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附件4药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则一、概述刺激性、过敏性、溶血性是指药物制剂经皮肤、粘膜、腔道、血管等非口服途径给药，对用药局部产生的毒性（如刺激性和局部过敏性等）和/或对全身产生的毒性（如全身过敏性和溶血性等），为临床前安全性评价的组成部分。
药物的原形及其代谢物、辅料、有关物质及理化性质（如pH值、渗透压等）均有可能引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生，因此药物在临床应用前应研究其制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官、安全范围。
本指导原则适用于中药、天然药物、化学药物。
二、基本原则（一）试验管理根据《药品注册管理办法》，药物刺激性、过敏性和溶血性研究必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。
（二）随机、对照、重复试验设计应遵循随机、对照、重复的原则。
（三）整体性、综合性原则应根据受试物特点，充分考虑和结合药学、药效学、其他毒理学及拟临床应用情况等综合评价，体现整体性、综合性的原则。
（四）具体问题具体分析应在遵循安全性评价普遍规律的基础上，具体问题具体分析，结合受试物的特点，在阐明其研究方法或技术科学、合理的前提下进行规范性试验，对试验结果进行全面分析评价。
三、基本内容（一）受试物和实验动物1．受试物中药、天然药物：受试物应能充分代表临床试验样品或上市药品。
应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。
应注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。
试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、规格及生产单位。
化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。
受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。
不同红细胞溶血实验替代兔眼刺激性实验比较研究红细胞溶血实验是一种常用的毒理学实验方法，用于评估化合物对红细胞的溶血作用。
传统的红细胞溶血实验常常需要使用动物进行实验，其中最常见的就是兔眼刺激性实验。
随着人们对动物福利关注的增加，转向更加人道和替代实验方法成为了一种趋势。
寻找替代兔眼刺激性实验的方法已经成为了毒理学领域的研究热点之一。
本文旨在对不同红细胞溶血实验替代兔眼刺激性实验的方法进行比较研究，探讨其优劣和适用性，为替代兔眼刺激性实验提供参考。
一、传统的兔眼刺激性实验二、不同红细胞溶血实验替代方法的比较1. 红细胞膜模拟溶解实验红细胞膜模拟溶解实验是一种利用人工合成的红细胞膜模拟溶解过程的方法。
该方法通过将人工合成的红细胞膜暴露于化合物中，观察其溶解程度来评估化合物对红细胞的溶解作用。
这种方法可以避免使用活体动物，减少动物的痛苦和死亡，具有人道性和替代性。
2. 血液气体分析法血液气体分析法是一种利用气体传感器来检测红细胞溶解产生的气体的方法。
该方法通过将化合物与血液混合后，通过气体传感器检测溶解后产生的气体释放量来评估化合物对红细胞的溶解作用。
这种方法无需使用活体动物，操作简便，能够较准确地评估化合物对红细胞的溶解作用。
3. 红细胞渗透性实验三、不同替代方法的优劣和适用性比较1. 红细胞膜模拟溶解实验的优势在于能够准确模拟红细胞溶解的过程，具有较高的可预测性和可重复性。
该方法对于红细胞膜的合成和稳定性要求较高，在实际应用中存在较大的挑战。
2. 血液气体分析法的优势在于操作简便，不需要复杂的仪器和设备，适用性较广。
该方法对于检测灵敏性较低，可能会影响实验结果的准确性。
3. 红细胞渗透性实验的优势在于能够通过不同渗透压下的变化来评估红细胞的渗透性，较为客观和准确。
该方法对于细胞的处理和操作要求较高，难度较大。
综合比较以上不同替代方法的优劣和适用性可得到结论：红细胞膜模拟溶解实验能够准确模拟红细胞溶解过程，具有较高的可预测性和可重复性，但对红细胞膜的合成和稳定性要求较高；血液气体分析法操作简便，不需要复杂的仪器和设备，适用性较广，但检测灵敏性较低；红细胞渗透性实验能够通过不同渗透压下的变化来评估红细胞的渗透性，较为客观和准确，但对细胞的处理和操作要求较高。
（三）溶血性试验方法《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》1、常规的体外试管法（肉眼观察法）1.1 血细胞悬液的配制取兔血（或羊血）数毫升，放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10分钟，或用玻璃棒搅动血液，除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。
加入0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1000-1500离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2-3次，至上清液不显红色为止。
将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成2％的混悬液，供试验用。
1.2 受试物的制备除另有规定外，临床用于非血管内途径给药的注射剂，以各药品使用说明书规定的临床使用浓度，用0.9%氯化钠溶液1∶3稀释后作为供试品溶液；用于血管内给药的注射剂以使用说明书规定的临床使用浓度作为供试品溶液。
1.3 试验方法取洁净试管7只，进行编号，1-5号管为供试品管，6号管为阴性对照管，7号管为阳性对照管。
按下表所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液或蒸馏水，混匀后，立即置37℃±0.5℃的恒温箱中进行温育，开始每隔15分钟观察1次，1小时后，每隔1小时观察1次，一般观察3小时。
按下列顺序加入各种溶液：1.4 结果观察若试验中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留，表明有溶血发生；如红细胞全部下沉，上清液体无色澄明，表明无溶血发生。
若溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，振摇后不分散，表明有红细胞凝聚发生。
如有红细胞凝聚的现象，可按下法进一步判定是真凝聚还是假凝聚。
若凝聚物在试管振荡后又能均匀分散，或将凝聚物放在载玻片上，在盖玻片边缘滴加2滴0.9%氯化钠溶液，置显微镜下观察，凝聚红细胞能被冲散者为假凝聚，若凝聚物不被摇散或在玻片上不被冲散者为真凝聚。
1.5 结果判断当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生时，若受试物管中的溶液在3小时内不发生溶血和凝聚，则受试物可以注射使用；若受试物管中的溶液在3小时内发生溶血和（或）凝聚，则受试物不宜注射使用。
氨基酸表面活性剂三元复配体系的应用研究王石;方兆华;冯小玲;周立武;王德友【摘要】将氨基酸表面活性剂、两性表面活性剂和非离子表面活性剂进行复配,调节配比和pH,获得了自增稠体系,考察了复配体系的黏度、泡沫性能、表面张力和微观结构.梳理性和刺激性评价结果表明,将三元复配体系用于制备氨基酸透明洗发香波,梳理性好,温和不刺激.【期刊名称】《日用化学品科学》【年(卷),期】2019(042)002【总页数】5页(P17-21)【关键词】氨基酸表面活性剂;两性表面活性剂;非离子表面活性剂;自增稠体系;香波【作者】王石;方兆华;冯小玲;周立武;王德友【作者单位】珠海伊斯佳科技股份有限公司,广东珠海519055;珠海伊斯佳科技股份有限公司,广东珠海519055;珠海伊斯佳科技股份有限公司,广东珠海519055;珠海伊斯佳科技股份有限公司,广东珠海519055;珠海伊斯佳科技股份有限公司,广东珠海519055【正文语种】中文【中图分类】TQ423氨基酸表面活性剂具有刺激性和毒性低，易生物降解等优点[1,2]，但其应用于清洁类产品时，存在增稠困难，添加高分子增稠剂又出现清洗不净、增加成本等问题。
表面活性剂复配体系通常显示出优于单一表面活性剂的特性[3]，如改善表面活性和稳定性，降低刺激性，增加黏度等。
SHRESTHA等[4]研究了氨基酸表面活性剂与阳离子表面活性剂的复配体系，Ghosh等[5]报道了氨基酸表面活性剂与非离子型表面活性剂的复配体系可形成囊泡和蠕虫胶束，目前已有研究表明氨基酸/两性表面活性剂复配可以形成自增稠体系[6]，但关于氨基酸/两性离子表面活性剂/非离子表面活性剂三者间复配的研究较少。
笔者制备了氨基酸型表面活性剂、两性表面活性剂和非离子表面活性剂三元复配体系，考察复配比、pH对复配体系黏度、泡沫性能、表面张力和微观结构的影响，探究复配体系胶束聚集形态和形成机理，并将复配体系应用于以氨基酸表面活性剂为主活性成分的透明洗发香波。
眼刺激性体外评价方法研究进展摘要：在中药滴眼液的研发中，寻找一种简单、快速的刺激性评价方法体系非常必要。
兔眼刺激试验(TheDraize test)作为眼部安全评价标准已逾几十载，缺点较多：评分系统主观性强、动物外推至人种属差异大、实验室间变异性大等。
许多实验室在近20年间相继提出了新的体外试验方法，对体外眼刺激性试验方法进行了综述。
关键词：Draize眼刺激试验；刺激性；体外试验；综述毒理学一直致力于保证人类免受各种物质的伤害，如药品、化工产品、化妆品及家庭用品等。
最易导致偶然接触伤害的部位一般是眼睛和皮肤。
这种由化合物刺激导致的生理反应一般称为刺激性，包括客观的生理变化(局部红肿、水肿)和主观感受(瘙痒、疼痛)。
在生产、使用这些物品时，都需要对其刺激性进行评价。
时至今日，最可靠的安全性评价方法还依赖于动物试验。
但是当今社会，动物福利日益受到重视，兔眼刺激性试验在伦理、科学上均受到质疑，因此寻找节约高效的试验方法推动了眼刺激性试验评价方法的进展。
1Draize兔眼刺激性试验简介随着制药工业的发展，特别是一些对眼睛有副作用的药物的发现，在20世纪初形成了眼毒理学。
其主要研究目标之一是建立一种能用于评价新物质潜在刺激性的方法。
Jonas Friedenwald(1897-1955)提出了采用对眼睛各部位毒性分别进行等级评分的方法评价刺激性的方法体系。
在Friedenwald的基础上，John H.Draize(1900-1992)和他的同事在1944年提出了一种新的评价方法，该方法采用皮肤和兔眼作为试验对象，描述了如何进行剧烈的、温和的和长期刺激性的评价。
这些方法相继被其它实验室用以筛选化合物刺激性，被称为“Draize试验”。
此后，Draize的技术标准被FDA采用并用以评价某些物质的安全性，在相当长的一段时间里被FDA视为当时最有价值和最可靠的方法，有金标准(Golden standard)之称。
不同红细胞溶血实验替代兔眼刺激性实验比较研究1. 引言1.1 背景红细胞溶血实验是一种常用的实验方法，用于评估各种物质对红细胞的溶解程度。
而兔眼刺激性实验则是一种常用的实验方法，用于评估化妆品等化学物质对眼部组织的刺激程度。
兔眼刺激性实验存在一定的局限性，包括对动物造成痛苦和不准确的实验结果等问题。
寻找一种替代方法来评估物质对眼部组织的刺激性变得十分重要。
一种可能的替代方案是利用不同的红细胞溶血实验，通过评估物质对红细胞的溶解程度来预测其对眼部组织的刺激性。
这种方法的优势包括更快速、更准确地评估物质的刺激性，同时避免对动物进行残酷实验。
在本研究中，我们将比较不同红细胞溶血实验替代兔眼刺激性实验的优势和局限性，并探讨这种替代方法的可行性。
希望通过这项研究，能为替代动物实验提供新的思路和方法，推动科学研究向更加人道化和有效的方向发展。
1.2 目的为了减少动物实验对动物的伤害，提高实验效率和准确性，本研究旨在比较不同红细胞溶血实验替代兔眼刺激性实验的优劣势，并探讨其在实验应用中的可行性。
通过对不同实验方法的原理和特点进行分析和比较，旨在为相关领域的实验设计和实践提供参考，促进替代方法的推广和应用。
本研究旨在探讨不同实验方法在红细胞溶血和刺激性评价中的准确度和可靠性，并为未来的研究和实验设计提供理论基础和实践参考。
最终目的是为了推动科学研究领域的动物实验替代方法的发展，促进动物保护和实验伦理的进步。
1.3 意义红细胞溶血实验是一种常用的生物学实验方法，用于评估各种物质对红细胞膜的破坏作用。
而兔眼刺激性实验则是一种常用的生物毒性试验方法，用于评估各种化学物质对眼部组织的刺激性和损伤程度。
传统的兔眼刺激性实验存在一定的局限性，例如操作复杂、动物使用数量大、费时费力等问题。
寻找一种更加简便、快速、可靠的替代方法具有重要的现实意义。
本研究旨在探讨不同红细胞溶血实验作为替代兔眼刺激性实验的可行性及优劣势。
通过对比两种实验方法的原理、优势、局限性以及相关研究现状，可以为寻找一种更合适的生物毒性测试方法提供参考和指导。
不同红细胞溶血实验替代兔眼刺激性实验比较研究
随着动物保护意识的提高，兔眼刺激性实验逐渐引起广泛的关注和抵制。
因此，如何
替代兔眼刺激性实验是一个迫切需要解决的问题。
其中，红细胞溶血实验是一种常见的替
代方法，本文将对不同红细胞溶血实验与兔眼刺激性实验进行比较研究。
红细胞溶血实验是一种定性和定量检测化合物毒性和生物活性的方法。
其基本原理是
将化合物与红细胞悬液混合，观察红细胞是否受损或溶解，并定量测定化合物的毒性或生
物活性。
目前常用的有三种不同的红细胞溶血实验：血球计数法、乙醇溶血法和甲醛溶血法。
与红细胞溶血实验相比，兔眼刺激性实验无疑是一种更为复杂和痛苦的方法。
在兔眼
刺激性实验中，将化合物注射到兔眼中，然后观察兔眼是否出现不适、流泪或痉挛等反应，以及反应的严重程度。
这种实验对兔子的伤害很大，并且在众多人道主义者和动物保护主
义者的抵制下，逐渐被淘汰。
综上所述，不同红细胞溶血实验确实可以作为兔眼刺激性实验的替代方法。
其中，乙
醇溶血法和甲醛溶血法虽然不能进行定量分析，但是其简单易行的优点使其在科研实验中
得到了广泛的应用。
与此相比，血球计数法虽然可以进行定量分析，但是需要使用显微镜
等复杂的仪器，从而增加了实验的成本和人力物力投入。
因此，在实际应用中，应根据实
验需求和资源情况选择最适合的红细胞溶血实验方法，以替代兔眼刺激性实验。
一、实验背景化妆品、药物、化工产品等在使用过程中，可能会对皮肤和眼睛产生刺激作用。
为了评估这些物质的安全性，本实验对某化妆品进行了急性皮肤眼刺激试验，以观察其对皮肤和眼睛的刺激反应。
二、实验目的1. 评估某化妆品对皮肤和眼睛的急性刺激作用；2. 为该化妆品的安全性评价提供依据。
三、实验材料1. 实验动物：成年白色家兔，体重2.0-2.5kg，共8只；2. 受试化妆品：某品牌化妆品，生产批号：20231201；3. 赋形剂：无刺激性乳液；4. 实验仪器：皮肤刺激试验箱、电子天平、滴管、纱布、胶布、绷带等。
四、实验方法1. 急性皮肤刺激试验（1）实验动物分组：将8只家兔随机分为两组，每组4只，分别为实验组和对照组。
（2）皮肤准备：实验前24小时，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，去毛范围各约3cm×6cm，不可损伤表皮。
（3）涂抹受试物：实验组将0.1ml受试化妆品滴在2.5cm×2.5cm大小的四层纱布上，敷贴在一侧皮肤上；对照组将相同体积的赋形剂敷贴在另一侧皮肤上。
然后用一层油纸覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。
（4）观察与记录：试验结束后1、24和48小时，观察涂抹部位皮肤反应，按照表1和表2进行皮肤反应积分和刺激强度评价。
2. 急性眼刺激试验（1）实验动物分组：将8只家兔随机分为两组，每组4只，分别为实验组和对照组。
（2）眼刺激准备：实验前24小时，将实验动物眼部用生理盐水清洗，去除分泌物。
（3）滴加受试物：实验组将0.1ml受试化妆品滴入每只实验动物的一侧眼结膜囊内；对照组将相同体积的赋形剂滴入另一侧眼结膜囊内。
（4）观察与记录：试验结束后1、24和48小时，观察眼睛刺激反应，按照表1和表2进行刺激强度评价。
五、实验结果1. 急性皮肤刺激试验实验组：1只家兔在试验结束后1小时出现轻微红斑，24小时后红斑消退；2只家兔在试验结束后24小时出现轻微红斑和水肿，48小时后症状消失；1只家兔在试验结束后48小时出现轻微红斑和水肿，72小时后症状消失。
红细胞溶血试验检测化妆品眼刺激性的初步研究目的探讨红细胞溶血试验在化妆品眼刺激性检测中的适用性。
方法选用9种化妆品产品进行眼刺激试验，确定家兔红细胞50%发生溶血时的化妆品浓度（HD50值）和血红蛋白变性指数（DI，%），计算刺激指数IP= HD50/DI，以IP=HD50/DI值作为评价标准，进行眼刺激性分级。
将红细胞溶血试验刺激性分级结果与家兔眼刺激试验（Draize eye test）结果进行分级一致性比较，初步分析体外试验的适用性。
结果红细胞溶血试验与动物实验结果比较中，9种样品中有7种结果一致，一致率为77.8%（相关性为0.4962）。
结论虽然实验结果说明两者有一定的相关性，但多方面而言，红细胞溶血试验能否真正取代动物实验还有待商榷。
[Abstract] Objective To study the red blood cell hemolysis test on the applicability of the cosmetic eye irritation test. Methods 9 kinds of cosmetic products are chosen as the subjects，and determine the subjects of rabbit red blood cell hemolysis occurs in 50% subjects （HD50）and the initial concentration of hemoglobin denaturation index （DI，%），the calculation of IP=HD50/DI，with IP=HD50/DI value as evaluation standard，make eye irritant grading. Results excitant grading erythrocyte hemolysis test and animal experiment results are compared，and grading consistency preliminary analysis the applicability of the in vitro. Results：Red blood cell hemolysis test and animal experiment result comparison，seven of nine subjects content is consistent，consistent rate was 77.8%（probability=0.4962）.Conclusion Though the experiment results show that both have certain relevance，but many ways，red blood cell hemolysis test failed to truly replace animal testing.[Key words] Cosmetics；Eye irritation trial；Alternative methods；Red blood cell hemolysis test眼刺激性是指动物的眼睛表面（包括角膜，巩膜及结膜部分）接触到化学物质从而产生炎症反应的过程，这个过程有可逆的，也有不可逆的。
化妆品眼刺激性安全评价方法目前多用家兔试验即兔的眼刺激性试验（Draize eye test），该实验方法于1944年建立，目前仍是测定急性眼毒性的国际标准，但由于该试验依靠实验人员肉眼观察评分给出结果，存在一定的主观性；同时实验室与实验室之间的变异性也使该试验存在一定误差。
而且近年来从动物保护和动物福利的角度出发，国际上多种替代动物实验的体外实验已经建立并被验证成为检测标准[1-4]。
红细胞溶血试验已经被纳入到欧洲委员会/英国内务府开展的替代家兔眼刺激试验之一，日本（Japanese ministry of health and welfare，MHW）/JCIA也已经在6～9个实验室进行了类似试验，结果显示[1]，红细胞溶血试验的实验室间的重复性较好。
尽管它与兔眼刺激性试验中的MAS值的相关性不够强（-0.631），但仍可比较确定的从样品中分辨出强刺激物。
我国已建立了红细胞溶血试验方法，并得出红细胞溶血试验的结果与兔眼刺激性试验具有较好相关性这一结论。
张文改等[4-6]认为该实验方法适合评价洗发护发类化妆品的眼刺激性，能正确区分眼刺激性级别为轻刺激性及其以下刺激级别的化妆品；廖艳等[7]的研究结果也表明红细胞溶血试验可用于替代兔眼刺激性试验。
本研究拟在我所建立兔红细胞溶血试验模型，将其应用于化妆品原料和产品眼刺激性的检测与评价，以考察它替代动物眼刺激性试验用于化妆品安全性评价的可能性及应用前景。
1 材料与方法1.1 样品及试验动物全部样品均来源于广州市药品检验所药理室2014年1～9月送检的部分化妆品产品，共9个批次样品，其中面膜类2个，洗发类1个，去角质类2个，洁面类4个。
全部样品均于密闭、室温（22℃）下保存。
试验用家兔来自广州市药品检验所动物房，经检疫后选用健康成年白色家兔，性别不限，雌性不孕。
1.2 主要仪器及试剂主要仪器：日立U-3900紫外分光光度计，低温高速28RS离心机（Biofuge），电子天平AB204-S，六孔水浴TW12。
主要试剂：十二烷基硫酸钠（SDS），广州学友生物科技有限公司；二甲亚砜（DMSO），美国AR公司；草酸钾，广州化学试剂厂。
1.3 实验方法1.3.1 红细胞溶血试验红细胞悬液的制备：健康家兔心脏取血7mL，加2%草酸钾溶液1mL，制备成新鲜抗凝兔血，加PBS 10mL稀释，4℃冰箱保存备用。
样品悬液的制备：根据预实验，选择合适的终浓度，配制样品系列溶液。
每种样品均设立5个试验剂量。
首选PBS为溶剂，对于不溶于PBS的样品选用DMSO为溶剂（终浓度≤0.5%）。
必须保证各稀释样品悬液充分混匀。
溶血及蛋白变性测定：样品组每个浓度2支具塞试管，每管加入样品悬液10mL；阴性对照组2支具塞试管，每管加入PBS 10mL；阳性对照组2支具塞试管，每管加入蒸馏水10mL。
每支试管加入0.2mL稀释兔血，轻轻混匀，37℃孵育30min。
结束后，离心10min，2000r/min，吸取上清液移入比色皿内，于分光光度计540nm，560nm及575nm测其吸光度（A）值。
按公式①计算溶血率（%），公式②计算血红蛋白变性指数（DI，%）。
②R1为空白对照蒸馏水的离心上清液A575/A540值；R2为样品离心上清液A575/A540值；R3为阳性对照SDS离心上清液A575/A540值[2]主要观察指标：50%红细胞发生溶血时的样品浓度（HD50）、蛋白质变性指数（DI）、HD50与变性变性指数DI的比值（IP=HD50/DI）。
阳性对照：以十二烷基硫酸钠（SDS）为阳性对照，最终实验浓度为100mg/L。
1.3.2 家兔眼刺激试验（Draize eye test）样品按不同剂量滴入每只试验动物一侧眼结膜囊内，另一侧为自身对照，在规定的时间间隔内，观察角膜、虹膜和结膜的反应并评分，以评价样品对眼睛的刺激作用[6]。
试验操作：轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑，将样品0.1mL或0.1g迅速滴入眼结膜囊中，令眼睑被动闭合2～3s，以防止样品丢失，另一侧眼睛不作任何处理以作自身对照。
滴入样品后24h内不冲洗眼睛。
若试验结果显示样品有刺激性，则另选用3只家兔进行冲洗效果试验，即给家兔眼滴入样品后30s，用生理盐水轻柔快速冲洗至少30s。
在滴入样品后1、24、48、72h以及第4天和第7天对动物眼睛进行检查，观察结膜、角膜及虹膜的反应，并在24h时进行荧光素钠（1%，生理盐水配制）检查。
如果在72h刺激反应消失，即终止试验。
如有累及角膜或有其他眼刺激作用，7d内不恢复者，则继续观察至21 天。
每次检查时均按《化妆品卫生规范》（2007）中眼损害的评分标准记录眼刺激反应的积分，最后按分级标准对受试样品进行眼刺激性分级[4，6]。
1.4 统计学处理应用STATA统计软件分析数据。
采用秩和检验法进行红细胞溶血试验刺激性分级结果和动物试验分级结果进行比较，判断两种试验结果分级的频数差别是否存在统计学意义。
2 结果2.1 红细胞溶血试验结果溶血率与样品浓度存在一定的线性关系，以样品浓度（mg/L）为横坐标，溶血率为纵坐标可求得HD50值（R2≥0.95）。
进而，根据公式可求得DI及IP=HD50/DI。
见表1。
2.2 眼刺激试验与红细胞溶血试验的分级结果比较动物实验结果可以分为无刺激性（Ⅰ级）、微弱刺激性（Ⅱ级）、轻度刺激性（Ⅲ级）和严重刺激性（Ⅳ级）4个级别。
红细胞溶血试验的眼刺激分级为：L/D≥10、1≤L/D<10 、0.1 ≤L/D<1和L/D<0.1分别表示无刺激性（Ⅰ级）、微弱刺激性（Ⅱ级）、轻度刺激性（Ⅲ级）和严重刺激性（Ⅳ级）4个级别。
本次实验测得，9种化妆品样品中，有7种动物实验与红细胞溶血试验分级结果一致，1种不相符，还有一种无法获得结果。
见表2。
根据STATA统计分析结果，probability= 0.4962，故按单向有序RC表资料进行秩和检验，结果显示这两种试验分类等级的频数的差别不显著，即在一定程度上红细胞溶血试验可取代动物实验。
本实验结果红细胞溶血试验与动物实验结果相关性：9种物质中有7种分级结果一致。
3 讨论红细胞溶血试验作为动物眼刺激试验的替代方法，问世已有20多年，科学家们研究了这两种方法的相关性、一致性和可靠性等，结论是基本确认红细胞溶血试验可以用于眼刺激性的评价，并有较好的准确性和可重复性。
遗憾的是，公认的眼刺激性评价标准一直未有确定。
红细胞溶血试验的基本原理是化学物质对红细胞膜的破坏从而产生胞质内蛋白的变性继而引起一系列的炎性反应[3，8-12]。
不同化学物质损伤红细胞的具体机制可能存在差异，如表面活性剂可破坏膜的脂质结构，导致膜脆性增加和溶解，而某些酸、碱或有机溶剂可引起大分子蛋白质的沉淀/变性，而某些漂白剂和过氧化物对蛋白质的烷化和氧化攻击有可能并不表现为细胞膜溶解。
通常大多数“无或弱的刺激物”不引起溶血和蛋白变性：“中度或严重刺激物”仅引起溶血而较少引起蛋白变性；“强或腐蚀性物质”易造成严重溶血及蛋白变性。
当前较为合理的动物实验替代方案是首先通过物理化学特性预判物质的刺激性程度，而后采用多步体外实验“自下而上（首先进行非刺激性试验）”方式准确识别非刺激物，采用“自上而下（首先进行刺激性试验）”方式准确识别严重刺激物[13]。
