： • 静脉接种
2. 新城疫病毒