取小鼠脑组织

丁香园上面总结得方法,排版有点乱、

其实过程与大鼠近似,我得经验就是:ﻫ1。 材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等;ﻫ2。 步骤:处死小鼠,取头颅;

剪开皮肤,漏出颅骨;ﻫ用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线;ﻫ再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨;

当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜与血管;ﻫ然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。

3。 注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部;ﻫ用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部;ﻫ去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑;ﻫ取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高;ﻫ若留病理,建议一定要取完整无损得大脑。

做免疫组化得话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定得好,就需要先灌注。ﻫ先麻醉小鼠ﻫ剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳

先用生理盐水灌注直到从心耳流出来得水清亮了ﻫ再改用固定液(一般就是４%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬

小鼠只需要用注射器就行了,我做得25～3５g得小鼠一般用50mLNＳ+3０mL多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好得生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺与肝得颜色都变成灰白色即可、然后用多聚甲醛灌流,针孔最好就是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。

具体操作如下:ﻫ实验操作步骤:ﻫ1) 小鼠称重,以每克小鼠０、00２5ｍl 4％戊巴比妥钠剂量得实施腹腔麻醉、也可以用10％得水合氯醛,3－5ｕl/g腹腔注射麻醉。ﻫ２) 将麻醉得小鼠仰放在操作台上,去毛、

3) 解剖小鼠,暴露心脏。

4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约 0.5cｍ(最好就是用小点得针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳、ﻫ５) 将灌流器得导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出得液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器得用注射器或者吊瓶都可以。ﻫ6) 将灌流器得导管小心得移至4%多聚甲醛或２、5%戊二醛中,注意不要产生气泡,开始灌流。此时如果瞧到小鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。

7) 灌流大约5分钟,灌流液用量约150毫升左右结束、(小鼠得用量没这么多)ﻫ８) 取材、取实验所需得标本、

９) 将取出得材料放到事先准备得多聚甲醛(戊二醛)中固定2—-4小时后移至3０%蔗糖中4度冰箱保存过夜。

我们实验室鼠脑冰冻切片采用4％得多聚甲醛固定,小鼠直接灌注sａlｉnｅ20ｍl,4％多聚甲醛2０ml经左心室固定然后取材在4度４％多聚甲醛后固定4－６h,浸20%－30%糖沉底,就可以切片,切片首先需要冰冻切片机,我们得leｉｃa1900得,不知道ｌz那里有没有这个机子,还有一种原始得自己刷冻台得那种,比较麻烦,切片厚度大概选择2０-40um差不多ﻫﻫ开胸时要把肋骨提起,大U字剪开左右肋弓后掀起,血管钳固定一下(以免挡遮视野);平头针插入后稍许打开输液器开关并迅速剪开充盈得右心耳(可见血涌出),用血管钳将心室与平头针一起钳夹固定再推(但滴速也不能太快以免血管被冲破,使灌流液流进肺里)。另:开胸时动作尽量要快;针头可以不插入主动脉,留置于左室也行。ﻫ

试剂名称:4%多聚甲醛-磷酸二氢钠／氢氧化钠ﻫ所需药品及剂量:A液:多聚甲醛

４0g

蒸馏水 ４00ml

B液:Na2ＨPO４·2H２O 6、88g

蒸馏水 30０mlﻫ C液:NａOH ３。86g

蒸馏水 2０0m

操作过程:Ａ液最好在500ml得三角烧瓶中配制,至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意,在溶解多聚甲醛时,要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液与C液配制好后,将B液倒入C液中,混合后再加入Ａ液,以1ｎ ＮaOH或1Ｎ HＣｌ 将pH调至7。２～7、4,最后,补充蒸馏水至１０00ml充分混合ﻫ应用范围:光镜与电镜免疫细胞化学研究,用于免疫电镜时,最好加入少量新鲜配制得戊二醛

保存期限及温度:4℃冰箱保存备用,长期保存

我在很多方面就是个新手,经常在园子里逛,学到了很多东西,但同时也瞧到了关于同一个问题有很多不同得回答,我想结合自己得实验,希望各位老师能就我提出得问题说说自己得经验瞧法,给我启示,因为很多自己未做过,怕自己哪里操作不恰当而影响实验结果,非常感谢各位老师得不啻赐教!

ﻫ首先,我做得就是大鼠(体重约２30—2５0g),模型就是大脑中动脉栓塞,在不同得时间点取脑标本,准备做荧光实时定量PCR、Wesｔern bｌot与冰冻切片,我提得问题主要就是在于脑标本得取与存方面。

问题如下:

荧光实时定量ＰＣＲ方面:ﻫ1、标本需要灌注么,有战友说不需要,您就是怎么做得,有灌注得话什么溶液灌注,温度？ﻫ2、标本取下后液氮速冻,然后转-80度冰箱,这样保存一般可以多久?ﻫ3、抽提后得中RNA放-８0度冰箱会很容易降解么,还就是说要放液氮？

ﻫＷesterｎ blot方面:ﻫ4、标本用什么溶液灌注,温度?

5、同一个标本可以同时用于ＲT—ＰCR与Wesｔerｎ ｂlot检测么？(如果灌注手段一样得话)

冰冻切片方面:ﻫ6、灌注冲血用什么溶液,温度？ﻫ7、4％多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？ﻫ8、4％多聚甲醛后固定时间就是多久为宜?

9、蔗糖梯度脱水,蔗糖就是用什么配置得,PBＳ还就是PB,浓度就是多大得?蔗糖梯度就是1５％到20%再30%么?在每种浓度里沉底后就换另一种还就是?

10、我试做过一次,做法为:常规多聚甲醛灌注固定后,再多聚甲醛后固定过夜,然后３０%得蔗糖脱水,这些都就是用0。1Ｍ得ＰBＳ配得,结果发现蔗糖脱水3

天了都还没沉底(中间换过一次蔗糖溶液)。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好,如果您有跟我做一样得模型标本,您就是怎么处理得,如何切?ﻫ11、还有什么需要注意得地方或ｔiｐs。

6、灌注冲血用什么溶液,温度？

用得就是含有肝素钠得生理盐水。每瓶5０0mｌ得生理盐水加入８０mg得肝素钠,肝素钠要避光保存,而且必须使用前临时加入到生理盐水中、肝素钠生理盐水需要用4度预冷。我们用注射器推,大概推10０ml,10miｎ。就可以将血液冲干净、速度要自己掌握。

每支肝素钠每亳升含12500U,相当于１00mｇ,用2０ml生理盐水稀释,分装成40支,消毒备用(4℃贮存)。临用时,注射器吸取肝素钠溶液一支,而后将肝素液来回抽动,使针筒局部湿润,多余肝素液全部排出弃之,注射器内死腔残留得肝素液即可抗凝、

纯得肝素10 mｇ能抗凝100 ml血液(按1mg等于１00个国际单位,1０个国际单位能抗凝１ml血液计)、如果肝素得纯度不高,或过期,所用得剂量应增大2～3倍。用于试管内抗凝时,一般可配成1％肝素生理盐水溶液,取0。1ml加入试管内,加热80℃烘干,每管能使5～１0 ml血液不凝固。作全身抗凝时,一般剂量为:大鼠2、5～3 mg·(200~300g体重)—１,兔或猫1０ mg·ｋg－1,狗5～１0

mg·kg-1。如果肝素得纯度不高,或过期,所用得剂量应增大2～3倍。

7、4％多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？ﻫ一般多聚甲醛灌注20mｉn,1０0mｌ。标准就是动物得尾巴会甩动,全身四肢收缩(这就是因为蛋白变性所致),一般瞧起来像动物活过来了一样。随后就可以将动物得头断掉,来取脑了。ﻫ8、4%多聚甲醛后固定时间就是多久为宜?

这个不一定。对于石蜡切片,可以固定很久。但就是对于冰冻切片,估计就是隔夜或者２4h。但就是先固定一晚上后再取出来,将不需要得大脑组织切掉,比如脑干、小脑等等。擦干,放在蔗糖溶液里、

9、蔗糖梯度脱水,蔗糖就是用什么配置得,PBＳ还就是PＢ,浓度就是多大得？蔗糖梯度就是15％到20％再30％么?在每种浓度里沉底后就换另一种还就是？ﻫ蔗糖用0。1M得PB配置、我一般配20%与30%两个浓度、我个人感觉每个浓度需要沉糖48h。至少我发现２４h就是不够得。沉糖必须完全沉底。

10、我试做过一次,做法为:常规多聚甲醛灌注固定后,再多聚甲醛后固定过夜,然后30%得蔗糖脱水,这些都就是用0。1M得PBS配得,结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底(中间换过一次蔗糖溶液)。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好,如果您有跟我做一样得模型标本,您就是怎么处理得,如何切?

我不知道您就是瞧哪个部位得表达。如果就是海马得话,我建议从前囟-1。４0ｍｍ到前囟-6.30mm左右、

确实提得问题很多,瞧样子还就是有所思考,值得赞扬,我也只能说出我个人得经验,讲几个大概得原则,具体细节还要您自己在实验中体会、

ＲT-PCE与WB都就是分子生物学方面得实验,可以共用一个标本,一般不需要灌注,文献上都如此,需要新鲜得脑组织,液氮速冻,—8０度保存,半年应该没问题,既然就是ＭCA栓塞,那就要取ＭＣA供血区域,嗅极后3－9mm,如果要分半暗带,园子里有类似得帖子,可查找。至于不灌注,存留得血液可能会影响结果,我一般断头后用生理盐水把血液冲洗干净,然后再敲开露骨取脑,这样,效果会好些。

至于您得脑组织灌注固定,蔗糖脱水3天还没沉底,可能与脑组织太大及梯度脱

水有关,我一般在脱水前用双面刀片沿冠状面将多余得脑组织休掉,20％蔗糖１天,30%蔗糖2天,总共3天就足够了,希望对您有帮助、

您在断头后用生理盐水把血液冲洗干净,然后再敲开露骨取脑,我想没通过灌注应该没办法冲掉脑内血管得血吧？

我现在取RT－PCR与WB得标本得做法就是:用临床上用得静脉留置针(相对会比较粗些,而且质软不会刺破血管)插到升主动脉快速灌注冰PBS 5０ｍl左右(一般１分钟内灌完),然后快速取脑放入液氮速冻,尽量缩短时间,不知这种做法就是否尚可?(个人觉得灌注后得脑标本相对未灌注得会好取些,视野感觉也更好,不会血淋淋得)

至于冰冻切片标本得灌注固定已经就是按照您与甲醛版主得方法去做了,期待会有好得结果、

我也说两句冰冻切片,灌注用生理盐水还就是PBS这个问题不就是主要问题,主要作用在于您能否冲干净血管内得血液,而且一般观点认为灌注液最好在10分钟之内冲完(原因可能在于缺血后脑细胞在10分钟后会大量死亡),而且灌注液最好不要用冰冻得(原因有时候冰冻得液体也会使老鼠抽搐,造成您得判断失误)冲洗液得速度越快越好,量要适当控制,过量得话细胞会肿大,一般我们以肝脏变白为标准,如果还不放心得话,再稍微延长点时间,但就是最好不要超过１0分钟。灌注时,有一点小技巧,就就是把心脏稍微往大鼠得右边向上扭一点,以进针没有阻滞感为佳。ﻫ后固定我认为时间不宜太长,因为过多得甲醛会增加片子得背景颜色。一般以6到１2小时为佳、还有一种方法就就是当您得老鼠灌注得不好时,可以后固定以及脱水两个步骤一起进行。这就是别人介绍得,个人没有试过。脱水我们一般就是30％得蔗糖水(pbs配置)等它沉底了就可以切了。脱水不好得话会使片子出现冰晶。ﻫ该切片了,其实切片时冰冻得过程就是最容易出现冰晶得,我解决得办法比较简单就就是速冻,让标本快速得变白。但就是问题也不要太低了,太低得话容易碎片,一般在—20左右,脑组织得话最好不要低于-35度、ﻫ另外大家可有去找找莱卡ＣM1850得冰冻切片机说明书,里面有详细得介绍切片过程。其它类型得切片机我想原理也应当差不多。弄明白了一台其它得也就相应得熟悉了。

冰冻切片方面:ﻫ灌注冲血可以用生理盐水、0。1M得PB ０、01Ｍ得ＰBS都可以(注意调ｐH值)。室灌注得时候用常温得,我们认为冷得会引起血管收缩。快速冲到肝脏变白或者右心耳

流出得液体变白为止。ﻫ多聚甲醛灌注固定速度先快后慢。灌得好就会瞧到老鼠抽搐、四肢变硬。可以夹住腹主动脉,这样灌注固定得快,而且省液体。ﻫ我们后固定与沉糖都在4度进行、４%多聚甲关于多聚甲醛灌注以后,确实对于石蜡切片可以固定很久,但就是如果做组化得话,一般都就是２4小时,时间长得话,比如超过1周,可能抗原就会丢失,不容易出结果。ﻫﻫ对于大脑:灌注取脑后就是继续放到4度多聚甲醛进行24小时后固定,2４ｈ之后进行蔗糖梯度脱水,那么下一步得保存,假如2天后已经沉底。因为没有做过大脑,所以我得问题就是:

ﻫ第一:蔗糖溶液就是否需要与多聚甲醛溶液一样一般就是20倍体积于组织?ﻫ第二:这个时候得脑组织就是否就是与石蜡块里得脑组织一样,保存时间可以很长,会不会很快出现抗原丢失得问题。

第三:保存得条件就是什么,石蜡块可以室温,最好4度,甚至-2０度。但就是其外面包有石蜡。而大脑还就是裸体得,我见到多用OCT包埋后、那么就是否必须包埋,不包埋得话该如何处理;包埋之后就是放到－２0度,还就是-80度,还就是?？？ﻫ第四:这样作出来得冰冻切片在做免疫荧光得时候,就是否需要抗原修