酒精耐受型酿酒酵母菌的诱变筛选

涂布于酒精体积分数为８％的固体培养基上，经Ｔｒｃ法筛选 出５株酵母菌，编号为ＳＣｌ～ＳＣ５。 １．２．２突变株酒精耐受性比较。将筛选出的突变株与原始
２结果与分析 ２．１不同紫外线照射时间下的致死率 由图１可知，随着
ｓ
紫外线照射时间的增加，酵母菌的死亡率也逐渐升高。１５
菌株分别置于酒精体积分数为３％、５％、７％、９％的培养基中 培养，通过其生长情况来比较各菌株对酒精的耐受性。
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
射。培养后通过菌落计数计算不同照射时间下的致死率，选 择致死率７５％一８０％的照射时间作为诱变时间。 １．２．１．３突变株的筛选。①将稀释后的酵母菌涂布于酒精
ＪＬ２００８，
体积分数为４％的固体培养基上，根据“１．２．１．２”的试验结果 进行紫外线诱变处理后，于３０℃下暗培养。待长出菌落后， 倒入一层ＴＹＣ上层培养基，暗处继续培养２～３ ｈ。结束后挑
ｗｅｒｅ
ｃｏｓｅ．ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｎ．ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＳＣｌ ｗｉｔｈ ３０％ｇｌｕｃｏｓｅ．ｔ｝ｌｅ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｎ．ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｗｅｒｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
１．２．３突变株的酒精发酵试验。通过“１．２．２”的比较结果， 选择出２株酒精耐受性最强的突变株进行酒精发酵。发酵 于３３℃进行，转速１００ ｒ／ｍｉｎ，接种量１０％，每４ ｈ测定１次 ｃｏ：失重，失重小于０．１ ｇ认为发酵结束。发酵结束后测定
以内紫外线的致死率基本为０；在３０～３５ Ｓ，致死率从３９．４％ 突然上升至７１．２％，有了极大幅度的提高；５０ Ｓ时，致死率达 到了９５．６％。试验选取致死率在７５％～８０％的紫外照射时 间，即４０ Ｓ作为诱变处理的时间。 ２．２突变株酒精耐受性比较按“１．２．１．３”所述方法，经紫 外线诱变，并通过在含酒精的固体培养基上进行ＴＴｃ筛选， 最终得到了５株对酒精具有较强耐受性的突变株ＳＣｌ～
日本清酒酵母是一种酒精耐受能力很强的酵母菌【８１，该 菌的生长被体积分数为１２％的酒精完全抑制，发酵能力达到
３００
发酵。在酵母菌酒精发酵过程中，每产生１分子的乙醇，就能
产生１分子的ＣＯ：，因此可以通过Ｃ０：的失熏程度来判断发 酵速度的快慢。由图３可知，在发酵起始阶段，原始菌株产 酒精的速度要明显快于突变株。３２ ｈ后，ＳＣｌ的发酵速度逐 渐加快，到发酵结束时ＳＣｌ和ＪＬ２００８的发酵酒精终体积分 数以及发酵效率都相差不大（表１），不过ＳＣｌ的发酵时间要 比ＪＬ２００８长了约４ ｈ。而ＳＣ５的发酵能力要明显低予原始
基金项目
广西教育厅科研项目（２００７０７ＭＳ０６９）；广西工学院博士基金 项目（院科博０８１８００１）。 作者简介另弋（１９７９一），男，四川都江堰人。博士，副教授，从事微生 物发酵与分子生物学方面的研究。 收稿日期２００９－０７－２８
万方数据
３７卷３４期
易弋等酒精耐受型酿酒酵母茵的诱变筛选
１６７６１
ｇ，ＮＨ４Ｃ１ １．０ ０００
ｇ，加水溶解至１
ｍｌ，调
节ｐＨ值为４．５，１１５ ｏＣ灭菌２０ ｍｉｎ。ＴＹＣ（２，３，５一氯化三苯基
制旧‘３。。大量研究显示酵母菌酒精耐受机制是一个非常复 杂的应答过程，有超过２００个的基因参与到了该应答当 中【４１。在针对酵母菌酒精耐受性的研究中，虽然有部分结论 还没有得到一致的意见，但绝大部分科学家都承认酒精通过 对细胞膜产生作用，使细胞膜的透性、流动性、构造发生变
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ：Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ：Ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
在酒精发酵过程中，酵母自身产生的酒精达到一定浓度 时，会对酵母产生毒性，影响其生长、细胞发育以及酒精发酵
１ ０００
ｍｌ，调ｐＨ值为４．５，１１５℃灭菌２０ ｍｉｎ。固体培养基在
酒精度和残糖，根据ＣＯ：失重计算发酵效率。
１ ｇ
ＳＣ５。将这５株菌与原始菌株在酒精体积分数为３％、５％、 ７％、９％的培养基中分别培养，通过绘制其生长曲线比较几
株菌的酒精耐受能力。由图２可知，突变株的酒精耐受性远 远高于原始菌株ＪＬ２００８。当培养基中酒精体积分数仅为３％
３
时，原始菌株的生长即被抑制到了突变株的５０％；在酒精体 积分数为５％的培养基中，原始菌株几乎不能生长，而突变株
针
谣 躐
的生长与在酒精体积分数为３％的培养基中相差不大，只有 ＳＣ４受到了轻微的抑制；当培养基中酒精体积分数提高到 ７％时，突变株的生长均受到了一定的影响，其中ＳＣ３与ＳＣ４ 受到的影响较明显；当酒精体积分数提高到９％时，突变株的
生长受到了较严重的抑制，其中ＳＣｌ和ＳＣ５较另外３株菌表 现出了更强的酒精耐受性。
ｂｅｔｔｅｒ ｔｈｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＳＣｌ
ｏｎ
１６．５４％ａｎｄ ８５．２％ｒｅｓｐ．ａｎｄ ｂｏｔｌｌ ｏｆ ｔｈｅｍ
ｏｎ
ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ａ１ｃｏｈｏｌ
ｏｒｉｇｌｎａＩ ｓｔｒａｉｎ．『Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ １ ＳＣｌ
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Ｊ汜００８
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时间ＴｉｍｅⅣｈ 图２不同酒精浓度下酵母西的生长曲线
Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ
时间ＴｉｍｅⅣｈ ｃｕＨｅ
ｏｆ ｙｅａｓｔ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ’ｅｔｈａｎ０１
ａｌｃｏｈｏｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ（ＳＣｌ ａｎｄ
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ｏｎ
ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ＳＣｌ ａｎｄ ＳＣ５
ＳＣ５）ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｓｅ ５ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｏｒ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａ— ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．１ Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｔｗｏ ｓｔｒａｉｎｓ ｗａｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｆ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ］Ｔｈｅ
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ｏｕｔ
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ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＪＬ２００８ Ｗａｓ ｍｕｔａｔｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ．Ｔｗｏ ｔｉｏｎ．ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
代，获得诱变的出发菌株。 １．２．１．２紫外线诱变剂量的确定。将稀释一定倍数的酵母 菌涂布于含固体培养基的平板，在紫外灯（１０ ｗ）下照射不
同时间后，３０屯暗培养４８ ｈ，同时取一份样品不经紫外线照
分数将会大幅度提高，同时酒精工业生产对强化酵母酒精耐
受能力的要求也日趋明显。 １材料与方法 １．１试验材料 １．１．１菌种。酒精发酵高产Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
１．２．１．１驯化。将原始菌在酒精体积分数为１％的液体培 养基中培养３代后，转入酒精体积分数为２％的培养基中再 培养３代，最后转入酒精体积分数为３％的培养基中培养３
目前，国内酒精厂的发酵醪酒精终体积分数一般在１０％
左右，与国外发酵醪酒精体积分数１３％以上还有很大的差 距。随着高浓醪发酵等新技术的应用，发酵醪的酒精终体积
ｒａｙｓ
ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｅｄ
ｗｉｔｈ
ｍ．Ｆｉｖｅ
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ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
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ｓｔｒｏｎｇ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．Ｉ Ｍｅｔｈｏｄ ｓ． ｔｏｌｅｒａｎｃｅ（ＳＣｌ一ＳＣ５）ｗｅｒｅ
ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ
酵效果优于Ｊ【２００８，是一株极具潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株。 关键词 酒精耐受性；酿酒酵母；诱变；筛选 中图分类号Ｓ１８２ 文献标识码Ａ 文章编号１ ０５１７—６６１１（２００９）３４—１６７６０—０３
Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ⅥＹｉ ｅｔ ａｌ （Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｌｉｕｚｈｏｕ．Ｇｕａｎｇｘｉ ５４５００６）
ｗｅｒｅ
ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ
ｓｔｒａｉｎ．ａｎｄ ｔｈｅｙ ｂｏｔｈ ｃｏｕｌｄ
ｇｒｏｗ
ｔｈｅ ｍｅｄｉａ ｗｉ山９％ｅｔｈａｎｏｌ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ．Ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ １５％ｓｌｕ． ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ｓａｍｅ ａｓ ｔｈａｔ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｓｔｒａｉｎ．Ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｄｉａ
菌株，其发酵酒精终体积分数只相当于ｊｉ２００８的８５％。
化，引起细胞膜的功能受到比较大的损伤。酵母细胞对此作 出应答，使其细胞膜成分发生变化，以便能在有酒精存在的 环境下生长∞１。
四氮唑）上层培养基∞１：葡萄糖０．５ ｇ，琼脂１．５ ｇ，加水至１００
ｒｎｌ，１１５℃灭菌２０ ｍｉｎ，待冷却至５５℃左右时，加入
Ｔｒｃ ５０ ｍｇ。