辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析

第40卷 第6期海 洋 学 报V o l .40,N o .62018年6月H a i y a n g Xu e b a o J u n e 2018张慧珍,常永凯,陈泉睿,等.辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析[J ].海洋学报,2018,40(6):113 130,d o i :10.3969/j.i s s n .0253-4193.2018.06.011Z h a n g H u i z h e n ,C h a n g Y o n g k a i ,C h e nQ u a n r u i ,e t a l .C o m m u n i t y s t r u c t u r e a n a l ys i s o f a r c h a e a a n d b a c t e r i a i n s e d i m e n t s o f L i a o h e E s -t u a r y [J ].H a i y a n g X u e b a o ,2018,40(6):113 130,d o i :10.3969/j.i s s n .0253-4193.2018.06.011辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析张慧珍1,2,常永凯1,2,陈泉睿1,2,明红霞2,苏洁2,石岩2,殷旭旺1,樊景凤2*(1.大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连116023;2.国家海洋环境监测中心国家海洋局近岸海域生态环境重点实验室,辽宁大连116023)收稿日期:2017-07-29;修订日期:2017-11-21㊂基金项目:国家重点研发计划 海洋环境安全保障 重点专项(2017Y F C 1404500);全球变化与海气相互作用专项(G A S I -03-01-02-05);国家自然科学基金资助项目(41676115);国家重点研发计划 全球变化及应对专项 (2016Y F A 0601401)㊂作者简介:张慧珍(1992 ),女,山西省忻州市人,主要从事微生物生态研究㊂E -m a i l :965371152@q q .c o m 通信作者:樊景凤(1972 ),女,研究员,主要从事海洋生态学研究㊂E -m a i l :j f f a n @n m e m c .o r g.c n 摘要:本研究旨在了解辽河口表层沉积物中古菌和细菌的群落结构组成㊁多样性及其与环境因子之间的相关性㊂采用构建古菌和细菌16S r R N A 基因文库的方法,应用I l l u m i n aM i s e q 测序技术进行序列分析㊂结果表明:辽河口表层沉积物中细菌多样性高于古菌多样性,近岸细菌和古菌多样性高于远岸,即河相区(0.8~7.04)细菌多样性高于混合区(13.1~20.7)和海相区(24.2~31.5);主要古菌群落为奇古菌门(T h a u m a r c h a e o t a ,72.73%)和广古菌门(E u r ya r c h a e o t a ,25.05%),其中泉古菌门(C r e n a r -c h a e o t a ,0.001%)只在河相区站位被发现;细菌群落组成中变形菌门(P r o t e ob ac t e r i a ,61.94%)为该河口的优势菌群,其次为拟杆菌门(B a c t e r o i d e t e s ,11.21%)和酸杆菌门(A c i d o b a c t e r i a ,5.59%),其他门类如蓝藻门(C y a n o b a c t e r i a ,3.03%)等比例较小㊂与环境因子的冗余度分析表明:影响表层沉积物中古菌群落分布的主要环境因子依次为氨盐㊁泥㊁酸碱度㊁盐度㊁电导率和砂,而细菌群落的分布主要受到溶氧㊁泥㊁砂㊁黏土和总磷的影响㊂由此可见,不同环境条件下微生物的群落结构存在空间异质性,不同微生物对同一环境条件的响应亦不同㊂关键词:辽河口;表层沉积物;古菌;细菌;16S r R N A 基因;I l l u m i n aM i s e q中图分类号:P 736.21文献标志码:A文章编号:0253-4193(2018)06-0113-181 引言辽河流经河北㊁内蒙古㊁吉林㊁辽宁4省,全长1345k m ,注入渤海,是中国七大河流之一,其流域总面积为21.9万k m 2,流域地势大体是自北向南㊁自东西两侧向中间倾斜,中下游形成辽河平原㊂河口是陆地到海洋的过渡地带,承载着陆地排水系统带来的高浓度营养盐和有机质,是一个多功能的复杂生态系统[1];同时由于剧烈的环境梯度变化,河口为淡水和海洋来源的微生物提供了特殊的生境[2]㊂辽河口水域氮㊁磷的浓度都比较高;氮存在的主要形式,顺序依次是硝酸盐㊁溶解有机氮㊁颗粒态氮㊁亚硝酸盐及氨氮;磷存在的主要形式,顺序依次是磷酸盐㊁颗粒态磷㊁溶解有机磷,且三者含量相差不大;与‘海水水质标准“(G B3097 1997)相比,所测辽河口海域磷酸盐均属于或劣于四类海水水质的海域,无机氮也劣于四类海水水质,属于严重污染海域[3]㊂在此背景下,研究辽河口环境中微生物的结构和功能特征显得尤为重要㊂目前国内外学者已有大量关于河口微生物群落组成的研究,包括阿拉伯海的科钦河口[4]㊁维斯瓦河口[5]和尼日利亚拉各斯潟湖[6]㊁莱州湾及烟台河口[7]㊁九龙江河口[8]㊁珠江口[9]㊁黄河口[10]等㊂河口微生物,不仅是生物地球化学循环中各种生源要素的执行者[11],而且在河口生态系统的物质交换和能量流动中扮演着至关重要的角色㊂不同环境条件下微生物的群落结构存在空间异质性,也就是说,微生物的群落结构对不同生态环境是敏感的[12]㊂S w a n 等[13]研究了在加利福尼亚盐湖,不同深度的沉积物中古菌和细菌群落对环境梯度的不同响应,结果表明:盐度对细菌群落结构存在显著影响,古细菌群落结构则与总碳含量呈弱相关㊂基于以上阐述,本研究以辽河口及近岸海域为研究对象,采用16S r R N A 基因I l l u m i n aM i s e q 测序技术,聚焦于辽河口表层沉积物中古菌和细菌的多样性㊁群落分布特征及其与周围环境因子的相关性,有助于了解古菌和细菌对河口生态环境的作用机制及群落结构变化对河口水质污染的响应[14],可以更加实时有效地认识河口环境污染问题㊂2 材料和方法2.1 样品采集于2016年7月在辽河口近岸海域进行表层沉积物和底层水样品采集㊂根据辽河口的水文特征及相关地理信息,依盐度变化特征共设置13个采样点(图1)㊂潮汐表显示,采样时间段为高潮期,河口受海水盐度影响较明显;盐度范围为0.8~31.5,1号站位水深为14m ,剩余站位之间水深相差不大㊂各站位的底层水使用有机玻璃采水器采集,密封于无菌塑料瓶中;各站位的表层沉积物(0~5c m )使用抓斗采泥器采集,采样面积为0.1m2,同一个站位分别抓取3斗泥,混匀均质化密封于无菌塑料袋中,置于冰上24h 内运回实验室,其中一部分沉积物样用于环境参数的测定,分装保存在4ħ条件下,其余样品保存在-20ħ条件下,用于微生物群落结构分析㊂图1 采样站位图F i g .1 D i s t r i b u t i o n o f s a m p l i n g st a t i o n s 2.2 环境参数测定底层水的温度(T e m p )㊁盐度(S a l i n i t y )㊁酸碱度(pH )㊁电导率(C o n d )通过美国Y S I 556M P S 便携式多参数水质测量仪现场测定;溶氧(D O )采用碘量法测定,氨盐((N H +4)㊁亚硝酸盐(N O -2)㊁硝酸盐(N O -3)和磷酸盐(P O 3-4)分别采用次溴酸盐氧化法㊁萘乙二411海洋学报 40卷胺分光光度法㊁锌-镉还原法和磷钼蓝分光光度法测定(G B17378.4-2007)㊂沉积物的总有机碳(T O C)㊁总磷(T P)和总氮(T N)分别用重铬酸钾氧化-还原容量法㊁分光光度法和凯式滴定法测定;粒度(G r a i n s i z e)采用激光粒度分析仪进行测定(G B17378.5-2007)㊂2.3D N A提取、16S r R N A基因文库构建及I l l u m i n aM i s e q测序使用D N A P o w e r S o i l T o t a lD N AI s o l a t i o nK i t 提取试剂盒(M OB I O,U S A)从0.25g表层沉积物中提取基因组D N A,采用1.5%(质量体积比)的琼脂糖进行凝胶电泳㊂每个样品的D N A提取做3个平行,混匀均质化后分装保存㊂以基因组D N A为模板,采用巢式P C R扩增的方法构建16S r R N A基因文库㊂古菌16S r R N A 基因的扩增引物为519F(5 -C A G C C G C C G C G G-T A A-3 )和915R(5 -G T G C T C C C C C G C C A A T-T C C T-3 )[15],细菌16Sr R N A V3-V4区基因的扩增引物为338F(5 -A C T C C T A C G G R A G G C A G-C A G-3 )和806R(5 -G G A C T A C H V G G G T-WT C T A A T-3 )[16]㊂第一次P C R扩增体系为:5ˑB u f f e r10μL,d N T P(10mm o l/L)1μL,P h u s i o n 超保真D N A聚合酶1U,F/R内侧引物(10μm o l/ L)各1μL,D N A模板5~50n g,加d d H2O至50μL㊂第二次P C R扩增体系为:5ˑB u f f e r8μL, d N T P(10mm o l/L)1μL,P h u s i o n超保真D N A聚合酶0.8U,F/R外侧引物(10μm o l/L)各1μL, D N A模板5μL,加d d H2O至40μL㊂P C R扩增反应条件:94ħ预变性2m i n;94ħ变性30s,56ħ退火30s,72ħ延伸30s,循环25~30次;72ħ延伸5m i n;10ħ保温;第二轮扩增循环数为8次㊂P C R 产物用凝胶回收试剂盒(A x y P r e p D N A,A X Y G E N 公司)回收纯化,等量混合均匀后,再经定量质控,运用I l l u m i n aM i s e q平台进行双末端300b p测序㊂2.4数据统计分析M i s e q测序得到的P E r e a d s首先根据b a r c o d e区分每个样本,而后采用T r i m m o m a t i c和F L A S H软件对序列质量进行质控和过滤,再根据o v e r l a p关系进行拼接,拼接后的序列再次进行质控和过滤,最后得到优化序列㊂古菌16S r R N A基因共得到384636条优化序列,细菌16S r R N A基因共得到255695条优化序列㊂将经过上述处理的优化序列使用M o t h u r和U S E A R C H在97%相似度下聚类为操作分类单元(O p e r a t i o n a lT a x o n o m i c U n i t s,O T U),然后通过对O T U注释完成物种分类㊂基于O T U和物种注释结果进行样品物种复杂度分析及组间物种差异分析,最后通过M o t h u r计算样品的A l p h a多样性值,并用R 语言(V3.0.3)做出相应的稀释性曲线图㊂环境中理化因子与各样品的R D A分析用S P S S17.0和C A N O C O5.0完成㊂2.5基因序列登录号古菌和细菌的测序原始序列已经上传至N C B I 数据库,基因序列登录号分别为S R P105753和S R P105749㊂3结果3.1环境因子的理化特征本研究从1~13号站位依据盐度梯度进行站位布设,将这13个站位分为A㊁B㊁C3组,分别命名为海相区(24.2~31.5,1~5号站位,即A1㊁A2㊁A3㊁A4和A5站位)㊁混合区(13.1~20.7,6~9号站位,即B1㊁B2㊁B3和B4站位)㊁河相区(0.8~7,10~13号站位,即C1㊁C2㊁C3和C4站位)㊂环境因子的理化参数如表1所示㊂底层水的温度相对恒定(26~27ħ),溶氧量在近岸站位较低,远岸站位相对较高;水体偏碱性(p H7.54~8.00);盐度在A1站位最高,在河口近岸的C4站位最低㊂从A1~C4站位,电导率整体呈逐渐降低的趋势;N H+4浓度逐渐增大;N O-2浓度先降低后升高;N O-3浓度在A1处有最小值(0.8μm o l/L),C2处有最大值(22.06μm o l/L);P O3-4浓度在A4处有最小值(0.01μm o l/L),C2处有最大值(0.4μm o l/L),整体呈由近岸向远岸逐渐增大的趋势㊂辽河口大多数采样点表层沉积物主要由泥和黏土组成,含少量的砂,而A5和C4站位的沉积物主要由砂组成,泥和黏土的含量很少㊂沉积物的T O C浓度在海相区(M e a n=0.50%)高于河相区(M e a n=0.37%);沉积物中T P浓度范围为9.3~185μg/g,具有高度的空间异质性;T N浓度在混合区(76.5~298μg/g)要高于河相区(30.1~90.5μg/g)和海相区(34.7~ 65.3μg/g)㊂5116期张慧珍等:辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析表1 环境因子的理化参数T a b .1 P h y s i c a l a n d c h e m i c a l pa r a m e t e r s o f e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s 站位水深/m 温度/ħ盐度电导率/m S ㊃c m -1pH D O/m g㊃L -1N H +4/μm o l ㊃L -1N O -2/μm o l ㊃L -1N O -3/μm o l ㊃L -1P O 3-4/μm o l ㊃L -1T O C */%T P */μg ㊃g -1T N */μg ㊃g -1黏土/%泥/%砂/%1(A 1)1426.231.547.38.006.31.080.240.800.110.82185.034.731.1858.4810.342(A 2)727.028.744.67.996.31.110.327.270.130.4357.240.223.5351.5524.923(A 3)5.526.927.743.27.986.41.180.398.950.180.5394.465.326.2461.3512.414(A 4)426.725.540.07.946.11.490.4812.320.010.5690.360.531.0160.138.855(A 5)426.424.238.17.926.12.090.7416.230.230.169.360.31.241.8796.896(B 1)426.519.631.57.866.35.890.3717.020.290.4997.1131.037.062.970.037(B 2)527.020.733.17.926.15.610.3515.270.200.799.6298.014.5756.6728.768(B 3)726.819.832.07.885.05.940.4015.950.280.6102.0136.021.4661.5716.979(B 4)626.513.121.87.723.39.500.6115.230.270.14117.076.512.659.5427.8710(C 1)425.97.0413.37.624.09.220.6018.630.340.34109.087.918.0166.9615.0411(C 2)426.05.479.77.573.114.281.0222.060.400.3447.838.34.6447.3647.9912(C 3)325.92.44.57.546.213.610.9421.980.310.4684.490.518.4753.8227.7113(C 4)325.70.815.87.546.911.830.935.080.230.3426.630.12.6712.4584.88注:表中标注有*的为表层沉积物的理化参数,未标注*的全为底层水的理化参数㊂611海洋学报 40卷3.2 古菌和细菌多样性分析基于O T U 的α多样性分析可知,古菌的丰富度和多样性明显低于细菌的丰富度和多样性(表2),这与稀释性曲线分析的结果一致(图2)㊂库容值(c o v -e r a ge )在97%~99%之间,表明超过97%的物种多样性存在于所有文库中㊂图2 多样品稀释性曲线F i g .2 M u l t y s a m pl e s r a r e f a c t i o n c u r v e s 古菌的O T U 为408~1243个,细菌的O T U 为946~1542个,其中海相区A 5站位O T U 数目最少,C h a o 和A C E 指数表明A 5样品的古菌丰富度最低;而河相区的C 2站位O T U 数目最多,说明其古菌丰富度最高;海相区A 5站位的多样性最小,而河相区C 4站位的多样性最大(表2)㊂与古菌相同的是:海相区A 5站位有最低的O T U 数目和细菌丰富度,而O T U 数目最多的是河相区C 1站位,其细菌丰富度最高;河相区C 3站位的细菌多样性最大,海相区依然有较低的细菌多样性㊂图3为3组样品α多样性指数的差异性比较,不论是古菌还是细菌,其C h a o 指数和S h a n n o n 指数都呈现出A<B <C 的趋势,且细菌中这种差异性远大于古菌㊂A 组的细菌丰富度与B 组有显著差异(P <0.05),与C 组存在极显著差异(P <0.01);B 组的细菌多样性与A 组㊁C 组均存在显著差异(P <0.05)㊂表2 O T U 划分和α多样性分析T a b .2 T h eO T Ud i v i s i o n a n d a l p h a d i v e r s i t y a n a l ys i s 样品I D 古菌细菌O T U 数目A C E 指数C h a o 指数S h a n n o n 指数S i m p s o n 指数库容值O T U 数目A C E 指数C h a o 指数S h a n n o n 指数S i m p s o n 指数库容值A 11091124712503.800.1660.9921261142814195.590.0210.987A 21032123712123.290.2250.9911291148514915.680.0230.984A 31099134013332.620.3720.9911254140314075.660.0210.985A 41057130112942.610.3900.9901315149615185.650.0250.984A 54084254391.930.4230.998946118412275.350.0180.984B 11013124612292.500.3880.9911379149815335.670.0230.991B 21134134913453.280.2550.9891242149415155.570.0190.978B 3952113711172.500.3980.9911472164016235.790.0230.9867116期 张慧珍等:辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析续表2样品I D 古菌细菌O T U 数目A C E 指数C h a o 指数S h a n n o n 指数S i m p s o n 指数库容值O T U 数目A C E 指数C h a o 指数S h a n n o n 指数S i m p s o n 指数库容值B 4991122511834.070.1260.9831386159516275.490.0190.988C 11048118711672.820.3580.9921542168116885.890.0200.990C 21243144914483.320.2680.9891515162416326.050.0130.990C 31064132112982.620.3990.9891509163516546.090.0120.990C 41077120112334.180.1110.9931365158416035.750.0210.984注:C h a o 指数和A C E 指数反映样品的丰富度,而S h a n n o n 指数以及S i m ps o n 指数反映样品的多样性㊂图3 3组样品α多样性指数的差异性分析F i g .3 T h e d i f f e r e n c e a n a l y s i s o f αd i v e r s i t y i n d e x o f t h r e e g r o u p s s a m pl e s P 值通过*来展示,0.01<P <0.05显著性差异标记为*;P <0.01差异极显著标记为**P v a l u e sw e r e s h o w nb y * ,s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c em a r k e d a s * (0.01<P <0.05);e x t r e m e l y s i gn i f i c a n tm a r k e d a s ** (P <0.01)811海洋学报 40卷韦恩图(V e n n)展示了不同沉积物样品的共有O T U 和特有O T U 数目,可以比较直观地表现环境样品中O T U 数目组成相似性及重叠情况㊂图4显示:3组样品中古菌有1206个O T U 重叠,A ㊁B ㊁C 样品特有的O T U 数目分别为184㊁36㊁278,C 组样品特有O T U 数目最多;3组样品中细菌有1526个O T U 重叠,C 组样品特有49个O T U ,为3组样品中特有O T U 数目最多的一组㊂由此可见,C 组样品特有O U T 数目最多,表明河相区具有较多的特有微生物物种㊂图4 O T U 分布韦恩图F i g .4 T h eV e n nd i a gr a mo fO T Ud i s t r i b u t i o n 3.3 古菌和细菌的群落结构组成分析3.3.1 古菌的群落结构分析本研究中古菌16S r R N A 基因的高通量测序共获得3个门㊁5个纲㊁6个目㊁8个科㊁24个属和30个种㊂在分类单位门水平上(图5),该河口沉积物中的优势菌群为奇古菌门(T h a u m a r c h a e o t a ,72.73%),其次为广古菌门(E u r ya r c h a e o t a ,25.05%);泉古菌门(C r e n a r c h a e o t a ,0.001%)只在河相区的C 2㊁C 3站位被发现(由于该门类占比极少,故而又以对数形式展现);还有一些未被确定分类地位的菌群占到2.019%㊂奇古菌门在A 5站位(85.59%)所占的丰度比例高于其他任何站位,在B 4站位(52.81%)所占的比例最小㊂以纲为分类单位分析3组沉积物样的古菌群落结构,结果显示:组成广古菌门的4个纲中,噬盐菌纲(H a l ob ac t e r i a ,19.86%)是广古菌门丰度最大的类群,热原体纲(T h e r m o p l a s m a t a )的丰度占比为4.66%,也相对较高,而甲烷微菌纲(M e t h a n o m i c r o -b i a ,0.18%)和甲烷杆菌纲(M e t h a n o b a c t e r i a ,0.01%)的丰度则较低;另外,泉古菌门的热变形菌纲(T h e r -m o pr o t e i )只出现在河相区的C 2和C 3站位,其丰度比例只有0.001%㊂进一步对辽河口沉积物中的主要古菌群落进行属水平上的分布特征分析(图6),奇古菌门的C a n d i -d a t u sN i t r o s o pu m i l u s (7.67%)丰度最高,丰度较低的属有奇古菌门的C a n d i d a t u s N i t r o s o s p h a e r a (0.09%)㊁广古菌门的H a l o gr a n u m (0.06%)和M e t h a n o c o c c o i d e s (0.04%),此外还有一些低丰度的菌属,如奇古菌门的C e n a r c h a e u m ㊁广古菌门的M e t h a -n o s p i r i l 等(相对丰度小于0.03%)和十分丰富的未分类属(91.91%)㊂3.3.2 细菌的群落结构分析细菌16S r R N AV 3-V 4区基因的高通量测序共获得32个门㊁31个纲㊁54个目㊁91个科㊁144个属和87个种㊂在分类单位门水平上(图5),变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a ,61.94%)为该河口细菌群落的优势菌群,其次为拟杆菌门(B a c t e r o i d e t e s ,11.21%)和酸杆菌门(A c i d o b a c t e r i a ,5.59%),最后是蓝藻门(C y a -n o b a c t e r i a ,3.03%)㊁绿弯菌门(C h l o r o f l e x i ,3.78%)和放线菌门(A c t i n o b a c t e r i a ,3.45%);其他门类如芽单胞菌门(G e m m a t i m o n a d e t e s )㊁硝化螺旋菌门(N i t r o -s pi r a e )㊁疣微菌门(V e r r u c o m i c r o b i a )等共占比10.39%;还有一些未分类的菌群占比0.61%㊂在纲水平上,γ-变形菌纲(G a m m a p r o t e o b a c t e r i a ,36.43%)是变形菌门丰度最大的菌群,除此之外δ-变形菌纲(D e l t a pr o t e o b a c t e r i a ,14.93%)的丰度占比也较高,而α-变形菌纲(A l p h a p r o t e o b a c t e r i a ,6.57%)㊁β-变形菌9116期 张慧珍等:辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析图5古菌和细菌在门水平上的群落组成F i g.5 C o m m u n i t y c o m p o s i t i o n o f a r c h a e a l a n db a c t e r i a o n t h e p h y l u ml e v e l纲(B e t a p r o t e o b a c t e r i a,2.57%)和ε-变形菌纲(E p s i-l o n p r o t e o b a c t e r i a,0.3%)的丰度较低㊂组成拟杆菌门的菌群有4个纲,丰度比例较高的是黄杆菌纲(F l a-v o b a c t e r i i a,6.08%),其次为鞘氨醇杆菌纲(S p h i n g o b-021海洋学报40卷图6古菌和细菌在属水平上的群落组成F i g.6 C o m m u n i t y c o m p o s i t i o n o f a r c h a e a a n db a c t e r i a l o n t h e g e n u s l e v e l 1216期张慧珍等:辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析a c t e r i i a,2.34%)㊁噬纤维菌纲(C y t o p h a g i a,1.79%)和类杆菌纲(B a c t e r o i d i a,0.16%)㊂此外还有一些其他菌群,如芽单胞菌纲(G e m m a t i m o n a d e t e s),其丰度比例为2.97%;全噬菌纲(H o l o p h a g a e,2.68%)和酸杆菌纲(A c i d ob ac t e r i a,1.62%)㊁硝化螺旋菌纲(N i t r o s p i-r a,1.68%)㊁疣微菌纲(V e r r u c o m i c r o b i a e,1.03%)等为丰度极低的类群㊂以属为分类单位分析3组沉积物样的细菌群落结构如图6所示㊂其中相对丰度大于1%的有2个属,包括γ-变形菌纲的M a r i n i c e l l a(3.7%)㊁脱硫杆菌科的D e s u l f o b u l b u s(2.81%);大于0.5%的有8个属,包括疣微菌科的P e r s i c i r h a b d u s(0.81%),γ-变形菌纲的H a l i e a(0.79%),黄杆菌科的M a r i t i m i m o n a s (0.76%)㊁R o b i g i n i t a l e a(0.74%)和L u t i b a c t e r (0.5%),红硫菌科的N i t r o s o c o c c u s(0.66%),亚硝化单胞菌科的N i t r o s o m o n a s(0.52%),硝化螺旋菌科的N i t r o s p i r a(0.5%)㊂此外还有一些丰度极低的菌属,如γ-变形菌纲的H a l i o g l o b u s(0.49%),红杆菌科的L o k t a n e l l a(0.39%)和R o s e o v a r i u s(0.32%),黄杆菌科的U l v i b a c t e r(0.45%)㊁M a r i b a c t e r(0.38%)和W i n o g r a d s k y e l l a(0.27%),海洋螺菌科的P s e u d o s p i-r i l l u m(0.37%),红环菌科的A z o s p i r a(0.31%)等共134个属;未知菌属的丰度占比为77.36%㊂也由此可见,随着生物学分类地位的逐步深入,更多未被确定分类地位的微生物类群出现,已有相关数据库中能进行分类比对的信息已经不能满足要求,需要挖掘大量有效资源,进行更深入的研究㊂3.4不同盐度梯度沉积物中微生物群落组成的差异性沿辽河口的盐度梯度揭示了古菌㊁细菌群落的地理分布特征㊂两个排序轴分别解释了古菌和细菌群落变异的52.30%㊁67.33%㊂P C1和P C2表明,微生物群落沿盐度梯度聚为3类㊂站位A1~A4聚为一类,是海水微生物类群;站位C1~C4为明显的淡水微生物类群;在淡水和海水的混合区域是B2~B4站位㊂U i n f r a c P C o A距离矩阵的分析进一步证实了古菌㊁细菌群落组成具有明显的空间异质性(图7)㊂图7基于16S r R N A基因的U n i f r a cP C o A分析F i g.7 T h eU n i f r a c u n w e i g h t e dP C o Aa n a l y s i s b a s e d o n t h e16S r R N A g e n e s e q u e n c e s为了详细说明3组不同盐度梯度的样品之间群落组成的差异,根据从门到种的分类级别对细菌和古菌数据进行了L E f S e分析(图8)㊂古菌群落中,C a n-d i d a t u s_N i t r o s o p u m i l u s属(L D A S C O R E=3.33)是A组起到重要作用的古菌类群;B组中噬盐菌纲(L D AS C O R E=3.79)及噬盐菌目㊁种水平的u n c u l-t u r e d_b a c t e r i u m起到重要作用;C组中起到重要作用的类群最多,甲烷微菌纲(包括甲烷微菌科及其所属的属㊁种)㊁盐细菌科(L D AS C O R E=2.26)㊁C a n d i d a-t u s_I a i n a r c h a e u m属(L D A S C O R E=2.65)㊁u n c u l-t u r e d_a r c h a e o n_W C H D3_30种(L D AS C O R E=2.01)为丰度较大的类群㊂细菌群落中,A组门水平的N i-t r o p i r a e(L D AS C O R E=2.40)(包括所属的硝化螺旋菌纲㊁N i t r o p i r a l e s目和N i t r o p i r a c e a e科)㊁红螺菌目(L D AS C O R E=2.65)(包括红螺菌科)㊁互营杆菌目(包括互营杆菌科)为主要细菌类群,对海相区的细菌群落结构起到重要作用㊂B组的疣微菌门(包括纲疣微菌纲㊁疣微菌目㊁疣微菌科)㊁蓝藻门(L D AS C O R E 221海洋学报40卷6期张慧珍等:辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析321图8基于L E f S e分析的分类进化分支图和柱状丰度图F i g.8 T a x o n o m i cc l a d o g r a ma n dh i s t o g r a mo f t h eL D As c o r e s b a s e d o nL E f S e a n a l y s i s由内至外辐射的圆圈图为聚类树,依次代表了由门㊁纲㊁目㊁科㊁属㊁(或种)的分类级别㊂在不同圆圈层上的每1个小圆圈代表该水平下的1个分类,小圆圈的直径与该分类的相对丰度大小呈正比㊂红色㊁绿色和蓝色区域表示不同分组,树枝中红色节点表示在A组中起到重要作用的微生物类群,绿色节点表示在B组中起到重要作用的微生物类群,蓝色节点表示在C组中起到重要作用的微生物类群,黄色节点表示的是在3组中均没有起到重要作用的微生物类群㊂图中英文字母表示的物种名称在右侧图例中进行展示㊂统计3个组中有显著作用的微生物类群通过L D A分析(线性回归分析)后获得的L D A分值C i r c l e s r a d i a t i n g f r o mt h e i n s i d e t o t h e o u t s i d e a r e c l u s t e r e d t r e e s,w h i c h i n t u r n r e p r e s e n t t h e c l a s s i f i c a t i o n l e v e l b y t h e p h y l u m,c l a s s, o r d e r,f a m i l y,g e n u s,(o r s p e c i e s).E a c h s m a l l c i r c l e o n a d i f f e r e n t c i r c l e r e p r e s e n t s a c a t e g o r y a t t h a t l e v e l,a n d t h e d i a m e t e r o f t h e c i r-c l e i s p r o p o r t i o n a l t o t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f t h a t c a t e g o r y.T h e r e d,g r e e n a n db l u e a r e a s r e p r e s e n t d i f f e r e n t g r o u p s.T h e r e d,g r e e n a n d b l u e n o d e s i n t h e b r a n c h r e p r e s e n t t h em i c r o-o r g a n i s m s t h a t p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d i f f e r e n t s u b-g r o u p sA,B a n dC,r e s p e c-t i v e l y,a n d t h e y e l l o wn o d e s r e p r e s e n t t h em i c r o-o r g a n i s m s t h a t d i d n o t p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n a l l t h r e e g r o u p s,T h e y e l l o wn o d e s r e-p r e s e n t t h em i c r o-o r g a n i s m g r o u p s t h a t d i d n o t p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i na l l t h r e e g r o u p s.T h e n a m e o f t h e s p e c i e s r e p r e s e n t e db y t h e E n g l i s h l e t t e r s i n t h e f i g u r e i s s h o w n i n t h e i l l u s t r a t i o n o n t h e r i g h t.LD As c o r e s o b t a i n e d a f t e r L D Aa n a l y s i s(l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s)w e r e s t a t i s t i c a l l y c a l c u l a t e d a m o n g t h e t h r e e g r o u p s o f s i g n i f i c a n tm i c r o o r g a n i s m s=3.06)(包括种水平的V i r g u l i n e l l a_f r a g i l l s)相对丰度较大,对混合区的细菌群落结构有重要作用㊂C 组门水平的C y a n o b a c t e r i a_C y a n o b a c t e r i a(L D A S C O R E=2.03)㊁β-变形菌纲(L D A S C O R E=3.30)421海洋学报40卷(包括目水平的伯克氏菌目㊁N i t r o s o m o n d a l e s ㊁R h o d o -c yl a l e s ㊁B d e l l o v i b r i o n a l e s 及科水平的伯克氏菌科㊁C o -m a m o n a d a c e a e ㊁披毛菌科㊁亚硝化单胞菌科㊁R h o d o c y -c l a c e a e )㊁放线菌纲(L D AS C O R E =2.15)及γ-变形菌纲的外硫红螺旋菌科(L D AS C O R E =2.81)是河相区细菌群落结构的重要菌群㊂3.5 各样品与环境因子的相关性分析运用C a n o c o 5.0软件对样品数据和环境数据进行冗余度分析,结果如图9所示㊂在R D A 排序图中得出环境因子与两个排序轴的相关系数,古菌与环境因子的相关性弱于细菌与环境因子的相关性;古菌中,与第一排序轴呈最大正相关的环境因子是N H +4,相关系数为0.3166,其次为T P ,相关系数为0.1793,而N O -3与第一排序轴呈最大负相关,相关系数为-0.363,其次是C l a y,相关系数为-0.319;与第二排序轴呈最大正相关的环境因子是C o n d,相关系数为0.5031,其次是S a n d ,相关系数为0.4893,而S i l t 与第二排序轴呈最大负相关,相关系数为-0.5664,其次是N H +4,相关系数为-0.4999㊂细菌中,与第一排序轴呈显著正相关(P <0.05)的环境因子是S a n d ,相关系数为0.5883,其次为D O ,相关系数为0.433,而S i l t 与第一排序轴呈显著负相关(P <0.05),相关系数为-0.615,其次是T P ,相关系数为-0.5055;与第二排序轴呈最大正相关的环境因子是T N ,相关系数为0.3748,其次是N O -3,相关系数为0.2503,而D O 与第二排序轴呈最大负相关,相关系数为-0.4662,其次是C l a y,相关系数为-0.4662㊂图9 样品与环境因子的冗余度(R D A )分析F i g .9 R e d u n d a n c y (R D A )a n a l y s i s o f s a m pl e s a n d e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s B W (B o t t o m W a t e r )表示底层水的环境因子,S S (S u r f a c e S e d i m e n t )表示表层沉积物的环境因子㊂箭头表示环境因子,箭头连线和排序轴的夹角代表某个环境因子与排序轴的相关性大小,夹角越小,相关性越高,反之越低㊂箭头连线的长度表示该环境因子与样本分布间相关程度的大小,连线越长,相关性越大,反之越小B Wr e p r e s e n t s t h e e n v i r o n m e n t a l f a c t o r o f t h e b o t t o m w a t e r ,a n d S S r e pr e s e n t s t h e e n v i r o n m e n t a l f a c t o r o f t h e s u r f a c e s e d i m e n t .A r r o w s i n d i c a t e e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s ,a n d t h e a n g l e b e t w e e n t h e c o n n e c t i n g a r r o w s o r d i n a t i o n a x e s r e p r e s e n t i n g am a g n i t u d e o f t h e e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s a s s o c i a t e dw i t h t h e s o r t i n g s h a f t s m a l l e r t h e a n g l e ,t h e h i g h e r t h e c o r r e l a t i o n ,w h e r e a s t h e l o w e r .T h e l e n gt h o f t h e a r r o wc o n n e c -t i o n i n d i c a t e s t h e d e g r e e o f c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e e n v i r o n m e n t a l f a c t o r a n d t h e s a m p l e d i s t r i b u t i o n .T h e l o n g e r t h e c o n n e c t i o n ,t h e g r e a t e r t h e c o r r e l a t i o n ,o t h e r w i s e t h e o p po s i t e 从图9中可以看出:对古菌样品影响较大的环境因子依次为N H +4㊁S i l t ㊁p H ㊁S a l i n i t y ㊁C o n d ㊁S a n d ;在二维排序图中左下方的样品之间距离较小,这说明它们(A 3㊁A 4㊁B 1㊁B 3㊁C 1㊁C 2㊁C 3)之间群落分布的差异程度较小,C 4与其他样品的相对距离较大,说明C 4与其他样品之间的群落分布有较大差异,环境因子S i l t㊁5216期 张慧珍等:辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析N H+4㊁C l a y㊁N O-3对古菌群落结构的影响较大㊂位于右上方的样品(A1㊁A2㊁B2)之间距离也较小,说明其群落分布的差异较小,主要受到环境因子S a n d的影响,而B4与其他样品距离较大,说明B4与其他样品之间的群落分布有较大差异㊂左上方的样品A5主要受到p H㊁S a l i n i t y㊁C o n d的影响,且与其他样品的差异程度显著㊂影响细菌群落结构较大的环境因子依次为D O㊁S i l t㊁S a n d㊁C l a y㊁T P;在二维排序图中第二排序轴右方的样品(A1㊁A2㊁A3㊁A4㊁C2㊁C3㊁C4,除A5和B2)之间距离较小,这说明它们之间群落分布的差异程度较小,主要受环境因子D O㊁S a n d影响㊂位于左下方的样品(B1㊁B3㊁C1)之间距离相对较大,说明其群落分布的差异较大,主要受环境因子C l a y影响㊂A5与其他样品的差异程度也较大,而B2和左上方的样品B4与其他样品的差异程度最为显著,其中B4受到S i l t㊁T P的影响较大㊂4讨论4.1古菌和细菌多样性为了阐明辽河口近岸微生物的群落分布和多样性,本文依照盐度梯度设置13个站位,采集表层沉积物样品,在未培养状态下,对所有样品采用I l l u m i n a M i s e q高通量测序技术,将测序结果进行分析比较㊂结果表明,每个站位样品的细菌丰富度和多样性高于古菌丰富度和多样性㊂与海相区和混合区相较,古菌和细菌的丰富度㊁多样性在河相区是最高的[17],G o l e-b i e w s k i等[5]在维斯瓦河口对细菌群落的研究也表明:与淡水和混合区相比,海水中的细菌丰富度相对较低;这可能与河口近岸剧烈变化的理化环境有关,近岸微生物为了适应多变的环境动态而产生更多更丰富的微生物类群来增加自身生存的可能性和适应性[18];而海相区和混合区的理化环境具有相对稳定性,可能已经形成了该区域内的优势菌群,因而微生物物种较少[19],丰富度和多样性较低㊂4.2古菌和细菌群落结构及优势菌群的生态功能分析沉积物-水体微环境是河口生态系统的重要组成部分,沉积物中的微生物在河口生态系统中发挥着重要的生态作用,不同微生物群落具有其独特的生态功能,构成了微生物功能的多样性[14]㊂本研究结果表明:在辽河口沉积物中古菌群落以奇古菌门(T h a u m a r c h a e o t a,72.73%)为优势菌群,其次为广古菌门(E u r y a r c h a e o t a,25.05%),这与W e b-s t e r[20]等的研究一致,大量的奇古菌门和广古菌门类群在黄河的沉积物中也被检测到[10];泉古菌门(C r e n-a r c h a e o t a,0.001%)是丰度占比最少的一类古菌门,这与一些学者[21]在滇池和洱海地区进行的研究结果一致,本研究只在河相区的C2㊁C3站位检测到泉古菌门,这说明了低盐环境可能更适合泉古菌门菌群的生存,而且河相区具有更高的古菌多样性㊂S w a n 等[13]对古菌16S r R N A基因序列进行探索,测序结果揭示了广古菌门和泉古菌门不同属的群落,并且多隶属于海洋沉积物群落组㊂属水平上大部分优势古菌都与氮和碳循环过程有关,如氨氧化㊁甲烷生成等㊂其中最丰富的C a n d i d a t u s_N i t r o s o p u m i l u s(占比7.67%)参与亚硝化过程[22];C a n d i d a t u s_N i-t r o s o s p h a e r a也有较高的丰度,占比0.09%,是参与氨氧化过程的一类古菌属[23-24];M e t h a n o s a r c i n a和M e t h a n o c o c c o i d e s的丰度占比分别为0.03%和0.04%,且它们都是专性厌氧产甲烷菌,这一结果与W e b s t e r等[20]的研究结果一致;嗜盐细菌能在极端的盐环境下生长和繁殖,特别是在天然地盐湖和太阳蒸发盐池中生存㊂细菌群落中变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a,61.94%)是表层沉积物中最大的一个门类,在本研究的13个站位中都占有很大比例(58.72%~63.49%),这一结果与很多学者[25-29]的研究报道一致;其中γ-变形菌纲(G a m m a p r o t e o b a c t e r i a,36.43%)是变形菌门丰度最高的类群,且在海相区(37.82%~41.47%)的丰度普遍大于混合区(32.13%~40.95%)和河相区(30.9%~37.13%)的丰度,这一结果与关晓燕等[1]的研究结果一致;δ-变形菌纲(D e l t a p r o t e o b a c t e r i a, 14.93%)和α-变形菌纲(A l p h a p r o t e o b a c t e r i a,6.57%)主要在混合区占有较大比例;β-变形菌纲(B e t a p r o-t e o b a c t e r i a,2.57%)大多生存在盐度较低的淡水环境中,属于典型的淡水微生物物种[1,17]㊂拟杆菌门(B a c t e r o i d e t e s,11.21%)和酸杆菌门(A c i d o b a c t e r i a,5.59%)也是丰度较大的菌群[26],拟杆菌门中的黄杆菌属(F l a v o b a c t e r i i a,6.08%)和噬纤维菌属(C y t o p h-a g i a,1.79%)是常见的湿地微生物,能够降解蛋白质㊁脂类㊁纤维素等大分子颗粒有机物,且具有一定的硝化作用[30]㊂蓝藻门(C y a n o b a c t e r i a,3.03%)是几乎在地球上每一个环境中都能发现的光合细菌,它们在海洋中非常丰富,是主要的生产者[31];在本研究中检测到了蓝藻门中的一些菌属,如微囊藻属(M i c r o c y s-t i s,0.03%)㊁浮颤藻属(P l a n k t o t h r i x,0.04%)和聚球621海洋学报40卷藻属(S y n e c h o c o c c u s ,0.01%),其丰度比例较低,微囊藻水华极其常见,是水体富营养化的标志㊂属水平上大部分优势菌群都与硫和氮循环过程有关,如脱硫㊁亚硝化㊁硝化等,其中D e s u l fo b u l b u s (2.81%)㊁D e s u l -f o s a r c i n a (0.04%)㊁D e s u l fo c o c c u s (0.02%)和D e s u l -fo b a c t e r (0.02%)均为硫酸盐还原菌[32];较丰富的N i t r o s o c o c c u s (占比0.66%)和N i t r o s o m o n a s (0.52%)是参与亚硝化过程[33]的一类细菌属;N i t r o s pi r a (0.5%)和N i t r o s pi n a (0.22%)也有较高的丰度,参与硝化过程;A z o s p i r a 是固氮螺菌属,其丰度占比为0.31%,参与固氮过程;此外还检测到一些丰度较低的条件致病菌属,如弧菌属(V i b r i o ,0.06%)㊁气单胞菌属[34](A e r o m o n a s ,0.03%)和玫瑰单胞菌属[35](R o -s e o m o n a s ,0.02%)㊂4.3 古菌和细菌群落与环境因子的关系在河口生态系统中,微生物群落分布与环境因子密切相关[20,36]㊂据报道底层水中发生的化学反应过程对表层沉积物的微生物群落具有很大的影响,而且底层水和沉积物之间经常发生物质交换[37-38],因此,本研究采用底层水和沉积物的一些理化参数作为环境因子㊂在本研究中,表层沉积物中微生物群落分布受盐度影响较大㊂细菌群落较多门类在混合区㊁河相区被发现,如A r m a t i m o n a d e t e s 在B 4㊁C 1㊁C 2㊁C 3和C 4站位均被检测到,S a c c h a r i b a c t e r i a 在B ㊁C 组均被发现;β-变形菌纲在C 3站位的丰度比值最大;而古菌在C 组样品也有最高多样性,这些都进一步说明河口近岸有更高的多样性,除盐度外,地理分布位置可能也是影响其分布的另外一个原因,有研究表明:河口近岸更加复杂的环境变化为近岸古菌多样性高于远岸提供了支撑[39]㊂微生物群落的分布不仅受盐度㊁地理位置的影响,同时也受到营养盐的影响,河口近岸营养盐浓度较高[40],对微生物生长产生重要影响㊂如本研究中的氨盐㊁亚硝酸盐㊁硝酸盐和磷酸盐浓度在辽河口近岸浓度最高,从而为环境中的微生物提供了生长条件;近岸较高的营养盐浓度同时为水生植物提供了生长条件,而植物的生长代谢消耗D O ,所以近岸比远岸有更低的溶氧量[18],为细菌生长提供了有力的条件㊂L i u 等[38]在中国陆缘海对表层沉积物的细菌群落结构研究中发现,D O 与细菌群落显著相关,这与本研究结果一致;在本研究中,细菌相对丰度高于古菌,这与其他沿海和深海表层沉积物相关研究结果一致[41-42],推测可能与底层水D O 有关㊂本研究表明,与细菌群落相比,古菌群落对N H +4浓度更敏感,不同站位之间古菌群落结构的相似性和差异性受到N H +4浓度的影响最大㊂由此可见,不同的环境因子对不同微生物影响差异较为明显,今后有望通过不同微生物群落结构的变化实现对环境污染的指示㊂5 结论(1)以16Sr R N A 为标记基因,采用I l l u m i n aM i s e q 高通量测序技术对不同盐度梯度的表层沉积物样品进行测序㊂C h a o ㊁A C E 指数及S h a n n o n ㊁S i m p-s o n 指数显示样品的细菌丰富度和多样性高于古菌丰富度和多样性,细菌和古菌在河相区丰富度和多样性高于海相区丰富度和多样性㊂(2)物种聚类结果显示,该河口的沉积物中细菌的丰度总体较高,但不同站位的微生物多样性存在一定差异㊂变形菌门为该河口3组样品共同的绝对优势菌群,其次为拟杆菌门和酸杆菌门,最后是蓝藻门㊂古菌优势菌群为奇古菌门,其次为广古菌门;此外还得到一些参与亚硝化过程㊁氨氧化过程的古菌属㊂(3)底层水和沉积物中不同环境因子对微生物群落的影响不同㊂古菌群落结构主要受到环境因子N H +4㊁p H ㊁盐度㊁电导率㊁泥质含量㊁砂质含量的影响,而细菌群落结构主要与环境因子D O ㊁T P㊁泥质含量㊁砂质含量㊁黏土含量等相关㊂参考文献:[1] 关晓燕,韩家波,王摆,等.辽东湾大凌河口湿地土壤微生物群落分析[J ].生态环境学报,2012,21(6):1063-1070.G u a nX i a o y a n ,H a n J i a b o ,W a n g B a i ,e t a l .A n a l y s i s o f b a c t e r i a l c o m m u n i t i e s i nL i a o d o n g B a y D a l i n g h e e s t u a r i n ew e t l a n d [J ].E c o l o g y a n dE n v i -r o n m e n t a l S c i e n c e s ,2012,21(6):1063-1070.[2] 阚金军,孙军.河口细菌群落多样性及其控制因素:以切萨皮克湾为例[J ].生物多样性,2011,19(6):770-778.K a n J i n j u n ,S u n J u n .B a c t e r i a l c o m m u n i t y b i o d i v e r s i t y i n e s t u a r i e s a n d i t s c o n t r o l l i n g f a c t o r s :a c a s e s t u d y i nC h e s a p e a k e B a y [J ].B i o d i v e r s i t y Sc i -e n c e ,2011,19(6):770-778.[3] 苏静,杨福霞,苏荣国,等.辽河口营养物基准值的制定方法[J ].中国海洋大学学报,2016,46(9):78-84.S u J i n g ,Y a n g F u x i a ,S uR o n g g u o ,e t a l .A p p r o a c h o f n u t r i e n t c r i t e r i a e s t a b l i s h m e n t a n d a p p l i c a t i o n i n t h e L i a o h e e s t u a r y[J ].P e r i o d i c a l o fO c e a n U n i v e r s i t y o f C h i n a ,2016,46(9):78-84.7216期 张慧珍等:辽河口沉积物中古菌和细菌群落结构分析。