doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.14.003重症甲型H1N1流感病毒感染诱导小鼠胸腺凋亡萎缩①王 阳 张须龙② 李枫棣③ 安云庆② 刘 波④ 曹 彬 (中日友好医院,北京100000) 中图分类号 R392 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2020)14⁃1676⁃04①本文受中国医学科学院医学与健康科技创新工程(CIFMS 2018⁃I2M⁃1⁃003)资助㊂②首都医科大学,北京100000㊂③中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,新发再发传染病动物模型研究北京市重点实验室,北京100000㊂④山东省淄博市临淄区人民医院临床微生物科,呼吸与危重症医学科,淄博市呼吸感染与临床微生物重点实验室,淄博255400㊂作者简介:王 阳,女,硕士,主要从事感染免疫方面的研究,E⁃mail:993850106@㊂通讯作者及指导教师:刘 波,男,博士,副主任医师,主要从事呼吸道感染疾病方面的研究,E⁃mail:42820159@㊂曹 彬,男,博士,主任医师,主要从事新发呼吸道传染病方面的研究,E⁃mail:caobin_ben@㊂[摘 要] 目的:探讨重症流感病毒感染介导的胸腺萎缩及其作用机制㊂方法:4~6周龄SPF 级BALB /c 小鼠滴鼻给予50μl TCID 50甲型H1N1流感病毒A /California /07/2009(1×106个/ml),构建重症流感病毒感染小鼠模型;检测各感染时间小鼠体质量㊁胸腺大小及重量;HE 染色检测胸腺组织病理变化;流式细胞术检测胸腺内不同发育阶段T 细胞数量及凋亡;原位TUNEL 法检测胸腺细胞凋亡;细胞凋亡相关基因芯片和荧光定量PCR 检测验证促凋亡和抗凋亡相关基因变化㊂结果:成功建立小鼠重症甲型H1N1流感病毒感染模型㊂感染2~3d 后小鼠胸腺萎缩变小,以胸腺皮质区萎缩为主,感染5~7d 皮质区完全消失㊂主要存在于皮质区的双阳性T 细胞(CD4+CD8+),随感染过程进展逐渐减少直至消失㊂细胞凋亡,尤其是皮质区细胞凋亡增多是胸腺萎缩的重要原因㊂促凋亡相关基因表达增加,尤其Fas 介导的细胞凋亡可能是胸腺皮质区细胞凋亡的重要机制㊂结论:重症流感病毒感染可诱导胸腺(尤其是皮质区)萎缩,FasL⁃Fas 介导的细胞凋亡是胸腺萎缩的重要原因㊂[关键词] 流感病毒;胸腺;萎缩;细胞凋亡;FasSevere influenza A (H1N1)virus infection induces thymic atrophy in miceWANG Yang ,ZHANG Xu⁃Long ,LI Feng⁃Di ,AN Yun⁃Qing ,LIU Bo ,CAO Bin .China⁃Japan Friendship Hospital ,Beijing 100000,China[Abstract ] Objective :To investigate thymic atrophy mediated by severe infection of influenza virus,and itsmechanisms.Methods :4-6weeks of SPF grade BALB /c mice were inoculated intranasally with 50μl of TCID 50influenza A H1N1influenza virus A /California /07/2009(1×106cells /ml)to establish a mouse model of severe influenza virus infection.Body weight,thymus size and weight at different days post infection were detected;HE staining was used to detect pathological changes of thymus;Flow cytometry was used to detect proportion and apoptosis of T cells in different developmental stages in thymus.In situ TUNEL method was used to detect apoptosis of thymocytes.Apoptosis⁃related gene chip and real⁃time PCR to confirm changes of pro⁃apoptotic and anti⁃apoptosis⁃related genes after infection.Results :A mouse model of severe influenza A (H1N1)infection was successfully estab⁃lished.Thymus of infected mice became smaller at 2-3d post infection,and atrophy of thymic cortex was dominant until cortical area disappeared completely at 5-7d post infection.Double positive (CD4+CD8+)T cells,which mainly present in cortical area,gradually decreased and until disappeared as infection progressed.Apoptosis,especially in cortical region is an important cause of thymus atro⁃phy.Expressions of pro⁃apoptosis⁃related genes were increased,especially Fas⁃mediated apoptosis may be an important mechanism ofapoptosis in thymic cortex.Conclusion :Severe influenza virus infection can induce atrophy of thymus (especially cortical area),andFasL⁃Fas⁃mediated apoptosis is an important cause of thymus atrophy.[Key words ] Influenza virus;Thymus;Atrophy;Apoptosis;Fas 流感是由流感病毒感染引起的急性呼吸道传染病,年病死人数约25万~50万㊂2009年起源于北美的新型甲型H1N1流感病毒流行导致全球214个国家和地区超过600万患者感染,死亡病例超过1.8万[1]㊂普通流感重症患者通常以老年人和儿童等免疫力低下人群为主,但本次重症流感人群出现大量中青年患者,主要表现为 细胞因子风暴”㊁外周血淋巴细胞减少㊁弥漫性肺泡损伤㊁肺间质和支气管壁等组织大量炎症细胞浸润等病理改变,导致患者呼吸窘迫综合征,继发多脏器损伤,甚至死亡[2⁃5]㊂胸腺是T淋巴细胞发育㊁分化㊁成熟的中枢免疫器官,可输出具有免疫功能的初始T细胞[6⁃8]㊂研究证实重症高致病性禽流感病毒(H5N1和H7N7)可通过感染胸腺上皮细胞导致胸腺细胞发育受损使胸腺急性萎缩[9⁃11]㊂但甲型H1N1流感病毒重症感染小鼠的胸腺是否萎缩仍需进一步研究㊂本研究建立重症甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型,探讨其胸腺是否损伤萎缩及其发生机制,阐明甲型H1N1流感病毒感染重症患者淋巴细胞减少的原因,为重症流感及其相关病症的预防或预后判定提供新的思路和方法㊂1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 4~6周龄SPF级BALB/c小鼠由中国医学科学院医学实验动物研究所提供㊂所有动物实验均在中国医学科学院医学实验动物研究所动物生物安全三级实验室(ABSL⁃3)中进行,并得到中国医学科学院医学实验动物研究所动物使用和管理委员会批准(批准号:ILAS⁃PL⁃2012⁃009)㊂1.1.2 流感病毒 甲型H1N1流感病毒株为A/ California/7/2009由中国医学科学院医学实验动物研究所保存并提供㊂甲型H1N1流感病毒经SPF鸡胚增殖后收集病毒尿囊液,TCID50为1×106个/ml, -80℃储存备用㊂1.1.3 试剂和仪器 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购于瑞士Roche公司;细胞凋亡相关基因芯片The Apoptosis RT2Profiler TM PCR Array购于美国SABiosciences公司;PerCP⁃CY5.5Hamster Anti⁃Mouse CD3e㊁APC⁃H7Rat Anti⁃Mouse CD4㊁Alexa647 Rat Anti⁃Mouse CD8a㊁APC Annexin V㊁Propidium Iodide Staining Solution购于美国Invitrogen公司㊂FACS CantoⅡ流式细胞仪购于美国BD公司; C1000TM Thermal Cycler荧光定量PCR仪购于美国Bio⁃Rad公司;Olympus AH⁃2显微镜购于日本Olympus公司;病理切片显微扫描系统ScanScope购于美国Aperio公司㊂1.2 方法1.2.1 重症甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型的建立 小鼠随机分为对照组与实验组,并记录体质量,1%戊巴比妥那麻醉,滴鼻给予50μl TCID50甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009(1×106个/ml),对照组小鼠鼻腔给予等体积生理盐水㊂指定时间处死小鼠并取其胸腺组织称重㊂1.2.2 胸腺组织HE染色 将小鼠胸腺组织置于4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片(5μm)用于常规HE染色㊂石蜡切片常规脱蜡水化,苏木精染色5min,1%盐酸乙醇分化10s,伊红染色50s,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察结果并拍照㊂1.2.3 组织切片原位TUNEL细胞凋亡检测 石蜡切片常规脱蜡,孵育45min,去除内源性过氧化物酶,后Converter⁃POD孵育30min,加底物DAB染色,苏木精复染㊁脱水㊁透明㊁封片后显微镜观察㊂1.2.4 荧光定量PCR检测基因表达 取胸腺组织研磨,TRIZol试剂提取RNA;定量后加随机引物㊁dNTP㊁逆转录酶合成cDNA;SYBRGreen法荧光定量PCR检测目的基因的相对表达㊂1.2.5 细胞凋亡基因芯片检测 将胸腺组织提取的RNA逆转录为cDNA,实时定量PCR检测目的基因表达,2-ΔΔCt法计算甲型H1N1流感病毒重症感染2d后小鼠胸腺与正常胸腺基因表达㊂1.2.6 胸腺细胞分离及其亚群和凋亡的检测 取胸腺组织标本于200目筛网剪碎轻柔研磨得胸腺细胞悬液,离心洗涤后计数;取1×106个胸腺细胞加入CD3㊁CD4和CD8荧光标记流式抗体,避光孵育30min,洗涤固定后流式细胞仪检测比较2组小鼠胸腺细胞亚群差异;取1×106个/100μl,胸腺细胞加入CD3㊁CD4和CD8荧光标记流式抗体,避光孵育30min,洗涤2次后加入100μl binding buffer重悬,加入荧光标记Annexin⁃V和PI避光孵育15min 检测两组小鼠胸腺细胞凋亡㊂1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism8软件分析数据㊂组间比较采用成组t检验㊂P<0.05为差异具有统计学意义㊂2 结果2.1 重症流感病毒感染对小鼠胸腺萎缩的影响 感染小鼠体质量逐渐下降,感染后7d生存率仅为20%;肺组织病理表现为支气管和肺泡上皮脱落㊁坏死,支气管腔和血管腔周围炎症细胞浸润,肺泡㊁支气管腔内充血渗出,肺泡腔塌陷,损伤严重程度随时间逐渐加重㊂重症感染小鼠除上述肺组织病理损伤外,胸腺大体标本形态在感染后7d较正常对照组显著缩小(图1A);在感染后第2天小鼠胸腺开始萎缩,第3天开始胸腺显著萎缩,第3㊁5㊁7天分别比正图1 重症甲型H1N1流感病毒感染小鼠对胸腺萎缩的影响Fig.1 Effect of severe influenza A (H1N1)virus infectionon thymic atrophy in miceNote:Compared with control,*.P <0.05,**.P <0.01.图2 重症甲型H1N1流感病毒感染对胸腺皮质区萎缩和双阳性T 细胞的影响Fig.2 Effect of severe influenza A (H1N1)virus infectionon atrophy of thymic cortex and double positive T cells常对照组缩小了59.6%㊁78.2%和72.6%(图1B)㊂提示重症甲型流感病毒感染可诱导小鼠胸腺萎缩㊂2.2 重症流感病毒感染诱导小鼠胸腺皮质损伤萎缩和双阳性T 细胞减少 正常对照组小鼠胸腺具有完整的皮质区和髓质区,实验组小鼠感染后第2天皮质区开始缩小,第3天皮质区损伤显著㊁缩小变窄,到第5天皮质区几乎消失(图2A)㊂正常对照组小鼠胸腺双阳性T 细胞占总T 细胞的61%,实验组小鼠感染后第3天双阳性T 细胞占比减少至42%,感染后第5天和第7天双阳性T 细胞占比降低为7.5%和1.5%(图2B)㊂表明重症流感病毒感染小鼠胸腺萎缩的原因为胸腺皮质损伤导致双阳性T 细胞减少㊂2.3 细胞凋亡小鼠胸腺萎缩和双阳性T 细胞减少的影响 与正常组小鼠相比,实验组小鼠皮质区细胞(上皮细胞和胸腺细胞)凋亡显著增加㊂正常对照组小鼠胸腺凋亡细胞比例约为15%,实验组小鼠感染后第2天胸腺细胞凋亡比例上升至32%(图3B)㊂提示细胞凋亡可引起小鼠胸腺皮质损伤萎缩和双阳性T 细胞减少㊂2.4 重症流感病毒感染小鼠胸腺细胞凋亡相关基因表达 与正常组小鼠相比实验组小鼠胸腺组织中图3 细胞凋亡对胸腺皮质损伤萎缩和双阳性T 细胞减少的影响Fig.3 Effect of apoptosis on atrophy of thymic cortex anddouble positive Tcells图4 流感病毒感染对小鼠胸腺细胞凋亡相关基因表达的影响Fig.4 Effect of influenza virus infection on expressions ofapoptosis⁃related genes in thymocytesNote:A.Apoptosis⁃related gene chip was used to detect changes ofapoptotic gene expression at n.i or 2dpi thymus;B.Functional classification of apoptosis⁃related genes at 2dpi vs control;C,D.Detection of Fas and FasL expression at n.i,1,2,5and 7d by real⁃time pared with control,*.P <0.05,**.P <0.01,***.P <0.001.38个促凋亡基因表达上调,5个抗凋亡基因表达上调;功能聚类显示FasL⁃Fas 和肿瘤坏死因子(TNF)超家族和TNF 受体及其下游Caspases 介导的细胞凋亡相关基因表达增加,DNA 损伤相关基因表达增加(图4A㊁B)㊂实验组小鼠感染后第1天和第2天Fas 表达显著升高,感染后第2天和第5天FasL 表达显著升高(P<0.05,图4C㊁D)㊂胸腺组织细胞凋亡相关基因表达升高支持上述实验组小鼠胸腺皮质区萎缩和双阳性T细胞凋亡的实验结果㊂3摇讨论流感病毒可大规模感染人群,严重威胁患者健康㊂重症甲型H1N1流感病毒感染患者的病理学改变主要包括细胞因子风暴㊁外周血淋巴细胞数目减少和肺组织等多脏器损伤[12⁃14]㊂研究发现高致病性禽流感H5N1和H9N2病毒可感染胸腺上皮细胞,产生大量内源性糖皮质激素,引起小鼠胸腺皮质区受损㊁胸腺细胞分化发育障碍导致小鼠胸腺萎缩[11,15]㊂但重症甲型H1N1流感病毒感染小鼠胸腺是否存在病理损伤萎缩尚未阐明㊂本研究建立了重症甲型H1N1流感病毒感染小鼠模型,证实了感染小鼠的胸腺体积和重量较对照组小鼠显著缩小减轻,胸腺皮质损伤萎缩,早期胸腺细胞,即双阳性T细胞数较正常对照组显著减少,证实胸腺皮质区细胞,即胸腺上皮细胞和双阳性T细胞凋亡是实验组小鼠胸腺损伤萎缩的主要原因,实验组小鼠在感染后第2天,其胸腺凋亡细胞比例较正常对照组显著升高,胸腺组织细胞凋亡相关基因的检测结果与上述检测结果相符㊂胸腺是T淋巴细胞区成熟的中枢免疫器官,分为皮质区和髓质两个区域㊂胸腺皮质区含有大量双阳性T细胞㊂胸腺上皮细胞又称 抚育细胞”,可分泌大量胸腺肽类物质,诱导早期胸腺细胞为未成熟单阳性T细胞,在胸腺树突状细胞的参与下通过阴性选择使未成熟T细胞分化为具有免疫功能的初始T细胞(naïve T cell)[16]㊂胸腺上皮细胞损伤导致双阳性T细胞分化障碍㊁数量减少,不仅是重症甲型H1N1流感病毒感染小鼠胸腺损伤萎缩的主要原因,也可能是重症H1N1l流感病毒感染患者外周血淋巴细胞数减少的原因㊂本研究证实,重症甲型H1N1流感病毒感染可诱导小鼠胸腺损伤萎缩,并初步阐明了其作用机制,为重症流感及其相关病症的预防及预后判定提供新的思路和方法㊂参考文献:[1] Swine influenza A(H1N1)infection in two children⁃⁃SouthernCalifornia,March⁃April2009[J].MMWR Morbid Mortal,2009,58(15):400⁃402.[2] Cao B,Li X W,Mao Y,et al.Clinical features of the initial cases of2009pandemic influenza A(H1N1)virus infection in China[J].N Engl J Med,2009,361(26):2507⁃2517.[3] Mukhopadhyay S,Philip AT,Stoppacher R.Pathologic findings innovel influenza A(H1N1)virus("Swine Flu")infection: Contrasting clinical manifestations and lung pathology in two fatal cases[J].Am J Clin Pathol,2010,133(3):380⁃387. 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