【CN110295174A】FIPV基因过量表达的转基因拟南芥株系及其构建方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010609570.6(22)申请日 2020.06.29(71)申请人 贵州省水稻研究所地址 550006 贵州省贵阳市花溪区贵州省农科院水稻研究所(72)发明人 闫志强　王晓雪　邓茹月　朱诉讼　尹燕斌　夏忠敏　宫彦龙　王忠妮　(74)专利代理机构 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262代理人 陈丹　张奎燕(51)Int.Cl.G01N 21/64(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 15/65(2006.01)A01G 7/00(2006.01)(54)发明名称一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法(57)摘要本发明公开了一种快速鉴定转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括将荧光蛋白基因和目标基因片段插入到双元载体中，随后转化农杆菌；用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。

该方法简化了筛选步骤、缩短了筛选周期、提高了筛选效率。

权利要求书1页 说明书11页序列表6页 附图11页CN 111896506 A 2020.11.06C N 111896506A1.一种筛选转基因拟南芥阳性植株的方法，所述方法包括：步骤1：将荧光蛋白基因插入到双元载体中，形成经改造的双元载体；步骤2：将目标基因片段插入到所述经改造的双元载体中；步骤3：用步骤2制备的双元载体转化农杆菌；步骤4：用经转化的农杆菌转化拟南芥，收获拟南芥种子；步骤5：将收获的种子播种在筛选培养基上，以筛选转基因拟南芥阳性植株；步骤6：出苗后，观察拟南芥阳性植株的植物部位，如果检测到荧光信号，则可以确定该植株为转基因阳性植株，如果未检测到荧光信号，则该植株是假阳性植株。

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选作者：顾菊等来源：《安徽农业科学》2014年第14期摘要 [目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因，构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株，为验证其功能奠定基础。

[方法]提取拟南芥总RNA和RTPCR克隆bZIP23基因，用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接，使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上；将连接产物转化到Trans1T1感受态细胞中，筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证，获得重组质粒。

将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株，浸花法转化拟南芥野生型植株。

[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示，bZIP23基因与35S过量表达载体已连接，获得了重组载体；抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株。

[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础。

关键词拟南芥（Arabidopsis athaliana）；bZIP23；互补和过量表达载体；转基因植株中图分类号Q754；S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04199-03Construction of Arabidopsis Gene bZIP23 Overexpression Vector and Screening of Expression PlantGU Ju，CAO Shuqing et al（School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009）Abstract[Objective] Arabidopsis were used as material to clone bZIP23 gene，we construct gene bZIP23 overexpression vector and screen expression plant.[Method] Total RNA was extracted from Arabidopsis seedlings，and cDNA fragments of bZIP23 gene were amplified by ing the restriction enzymes and T4 DNA ligase，cDNA fragments were subsequently cloned into PART27 vectors，and then were transformed into TransT1 phage resistant chemically competent cells.Analysis of bacterial colony PCR and cDNA sequencing were performed to confirm that cDNA of the Arabidopsis thaliana bZIP23 gene was successfully cloned.The recombinant plasmids were obtained and transformed into Agrobacterium GV3101 cells.Wildtype Arabidopsis thaliana was transformed by using floraldip method.[Result] Analysis of bacterial colony PCR and DNA sequencing were performed to confirm recombinant plasmids，complementary and overexpression positive plants were obtained through genetic screening and identification of genetically modified methods.[Conclusion] Construction of Arabidopsis gene bZIP23 overexpression vector and screening of expression plant laid the foundation for the function of gene bZIP23.Key wordsArabidopsis thaliana；bZIP23； Complementary and overexpression vector；Genetically modified plant转录因子是一类识别DNA特异序列且结合在目的基因启动子的特定位点并调节其转录活性的蛋白，在拟南芥中鉴定了1 600多个转录因子[1]。

拟南芥花药基因的共表达分析焦清局;刘太岗;郑小琪;连爱娥;黄继风【期刊名称】《生物信息学》【年(卷),期】2010(008)004【摘要】运用图论中最大团算法,对ATTED-II数据库中提供的拟南芥共表达数据进行分析,为进一步研究基因功能提供了较为可靠的数据.文中提出的算法首先根据芯片数据鉴定拟南芥花药基因,然后以ATTED-II数据库为基础构建每一个花药基因的共表达网络,最后利用最大团算法从共表达网络中挖掘共表达数据.基于这种方法,系统地分析了每一个拟南芥花药基因的共表达情况,有助于拟南芥花药发育分子机理和基因转录调控的深入研究.实验验证这种方法对拟南芥花药共表达基因的提取十分有效.【总页数】6页(P350-355)【作者】焦清局;刘太岗;郑小琪;连爱娥;黄继风【作者单位】上海师范大学计算机科学与技术系,上海,200234;大连理工大学数学科学学院,辽宁,大连,116024;上海师范大学数理学院,上海,200234;上海师范大学计算机科学与技术系,上海,200234;上海师范大学计算机科学与技术系,上海,200234【正文语种】中文【中图分类】Q23【相关文献】1.用最短路径传递共表达预测拟南芥基因功能 [J], 史锋莉;黄继风2.用最短路径传递共表达预测拟南芥基因功能 [J], 史锋莉;黄继风3.拟南芥花药和花粉发育的基因调控 [J], 樊新萍;牛西午4.拟南芥花粉与花药发育相关基因调控的研究进展 [J], 贾崇宁; 梁塔娜; 赵永; 张艳欣; 李丽丽; 温琦; 赵慧博; 黄凤兰5.拟南芥花药不开裂基因(DAD1)编码一个新的磷脂酶A1、其催化茉莉酸生物合成的最初步骤,并与花粉成熟,花药开裂和开花同步进行 [J], 丁乙因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定董万春;樊婷婷;阳立波;江海坤;张其安;方凌;倪娇娇;管灵霞;曹树青【摘要】[目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因,构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株.[方法]提取拟南芥mR-NA,反转录成cDNA,并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长,通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接,将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上;然后转化至Trans1-T1感受态细胞中,菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认.将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,通过浸花法侵染拟南芥野生型植株,通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株.[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体;通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株.[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)013【总页数】3页(P63-64,104)【关键词】拟南芥;CDR6基因;过量表达载体;转基因植株【作者】董万春;樊婷婷;阳立波;江海坤;张其安;方凌;倪娇娇;管灵霞;曹树青【作者单位】合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;安徽省农业科学院园艺研究所,安徽合肥230009;安徽省农业科学院园艺研究所,安徽合肥230009;安徽省农业科学院园艺研究所,安徽合肥230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽合肥230009;【正文语种】中文【中图分类】S188拟南芥CDR6基因cDNA全长1 120 bp，编码一种含有NC结构域的功能未知蛋白［1－3］，目前对其生物学功能研究尚未见报道。

拟南芥DnaJ蛋白的过量表达对细菌耐盐性的影响赵志常;张建军;张皖蓉;刘震;李旭锋;杨毅【期刊名称】《广西师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(028)001【摘要】热激蛋白是植物在各种环境胁迫下产生的一种蛋白,其表达与多种胁迫的抗性有一定关系.从野生型拟南芥cDNA中克隆获得了编码442个氨基酸序列的DnaJ基因,其与大肠杆菌DnaJ基因含有相同的J区和半胱氨酸富集区.将DnaJ基因构建到pET32a的原核表达载体,过量表达DnaJ基因的细菌在含有0.5mol/L NaCl的培养基中仍然可以生长,初步推断DnaJ的表达与耐盐性有关.【总页数】4页(P54-57)【作者】赵志常;张建军;张皖蓉;刘震;李旭锋;杨毅【作者单位】四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川,成都,610064;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川,成都,610064;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川,成都,610064;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川,成都,610064;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川,成都,610064;四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室,四川,成都,610064【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.过量表达甜菜BvNHX1基因提高拟南芥的耐盐性 [J], 王鹏;安静;侯蕾;孔祥强;赵彦修;张慧2.过量表达大叶补血草LgSOS1基因对拟南芥耐盐性的影响 [J], 周玲玲;祝建波;王爱英3.过量表达大叶补血草LgNHX1基因对拟南芥耐盐性的影响 [J], 周玲玲;祝建波;王爱英4.AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响 [J], 安静;侯蕾;孔祥强;赵彦修;张慧5.过量表达星星草PtSOS_1提高拟南芥的耐盐性 [J], 程玉祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

ISSN 1007-7626CN 11-3870/Q中国生物化学与分子生物学报http ：//cjbmb．bjmu．edu．cnChinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology2015年4月31（4）：414 421DOI ：10.13865/j．cnki．cjbmb．2015.04.12收稿日期：2014-10-20；接受日期：2015-01-07江苏省农业科技自主创新资金项目（No．CX （14）2098）*联系人Tel ：0513-********；E-mail ：yjnkyy@163．com#共同第一作者Ｒeceived ：October 20，2014；Accepted ：January 7，2015Supported by Fund for Independent Innovation of Agricultural Sciences and Technology in Jiangsu Province （No．CX （14）2098）*Corresponding author Tel ：0513-********；E-mail ：yjnkyy@163．com#These authors contributed equally to this study过量表达柳树两个SVP 1s 基因提高拟南芥抗盐胁迫能力余春梅1）#，李敏2）#，何新雨1），李玉娟2），王莹2），谈峰2），张健2）*（1）南通大学生命科学学院，江苏南通226019；2）江苏沿江地区农业科学研究所，江苏如皋226541）摘要在拟南芥、水稻等草本植物中，人们对位于液泡膜上质子泵焦磷酸酶（VPase ）进行了较为深入的研究，其通过水解焦磷酸释放的能量将H +从细胞质泵入液泡中，从而驱动Na +、K +等的运输，避免了细胞质中因过量的Na +、K +造成的伤害，保护了细胞的正常功能．但是木本植物如柳树中的VP 1基因（SVP 1）的功能尚未见报道．本研究检测了两个SVP 1s 同源基因在柳树L0911不同的组织（器官）中以及昼夜条件（以叶片为代表组织）下的表达模式，同时，分析了过量表达SVP 1s 拟南芥T3转基因株系的耐盐特性．结果表明：SVP 1.1在韧皮部中表达最高，而SVP 1.2在韧皮部和新生枝条是其在根部的4 5倍；叶片中两个SVP 1s 在白天稳定表达，18ʒ00后逐渐下降，在黑暗条件下，随着暗处理时间的延长SVP 1.2增幅较大；在盐胁迫条件下，SVP 1s 转基因拟南芥T3株系种子萌发率，叶片中与活性氧清除相关的酶，如SOD 、POD 和CAT 等活性的诱导强度高于野生型对照；SVP 1.1转基因株系叶片膜质氧化程度（MDA ）低于野生型和35S ：SVP 1.2株系．通过本研究显示，在拟南芥中过量表达柳树SVP 1.1s 提高了拟南芥的耐盐能力，揭示了木本植物中VP 1基因同样具备保护细胞，使细胞耐受高盐胁迫的功能，同时也为选育优良耐盐树木品种提供了理论依据．关键词柳树L0911（Salix “Hailiu 1”）；SVP 1s 基因；拟南芥；耐盐性中图分类号S688Over-expression of Two Vacuolar H +-translocating Pyrophosphatase（SVP 1s ）Genes of Willow Enhances Arabidopsis Salt ToleranceYU Chun-Mei 1）#，LI Min 2）#，HE Xin-Yu 1），LI Yu-Juan 2），WANG Ying 2），TAN Feng 2），ZHANG Jian 2）*（1）College of Life Sciences ，Nantong University ，Nantong 226019，Jiangsu ，China ；2）Institute of Agricultural Science in Ｒegions along Yangtze Ｒiver of Jiangsu ，Ｒugao 226541，Jiangsu ，China ）Abstract In herb plant such as arabidopsis and rice ，membrane-bound vacuolar H +-translocatingpyrophosphatases （VPase ）have been investigated deeply．It pumps protons （H +）from the cytoplasm to vacuoles using the energy from the hydrolyzation of inorganic pyrophosphate ，and then H +gradients promote ions such as Na +and K +entering into vacuoles through transporters and channels ，which can protect cell against the poison of extreme ion accumulating．But the functions of VP 1in wooden plant such as willow remain unclear．In this study ，we first analyzed organs （or tissues ）transcriptional level ，and the day and night expression patterns in leaves of two SVP 1s from willow L0911．Then we introduced two SVP 1genes to Arabidopsis （Ecotype Col-0）by agrobacterium mediated transformation．Last ，we第4期余春梅等：过量表达柳树两个SVP1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力detected the germination rate，the enzyme activities such as SOD，POD and CAT in the T3lines over-expressing（OE）the SVP1.1s．The malonyldialdehyde（MDA）contents which reflected the peroxidation of the membranes lipid were also detected．Our results showed that SVP1.1expresses highest in the phloem，while SVP1.2exhibits highest expression in both phloem and new shoots．Both SVP1.1s’expression was very steady during6ʒ00to16ʒ00，after that it decline gradually，but SVP1.2increased quicker than SVP1.1as the time of dark extending．Germination rate of T3OE lines of two SVP1s were both higher than controls under100mmol/L NaCl treatment．In most cases，the activity of SOD，POD and CAT in OE lines（especially SVP1.1OE lines）were all higher than those of WT under same condition．SVP1.1OE lines had10% 25%lower MAD content in leaves than WT under stress conditions．Collectively，the OE lines showed more salt tolerance than WT．This research showed that VP1genes in wooden plant have the same function as its homologous gene in herb plant．The result and resources obtained in this research may be useful for further breeding of salt-tolerance willow varieties．Key words willow L0911（Salix“Hailiu1”）；SVP1s；Arabidopsis；salt tolerance土壤盐碱化是一个世界性的问题，沿海滩涂是面积最大的盐碱地，也是潜力巨大的国土资源．因沿海盐碱地理化性状差，绝大都数植物在盐碱地上生长不良甚至不能成活，难于建立植被，制约了农林生产，影响生态环境［1］．柳树为杨柳科柳属（Salix）落叶乔木，在我国有较广的分布，部分品种能在含盐量4.0‰左右、pH值10.4的土壤中正常生长，是我国极具潜力的沿海滩涂造林和生物质能源树种［2］．挖掘柳树中的耐盐相关基因将具有积极的生产和生态意义．植物液泡膜上质子泵焦磷酸酶（vacuolar H+-translocating inorganic pyrophosphatase，VPase，VP，EC3.6.1.1）是植物中特有通过水解焦磷酸（PPi）驱动的质子泵，它与另一个质子泵H+-ATPase （EC3.6.1.3）（以ATP为动力）一起，在液泡膜的内外形成的质子梯度，促进了Na+、K+等离子进入液泡［3］．在盐胁迫条件下，非盐生植物将过量Na+区隔化入液泡中，避免高浓度的盐对细胞的伤害［4，5］．植物中的VP基因一般有多个成员，分为对K+敏感的I型和对K+不敏感的Ⅱ型，其中Ⅰ型VP基因在植物中发挥主要的功能［6-10］．对水稻6个I型VP基因的研究表明，OVP1受冷处理诱导［11］；在能够耐受洪水浸泡的品种中，OVP3受到缺氧（anoxia）的诱导［12］．小麦中至少有3个基因编码I型VP，其中TaVP3只在发育的种子中检测到表达，TaVP2主要在茎器官中，叶片中该基因在脱水条件下的表达受到抑制，但在盐处理条件下，根中的TaVP2表达受到诱导；TaVP1在小麦器官中的表达比较丰富，但在根中的表达最高，且受到盐的诱导［13］．葡萄中两个I型VP基因均在葡萄果实发育的后期表达，且受到冷害的诱导［10］．可见，I型VP基因家族成员在植物中的表达存在组织器官和环境因子诱导的特异性，亦表明不同的I型VP成员在体内可能发挥不同的功能．植物在盐胁迫条件下，造成细胞内积累过量的超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（．OH）和单线态1O2等活性氧（ＲOS），引起胞内和细胞膜上的脂肪酸过氧化，降低胞内大分子物质如蛋白质、核酸的合成以及蛋白质的功能［14］．植物在进化过程中，产生了多种能够清除体内活性氧的酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，EC1.15.1.1），利用细胞中的H+，将O2-转化为过氧化氢（H2O2）和O2．过氧化氢（H2O2）进一步被POD （peroxidases，EC1.11.1.7）和CAT（catalase，EC 1.11.1.6）等酶清除［15，16］．多个研究表明，耐盐植物中一般具有或能诱导产生较高活性氧清除酶活，如Jin等［17］研究表明，在耐盐的大麦中，可诱导产生新的SOD和POD的同工酶；Wang等［18］研究表明，耐盐水稻中SOD和POD的活性均高于不耐盐的品种．我们前期的研究结果表明，柳树（Salix）中至少有两个I型VP成员：SVP1.1和SVP1.2［19］．盐胁迫条件下，这两个成员在不同的柳树种中具有不同的表达特性，但这两个成员的功能尚需进一步验证．本研究对两个SVP1同源基因在L0911柳树中器官（组织）表达模式以及昼夜表达模式进行了研究．将这两个成员在拟南芥中进行异源表达，通过分析阳性转基因株系在盐胁迫条件下种子的萌发、活性氧清除相关酶的活性以及细胞膜膜质的氧化（MDA）等，对两个SVP1s的功能进行了研究．1材料与方法1.1材料柳树L0911（Salix“Hailiu1”）为江苏沿江地514中国生物化学与分子生物学报第31卷区农业科学研究所选育，本实验用2 3年生枝条，15 16cm 长，在1/2Hoglangd 培养液水培40 50d．拟南芥（Columbia 生态型，WT ），转基因株系，均采用1/2MS （Murashige 和Skoog ）含1%蔗糖固体培养基中进行播种后，在泥炭土：蛭石1ʒ1进行土培．所有植物生长于温室，温度为24/18ħ（白天/黑夜），光照14h ，光照强度为600 1000μmol ·m -2·s -1．WT 拟南芥抽薹后大约7d 用于转化．5 6片莲座叶拟南芥用于分子鉴定．柳树SVP 1.1和SVP 1.2TA 克隆质粒［19］，pWM101载体，大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101菌种等由南通大学生命科学学院生物学系实验室保存．所用的化学试剂购自上海生工生物技术有限公司和AMＲESCO （美国）．质粒提取试剂盒购自碧云天生物技术公司（江苏海门）．内切酶、dNTP 、ExTaq 、定量表达用SYBＲPremix ExTaq TM等分子生物学相关试剂购自宝生物公司（辽宁大连）．引物合成为上海生工生物技术有限公司．1.2ＲNA 提取与cDNA 的合成用TＲIzol Plus ＲNA 试剂（Life technologies ，上海）提取ＲNA ，具体方法按说明书方法进行．cDNA合成为PrimeScript TMDouble Strand cDNA Synthesis Kit （大连宝生物），具体方法参照说明书进行．1.3柳树中SVP 1s 基因定量表达分析在ABI7500定量PCＲ仪中进行定量PCＲ分析（soft V2.0.4），具体方法参见［19］．柳树L0911根、木质部、树皮（主要为韧皮部）、叶片以及新生枝条（叶片未完全展开，长度为2 3cm ）中合成的cDNA 用于器官表达模式．L0911的叶片从6ʒ00 24ʒ00每隔2h 取样，用于叶片中SVP 1s 昼夜表达模式的定量分析．UBQ （Ubiqutin Q ）基因用于本实验cDNA 模板内参（Table 1）1.4植物表达载体构建将SVP 1.1和VP 1.2分别克隆到植物表达载体pWM101，形成pWM-SVP 1.1和pWM-SVP 1.2载体（Fig．1），所用引物如Table 1．具体方法参考分子克隆实验手册．质粒提取与酶切等按照试剂盒说明书进行．Table 1Primers used in this studyPrimer Sequence （from 5'to 3'）UsageSVP-KpnI-F1atGGTACCATGGTTTCGGTGATTTTGCCAGSVP-PstI ＲagCTGCAGTCAGAATATCTTGAAGAGCAGG Construct pWM-SVP 1.1plant expressional vector SVP-KpnI-F2atGGTACCATGGGGATGTTGAGTGAA SVP-BamHI-ＲctGGATCCTCAGAAATATTTGAACAGC Construct pWM-SVP 1.2plant expressional vector HPT Foward ACACAGCCATCGGTCCAGAC 35S promoter ＲTCTCAGAAGAACAAAGGGC Identify the Arabidopsis transgenic plants VP1.1F2ATGGTCGAGGAAGTTCGCAG VP1.1Ｒ2GAGGGGTGTGAGCATGACAA Pair to detect expression of SVP 1.1in willow ［19］VP1.2F2AATGCTCCCATACTGGTTCTC VP1.2Ｒ2GGCGATAAGTGGTGTAAGC Pair to detect expression of SVP 1.2in willow ［19］UBQL TGAGGCTTGGGGAGGAACT UBQＲGATCTTGGCCTTCACGTTGT Internal control gene using in the qPCＲ［19］OE VP1F2CTGGAGGTGCATGGGACAAT OE VP1Ｒ2ATCTTGAAGAGCAGGCCACC Detect SVP 1.1expression in Arabidopsis OE VP1F3AACTGTCGACGTCTTGACCC OE VP1Ｒ3GGATCTCCGATCGTGTCACC Detect SVP 1.2expression in Arabidopsis AtVP1F1TCATGGGTTGGCTTACCGAC AtVP1Ｒ1AGTTCTTTCACGGATGCGGTDetect endogenous AtVP 1gene expressionＲestricted enzyme sites wereunderlinedFig．1Diagram of pWM-SVP 1vector TBL （Ｒ）：T Border Left （Ｒight ）；35S P ：35S promoter ；35S En ：35SEnhancer ；HPT ：hygromycin B phosphotrasferase resistance gene ，VP 1.1and VP 1.2are two Salix VP 1genes614第4期余春梅等：过量表达柳树两个SVP1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力1.5农杆菌的转化农杆菌GV3101用CaCl2制备感受态，用冻融法将测序正确的pWM-SVP1.1和SVP1.2质粒转化农杆菌，并通过菌落PCＲ鉴定为阳性的单克隆，用于后续转化．1.6拟南芥侵染侵染方法采用浸花法［20］．将转化pWM-SVP1.1和SVP1.2农杆菌在LB溶液中培养至A600=1，离心收集后，悬浮在等体积的1/2MS液体（含5%蔗糖，0.1% 0.3%Silwet）溶液中，用滴管滴加在WT花序的顶部，暗培养24h后，恢复正常培养．1.7拟南芥转基因阳性植株筛选和分子检测收获侵染过的拟南芥T1代种子经20%bleach 溶液消毒10min，蒸馏水洗涤5 6次，将种子点播于潮霉素（HPT+，15mg/L）1/2MS筛选培养基上筛选约14d后，表现抗性转基因长出真叶，盆栽培养．待在土培苗长出5 6片真叶后，取适量叶片提取基因组DNA（天根植物基因组提取试剂盒，DP320，具体方法参照试剂盒说明书），选用相应引物（Table 1，35S HPT Forward和35S PromoterＲ）进行PCＲ鉴定．T1植株进一步用于提取ＲNA，合成cDNA，并进行单株中两个外源SVP1s和拟南芥内源的AVP1（At1G15690）表达检测．对基因组、转录水平检测均为阳性的植株，繁殖至T3，T3表现无抗性分离的株系用于功能验证．1.8转基因拟南芥耐盐性检测1.8.1萌发率统计T3转基因拟南芥种子和及WT种子经消毒后点播于含100mmol/L NaCl的1/ 2MS+1%蔗糖培养基中，每皿种子各100粒，重复3次，培养7d后统计发芽种子数．1.8.2盐胁迫下抗氧化酶活性采用与1.7中相同的T3株系材料，土培至5 6片莲座叶，分别进行0，100，200mmol/L NaCl溶液处理7d后，检测过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）等的活性，具体方法参照文献［21，22］．1.8.3细胞膜损伤程度测定取0.500g样品，加5%三氯乙酸5mL，研磨后所得匀浆在3000r/min 下离心10min．取上清液2mL，加0.67%硫代巴比妥酸2mL，混匀后在100ħ水浴30min，冷却后3000r/min离心10min．取上清液测定在450nm、532nm和600nm处吸光度值．按文献［21，22］方法计算MDA浓度．上述方法对所有株系的测定均设3次生物样品重复和3次技术重复，每个参数测定取其平均值．1.9统计方法利用SPSS13.0软件进行显著性差异分析（Student’s t-test）2结果2.1两个SVP1s基因在柳树L0911中的器官表达模式通过器官表达模式的分析表明，SVP1.1韧皮部中表达相对较高，是其在根中的4 5倍，在木质部中表达相对较低，大约为根中的0.4 0.5倍．而SVP1.2在韧皮部和新生枝条中表达相对较高（Fig．2）．两个基因不同的表达模式，可能表明两者在不同的组织或不同发育阶段发挥功能．Fig．2Transcriptional pattern analysis of two SVP1 genes in different organs of L0911All samples were collected from at least three individual cuttings and pooled together for isolating totalＲNA．TheＲNA was converted to cDNA．QuantitativeＲT-PCＲwas performed，in which the willow UBQ gene was used as the internal control．The transcriptional profiles in all samples were compared to that in roots．Data are meanʃS．E．M．（n≥3），*P＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P＜0.001，Student’s t-test2.2两个SVP1s基因在柳树L0911叶片中的昼夜表达模式在柳树L0911中，两个SVP1基因的表达在6ʒ00 16ʒ00间没有明显变化．但18ʒ00后两个基因的表达均呈现下降，到22ʒ00为最低值，大约为对照样品（6ʒ00）的0.5倍（Fig．3）．随后，随着暗处理时间的延长，VP1.2的增加明显快于VP1.1，说明两个基因可能对暗处理的响应不相同．2.3pWM-SVP1s植物表达载体的构建以及重组农杆菌的获得通过Table1中引物分别以SVP1.1和VP1.2TA714中国生物化学与分子生物学报第31卷Fig．3Daily course of the accumulation of two SVP 1transcripts in L0911leavesLeaves were collected fromthree different cuttings and pooled together for isolating ＲNA．cDNA synthesis and ＲT q-PCＲexperiments were conducted．The Ubiquitin Q gene was used as an internal control．All samples in transcriptional analysis were compared at the 6：00AM．The light was turn on at 6：00AM ，and off at 20：00PM．Data are mean ʃS．E．M．（n ≥3），*P ＜0.05，Student ’s t -test质粒为模板进行扩增后，通过相应的酶切处理载体和PCＲ产物后，经过连接，转化至大肠杆菌后，对获得单克隆进行鉴定．重组质粒经过酶切和测序验证后（Fig．4），用于后续的农杆菌转化．对农杆菌进行PCＲ鉴定后（结果未显示），用于后续拟南芥的转化．Fig．4Identification of the pWM-SVP 1s recombinantvectorＲestriction enzymes digested products wereseparated by 1%agarose gel electrophoresis．1．pWM-VP 1.1recombinant plasmid．2．pWM-VP 1.2recombinant plasmid．3．pWM-VP 1recombinant plasmid without ＲE treatment．The upper and lower bands were the open circle and super coiled molecular of the recombinant plasmid ，respectively．4．pWM101vector．M．DNA molecular size standards2.4阳性转基因拟南芥的筛选与分子鉴定进行T1种子的潮霉素抗性筛选和T1植株的分子鉴定．如Fig．5A 所示，转基因阳性植株能正常生长呈现绿色，而阴性植株会逐渐黄化死亡．对表现抗性的植株通过T1植株进一步通过Table 1中的引物HPT foward 和35S promoter Ｒ进行验证．Fig．5B 显示了部分材料的鉴定结果，表明这些材料中具有pWM 101载体上35S 启动子和潮霉素基因序列，但目标基因是否能正常表达，尚需进一步验证．Fig．5Identification of positive Arabidopsis transgenic plants（A ）T1seeds germinated on HPT （15mg /L ）selective 1/2MS medium．Positive transgenic individual plants could grow true leaves ，while other plants died on the selective medium．The arrows showed the positive ones．（B ）PCＲproducts of primers HPT forward and 35S promoter Ｒwere separated by 1%agarose gel electrophoresis．The brightest bands were the DNA fragments spanning the 35S promoter and HPT gene on pWM 101vector．M ：DNA molecular size standards．1：WT plants．2-8：T1individual plants which were screened by the HPT selective medium （only showed part of plant T1identified ）2.5SVP 1s 基因的表达检测过量表达SVP 1.1和SVP 1.2成员的植株中同时含有内源AVP 1基因的表达．本研究设计了这3个基因特异引物（Table 1），检测T1单株VP 1s 转录水平．统计检测的材料，发现80%以上T1单株（总数为46株，结果未显示）能够表达外源基因；部分材料虽然在基因组水平检测到载体序列的存在，但目标SVP 1s 基因不表达（如Fig．5B ，Lane 2）．2.6转基因植株耐盐性检测2.6.1盐胁迫条件下转基因拟南芥萌发率高于野814第4期余春梅等：过量表达柳树两个SVP 1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力Fig．6SVP 1expression in Arabidopsis T1transgenic plantsLeaves of T1individual plants （positive plantsscreened by HPT ）were collected for isolating ＲNA．cDNA synthesis and ＲT-PCＲwere conducted．The PCＲproducts were separated by 1%agarose gel electrophoresis．1：WT ；2-4：SVP 1.1T1individual transgenic plants ；5-7：SVP 1.2T1transgenic plants．Arabidopsis AVP 1（At 1G 15690）as internal control生型对照在含有100mmol /L NaCl 的1/2MS培养Fig．7ＲOS scavenging related enzyme activities and MDA contents in leaves under salt stress （A ）SOD enzymeactivities．（B ）POD enzyme activities．（C ）CAT enzyme activities．（D ）MDA contents．WT ，Col-0ecotype ；SVP1.1OE2and OE7，SVP1.2OE3and OE6are T3lines come from T1which can express SVP 1s gene．OE lines and WT seedling with 5-6leaves were treated under 0，100and 200mmol /L NaCl for 7days and the leaves were collected for enzyme activities （orMDA contents ）test．Data are mean ʃS．E．M．（n ≥3），*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001，Student ’s t -test基上，转SVP 1.1基因拟南芥萌发率为85%ʃ4.7%，其根和子叶均能正常生长；而转SVP 1.2基因拟南芥萌发率为45%ʃ5.2%，主根和子叶生长速度慢；野生型拟南芥萌发率为31.5%ʃ2.3%，幼根短小、子叶展开困难．所有材料在未处理的1/2MS 培养基萌发率为95.3%ʃ2.5%．2.6.2盐胁迫下转基因拟南芥具有更高的活性氧清除酶活从Fig．7A 可知，SOD 酶活性，在WT 中，随着NaCl 浓度的增大，呈先升后降趋势．尽管转SVP 1.1s 株系间的SOD 酶活差别较大，但随着NaCl 浓度的增大，有较大的诱导；比较两个同源基因SVP 1.1和SVP 1.2株系，SVP 1.1转基因株系随着盐浓度的增大，酶活上升；SVP 1.2株系在高盐浓度下稍有下降．胁迫条件下，转基因株系的最高酶活是其自身对照的6 7倍，是野生型对照的4 5倍．随着NaCl 浓度的增大，转S VP 1.1s 拟南芥中的POD 酶活性（Fig．7B ）高于对照WT ，且转SVP 1.1株系的酶活在两种盐胁迫条件下均高于转SVP 1.2914中国生物化学与分子生物学报第31卷植株．随着NaCl浓度的增大，所有植株中CAT活性均呈上升趋势，但VP1.1OE植株的CAT的活性比WT和VP1.2OE植株的活性的增长量大（Fig．7C）．总体来说，OE植株中抗氧化酶活上升幅度一般高于野生型，说明两个SVP1都能提高盐胁迫条件下拟南芥的抗氧化能力．比较两个同源SVP1基因，SVP1.1转基因植株维持了更高的胞内SOD、POD和CAT活性，因此，可以更有效的清除氧自由基．2.6.3盐胁迫下转SVP1.1基因的拟南芥的膜质氧化程度相对较轻所有检测的材料均显示，随着NaCl浓度的增大，MDA含量呈不断上升趋势．在高盐胁迫下，WT和转SVP1.2OE植株叶中的MDA含量比SVP1.1OE植株高（Fig．7D），说明转SVP1.1 OE植株膜质的过氧化程度较低．3讨论本研究通过对两个SVP1基因在不同组织中表达模式的分析表明，它们在所有检测的器官中均有表达，但在树皮（主要为韧皮部）中的表达最高（Fig．2），可能与木本植物需要较为强大的动力将叶片光合作用的产物运输到根部有关［9］．Gaxiola 等［9］综合植物中对VP1的研究结果，对位于不同部位的VP1酶的功能提出了如下假设：在叶肉细胞中，位于液泡膜中的VP1主要水解代谢副产物PPi （焦磷酸），促进光合作用；在筛管细胞中，其主要功能是PPi合成酶，促进蔗糖运输到根部．关于VP1作为PPi合成酶尚需要进一步的实验验证，我们的工作为揭示VP1在微管组织中发挥的功能奠定了基础，我们将会从细胞学、生理学的角度进一步揭示其在柳树中发挥的功能．同一基因家族的不同成员在植物中可能有功能冗余、或不同的成员的生物学功能、生化功能发生变化是在植物中较为普遍的现象［11-12，23-24］．在本研究中，通过转录水平以及两个基因的拟南芥OE植株揭示以下2种可能：1）．SVP1.2在体内发挥的功能可能与营养有关，在需能、需要营养物质较多的组织中，SVP1.2发挥更主要的功能．Fig．2显示，SVP1.2在新生枝条和韧皮部组织中的表达更高；2）SVP1s 编码的蛋白质可能活性不尽相同．本研究发现：SVP1.1OE株系的耐盐表现高于SVP1.2OE株系，其可能的原因是两个基因的OE株系表达水平不尽相同外（Fig．6），也可能存在生化活性的差异．SVP1.1和SVP1.2的一级氨基酸序列的相似性高达81.21%，在焦磷酸（PPi）和两个酸性化基序（acidic motif）（DX3DX3D）完全一致．在5个参与形成氢键的氨基酸残基中，SVP1.1发生了较为保守的Ｒ（精氨酸残基）到K（赖氨酸残基）变化外，其余4个残基完全一致．从其三维结构看，主要是N端的无规卷曲不能重合［19］．拟南芥AVP1中，E229D （谷氨酸到天冬氨酸）的突变提高了AVP1水解焦磷酸和质子转移功能［23］，两个SVP1s是否存在生化活性的差异尚需进一步的验证．比较已经测序的植物基因组的VP1基因，发现多种植物中的VP1存在多个成员（www．phytozome．net），如杨树中具有4个VP1基因，禾本科植物玉米（Zea mays）中至少有8个成员、水稻（Oryza sativa）中有6个成员［12］．同一物种中，不同的VP1同源蛋白（同工酶）生化活性的分化，尚未见相关的研究报道，我们后续的研究将进一步揭示柳树（或其它植物）中，VP1基因成员的功能分化．通过本研究表明，将柳树中两个SVP1s基因转入拟南芥中，提高了拟南芥在盐胁迫条件下的萌发率，能够更好诱导活性氧清除相关的酶活，提高植物的抗氧化能力，在一定程度上降低了胁迫条件下植物的膜脂氧化程度．到目前为止，针对草本植物VP1的研究相对较多，如在苜蓿（alfalfa）、大麦［24，25］中表达拟南芥中的AVP1能显著提高植物耐盐和干旱胁迫的能力．木本多年生植物中VP1基因的报道相对较少，结合我们以及Dong等［26］的研究结果，木本多年生植物中的VP1基因与其在草本植物中的同源基因具有类似的功能，本研究丰富了对木本植物中有关VP1基因功能的认识，为研究VP1基因在微管组织较为丰富的植物中发挥的功能奠定了基础，同时为提高植物的耐盐性提供了基因资源．参考文献（Ｒeferences）［1］涂忠虞主编．柳树育种与栽培［M］．南京：江苏科学技术出版社（Tu Zhong-Yu ed．Breeding and Cultivation of Willow［M］．Nanjing：Jiangsu Science and Technology Press），1982，10［2］李敏，张健，冯立国，等．柳树液泡膜ATP酶B亚基基因克隆及在盐胁迫下表达的分析［J］．江苏农业学报（Li M，ZhangJ，Feng LG，et al．Cloning and expression analysis of vacuolarATPase B subunit gene VHA-B in leaves of salt-stressed willow［J］．Jiangsu J Agric Sci），2013，29（5）：1149-1153［3］Isayenkov S，Isner JC，Maathuis FJ．Vacuolar ion channels：Ｒoles in plant nutrition and signalling［J］．FEBS Lett，2010，584（10）：1982-1988［4］Hasegawa PM．Sodium（Na+）homeostasis and salt tolerance of plants［J］．Environ Exp Bot，2013，92：19-31024第4期余春梅等：过量表达柳树两个SVP1s基因提高拟南芥抗盐胁迫能力［5］Janicka-Ｒussak M，Kabala K，Wdowikowska A，et al．Modification of plasma membrane proton pumps in cucumber rootsas an adaptation mechanism to salt stress［J］．J Plant Physiol，2013，170（10）：915-922［6］Hsiao YY，Pan YJ，Hsu SH，et al．Functional roles of arginine residues in mung bean vacuolar H+-pyrophosphatase［J］．Biochim Biophys Acta，2007，1767（7）：965-973［7］Hsiao YY，VanＲC，Hung SH，et al．Ｒoles of histidine residues in plant vacuolar H+-pyrophosphatase［J］．Biochim BiophysActa，2004，1608（2-3）：190-199［8］GaxiolaＲA，Palmgren MG，Schumacher K．Plant proton pumps ［J］．FEBS Lett，2007，581（12）：2204-2214［9］GaxiolaＲA，Sanchez CA，Paez-Valencia J，et al．Genetic manipulation of a“vacuolar”H+-PPase：from salt tolerance toyield enhancement under phosphorus-deficient soils［J］．PlantPhysiol，2012，159（1）：3-11［10］Venter M，Groenewald JH，Botha FC．Sequence analysis and transcriptional profiling of two vacuolar H+-pyrophosphataseisoforms in Vitis vinifera［J］．J PlantＲes，2006，119（5）：469-478［11］Zhang J，Li J，Wang X，et al．OVP1，a vacuolar H+-translocating inorganic pyrophosphatase（V-PPase），overexpression improved rice cold tolerance［J］．Plant PhysiolBiochem，2011，49（1）：33-38［12］Liu Q，Zhang Q，BurtonＲA，et al．Expression of vacuolar H+-pyrophosphatase（OVP3）is under control of an anoxia-induciblepromoter in rice［J］．Plant Mol Biol，2010，72（1-2）：47-60［13］Wang Y，Xu H，Zhang G，et al．Expression and responses to dehydration and salinity stresses of V-PPase gene members inwheat［J］．J Genet Genomics，2009，36（12）：711-720［14］Foyer CH，Shigeoka S．Understanding oxidative stress and antioxidant functions to enhance photosynthesis［J］．PlantPhysiol，2011，155（1）：93-100［15］Kim SG，Kim ST，Kang SY，et al．Proteomic analysis of reactive oxygen species（ＲOS）-related proteins in rice roots［J］．PlantCellＲep，2008，27（2）：363-375［16］Mylona PV，Polidoros AN，Scandalios JG．Antioxidant gene responses toＲOS-generating xenobiotics in developing andgerminated scutella of maize［J］．J Exp Bot，2007，58（6）：1301-1312［17］Jin X，Huang Y，Zeng F，et al．Genotypic difference in response of peroxidase and superoxide dismutase isozymes and activities tosalt stress in barley［J］．Acta Physiol Planta，2009，31（6）：1103-1109［18］Wang X，Hou C，Liu J，et al．Hydrogen peroxide is involved in the regulation of rice（Oryza sativa L．）tolerance to salt stress［J］．Acta Physiol Planta，2012，35（3）：891-900［19］Li M，Yu C，Wang Y，et al．Cloning and characterisation of two H+-translocating organic pyrophosphatase genes in salix and theirexpression differences in two willow varieties with different salttolerance［J］．Curr Genomics，2014，15：341-348［20］Zhang X，HenriquesＲ，Lin SS，et al．Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method［J］．Nat Protoc，2006，1（2）：641-646［21］郝建军，康宗利，于洋．植物生理学实验技术［M］．北京：化学工业出版社（Hao JJ，Kang ZL，Yu Y．An ExperimentalProtocol of Plant Physiology［M］．Beijing：Chemical IndustryPress），2006：158-159［22］Cakmak I，Horst WJ．Effect of aluminium on lipid peroxidation，superoxide dismutase，catalase，and peroxidase activities in roottips of soybean（Glycine max）［J］．Physiol Plant，1991，83（3）：463-468［23］ZhenＲG，Kim EJ，Ｒea PA．Acidic residues necessary for pyrophosphate-energized pumping and inhibition of the vacuolarH+-pyrophosphatase by N，N’-dicyclohexylcarbodiimide［J］．JBiol Chem，1997，272（35）：22340-22348［24］Bao A，Wang S，Wu G，et al．Overexpression of the Arabidopsis H+-PPase enhanced resistance to salt and drought stress intransgenic alfalfa（Medicago sativa L．）［J］．Plant 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过表达CsMADSs拟南芥的表型变化及CsMADSs表达水平安玉兰;翟克清;杨峰;雷玥;胡克玲;甘德芳;汪承刚【摘要】为探究黄瓜CsMADSs的功能,构建了黄瓜CsMADS08及CsMADS21基因的真核表达载体并转化烟草,研究其在烟草中的亚细胞定位;同时通过农杆菌介导法转化拟南芥,经潮霉素筛选及分子检测,获得阳性株,观察转基因后代植株的表型变化情况;实时荧光定量PCR检测CsMADS08和CsMADS21在转基因后代植株各器官中的表达情况.结果显示,CsMADS08定位于细胞膜和细胞核上,而CsMADS21定位于细胞膜上.表型分析结果显示,过表达CsMADS08基因的拟南芥叶片发紫,侧枝少,且侧枝上出现莲座状的茎生叶;而过表达CsMADS21植株的侧生花序及果荚都比野生型多,且花期早,果实成熟早.荧光定量PCR结果显示,Cs-MADS08基因主要在茎中表达,而CsMADS21基因则主要在花中有高表达.该研究可为进一步明确黄瓜Cs-MADSs基因的功能及培育黄瓜新品种提供参考依据.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2018(030)010【总页数】9页(P1671-1679)【关键词】CsMADSs;拟南芥;亚细胞定位;表型变化;表达分析【作者】安玉兰;翟克清;杨峰;雷玥;胡克玲;甘德芳;汪承刚【作者单位】安徽农业大学园艺学院,安徽省园艺作物育种工程实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学园艺学院,安徽省园艺作物育种工程实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学园艺学院,安徽省园艺作物育种工程实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学园艺学院,安徽省园艺作物育种工程实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学园艺学院,安徽省园艺作物育种工程实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学园艺学院,安徽省园艺作物育种工程实验室,安徽合肥230036;安徽农业大学园艺学院,安徽省园艺作物育种工程实验室,安徽合肥230036【正文语种】中文【中图分类】S649黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科一年生攀援草本植物，是夏季主要蔬菜之一，全国各地均有栽培。

过量表达拟南芥NPR1基因提高小麦纹枯病的抗性周淼平;杨学明;姚金保;张鹏;余桂红;马鸿翔【期刊名称】《分子植物育种》【年(卷),期】2012(10)6【摘要】拟南芥NPR1基因是植物重要的抗病调控因子,转基因过表达该基因可以赋予植物广谱抗性。

为明确该基因在小麦抗纹枯病基因工程中的应用潜力,本研究构建了由玉米ubiquitin启动子驱动的拟南芥NPR1表达载体,采用基因枪介导法导入到小麦品种扬麦12号中,获得20株转基因植株。

对14个外源基因纯合株系的半定量RT-PCR和测序分析结果显示,外源拟南芥NPR1基因已经导入转基因小麦并有不同水平的表达,部分转基因株系拟南芥NPR1基因发生重排;纹枯病抗性鉴定结果表明,转基因株系中拟南芥NPR1基因的正确表达可以减轻纹枯病菌引起的病症发展,提高转基因小麦的纹枯病抗性。

【总页数】7页(P655-661)【关键词】小麦;AtNPR1;遗传转化;纹枯病【作者】周淼平;杨学明;姚金保;张鹏;余桂红;马鸿翔【作者单位】江苏省农业科学院生物技术所,江苏省农业生物学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S572【相关文献】1.转拟南芥NPR1基因水稻253 T3代株系对水稻白叶枯病的抗性及其农艺性状表现 [J], 罗雪梅;罗荡平;曹启龙;冯家勋;段承杰2.转拟南芥NPR1基因水稻253 T3代株系对水稻白叶枯病的抗性及其农艺性状表现 [J], 罗雪梅;罗荡平;曹启龙;冯家勋;段承杰3.小麦TaYAB2基因的过量表达造成转基因拟南芥叶片近轴面特征趋向远轴面 [J], 赵翔宇;谢洪涛;陈祥彬;王帅帅;张宪省4.新疆小拟南芥NPR1基因对植物系统获得性抗性的影响 [J], 裴娟;欧秀玲;李凤;孔德真;王琨;易小龙;祝建波;王爱英5.TaPIMP1过量表达提高转基因小麦纹枯病抗性的研究 [J], 周淼平;周小青;张增艳;董娜;马鸿翔;姚金保因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小麦TaYAB2基因的过量表达造成转基因拟南芥叶片近轴面特征趋向远轴面赵翔宇;谢洪涛;陈祥彬;王帅帅;张宪省【摘要】叶片极性的建立在叶片形态建成过程中有重要作用.探讨小麦叶片发育的调控机制不仅可以丰富植株形态建成的基础知识,也可以为小麦株型的设计提供理论依据.本研究从小麦中分离出一个YABBY基因家族成员TaYAB2,对其序列特征、表达模式及功能进行了分析.该基因编码的蛋白在N端含有C2C2锌指结构域, C端含有YABBY结构域,与拟南芥中AtYAB2和水稻中OsYAB2同源关系较近.RT-PCR结果显示,该基因在大部分组织器官中广泛表达.进一步的原位杂交分析证实TaYAB2基因的转录产物在小麦苗端、幼叶、侧芽、幼穗等组织器官中高水平积累.在拟南芥中过量表达该基因能够引起转基因拟南芥叶片近轴面特征趋向远轴面.与对照相比,转基因植株中远轴面特征决定基因FIL/YAB1、YAB3、KAN1的表达均呈不同程度的上调,表明TaYAB2基因可能通过调节远轴面特征决定基因FIL/YAB1、YAB3、KAN1等调控叶片近-远轴极性.本研究结果有助于揭示YABBY类基因在小麦侧生器官近-远轴极性建立中的分子机制.%10.3724/SP.J.1006.2012.02042【期刊名称】《作物学报》【年(卷),期】2012(000)011【总页数】10页(P2042-2051)【关键词】近-远轴极性;叶片发育;TaYAB2;小麦;转基因【作者】赵翔宇;谢洪涛;陈祥彬;王帅帅;张宪省【作者单位】山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018;山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018;山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安271018;山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018;山东农业大学生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室/作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018【正文语种】中文叶是植物的重要营养器官之一, 是植株形态建成的重要组成部分, 对植株生长发育有着重要的意义[1]。

超表达植株构建原理赛思基因，专注遗传转化技术的应用和开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。

基因过表达是指将一目标基因克隆到一个携带有强启动子和抗性筛选标记等元件的载体上，然后导入植物体内，这样宿主细胞会获得较高量的目标mRNA转录水平和蛋白表达水平，从而通过表型等分析可以研究该基因的功能。

它适用于基因功能有冗余或基因敲除后致死的情况。

过量表达的载体(超表达)过表达载体主要是将目的基因的编码区（CDS）构建到相应的质粒或者病毒载体中，达到在目的基因过量表达的作用。

过表达载体的主要元件：Promoter—gene—linker—Fluorescent gene—抗药筛选gene。

花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S是组成型启动子，具多种顺式作用元件。

其转录起始位点上游－343～－46bp是转录增强区，－343～－208和－208～－90bp是转录激活区，－90～－46bp是进一步增强转录活性的区域。

Mitsuhara等利用CaMV35s核心启动子和CaMV 35S启动子的5＇端不同区段与烟草花叶病毒的5＇非转录区(omega序列)相连，发现两个CaMV 35S启动子－419～－90序列与omega序列串联后，将GUS构建在该启动子后面转入植株中，获得很高的GUS表达活性。

另一种高效的组成型启动子Cs-VMV是从木薯叶脉花叶病毒(cassava vein mosaic virus，CsVMV)中分离的。

该启动子－222～－173bp负责驱动基因在植物绿色组织和根尖中的表达。

在双子叶植物中过量表达某个目的基因大多采用人工改造后的CaMV 35S启动子，在单子叶植物如水稻中常采用泛素启动子。

除了上面提到的高效表达的组成型启动子外，在植物发育生物学研究中经常使用的还有组织特异性表达启动子，如根特异启动子mas2、叶肉细胞特异启动子C4Pdk和种子特异启动子napinB等。

载体构建(vectorconstruction)：为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。

拟南芥ABI5亚家族ABF1、ABF2、ABF4基因的重组及其过表达转基因拟南芥的构建拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种重要的模式植物，因其基因组小且易于遗传转化而被广泛应用于植物生物学的研究。

在植物的逆境响应中，拟南芥的ABI5亚家族基因起着重要的调控作用。

本文旨在介绍拟南芥ABI5亚家族ABF1、ABF2和ABF4基因的重组及其过表达转基因拟南芥的构建。

ABI5亚家族是拟南芥中一个重要的转录因子家族，参与了植物在逆境条件下的干旱、高盐和低温等逆境响应过程。

ABF1、ABF2和ABF4是ABI5亚家族的三个成员。

首先，我们进行了ABF1、ABF2和ABF4基因的重组。

通过PCR扩增技术，将每个基因的全长序列扩增出来。

然后，将扩增产物进行酶切并与相应的表达载体进行连接，得到ABF1、ABF2和ABF4的重组表达载体。

接下来，我们构建了过表达转基因拟南芥。

将ABF1、ABF2和ABF4的重组表达载体分别引入拟南芥愈伤组织中。

通过农杆菌介导的遗传转化方法，将重组表达载体导入拟南芥细胞中。

转基因植株经过筛选和鉴定后，获得了过表达ABF1、ABF2和ABF4基因的拟南芥系列。

我们对这些转基因拟南芥进行了进一步的研究。

通过对转基因植株进行RT-PCR和Northern blot分析，确定了ABF1、ABF2和ABF4基因在转基因拟南芥中的高表达。

此外，我们还观察了转基因拟南芥在逆境条件下的表型变化。

结果显示，过表达ABF1、ABF2和ABF4基因的转基因拟南芥在干旱、高盐和低温等逆境条件下表现出更强的逆境耐受性，相比野生型拟南芥，转基因植株在逆境中的生长和发育更好。

进一步研究表明，过表达ABF1、ABF2和ABF4基因的转基因拟南芥的逆境耐受性与逆境相关基因的表达调控有关。

通过比较转基因植株和野生型植株的基因表达谱，发现转基因拟南芥中很多逆境相关基因的表达明显增加。

这表明，ABF1、ABF2和ABF4基因的过表达可能通过调控其他逆境相关基因的表达，从而增强了转基因拟南芥的逆境耐受性。

专利名称：一种可进行植物多基因编辑的病毒载体及其构建方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：刘超超,王琼
申请号：CN202010217461.X
申请日：20200325
公开号：CN111334527A
公开日：
20200626
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种可进行植物多基因编辑的病毒载体及其构建方法和应用，涉及植物基因编辑技术领域；将tRNA、sgRNA依次连接构成单元序列，连接载体pCE2；使用“金门”克隆方法，将靶标基因的靶序列插入到每个单元序列的tRNA与sgRNA之间，并且多个所述单元序列串联排列，此串联序列插入到TRV2病毒载体中，TRV侵染过量表达Cas9蛋白的植株后，组装有不同目标靶序列的tRNA‑sgRNA表达序列单元获得转录，完成多基因编辑过程，可实现多个基因的编辑或者根据目标进行不同基因的组合编辑。

本方法使植株中能翻译成正常蛋白序列的mRNA表达量更低、基因沉默表型更稳定，且可同时精确靶向敲除多个基因。

申请人：江苏科技大学
地址：212003 江苏省镇江市梦溪路2号
国籍：CN
代理机构：北京盛凡智荣知识产权代理有限公司
代理人：陈月婷
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FaGST基因过量表达获得拟南芥转基因植株陈锡;陈莹;刘晓霞;刘重阳;吴溪;姚文琴;王小利【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2022(50)7【摘要】【目的】探明FaGST基因的功能和分子调控机制,为其后期的抗性利用与研究提供科学依据。

【方法】利用前期构建的pCAMBIA1300-35S空载体和pCAMBIA1300-35S-FaGST过表达载体,将其转化感受态(DH5α)细胞后导入农杆菌GV3101,利用花序侵染法转化拟南芥,通过潮霉素(Hyp)进行筛选、PCR鉴定,并利用实时荧光定量PCR检测其表达量。

【结果】FaGST基因成功导入拟南芥中,获得6株空载体转基因拟南芥植株和8株转FaGST基因拟南芥植株;8株转基因拟南芥植株的FaGST基因表达量为1.31~2.06,较野生型拟南芥植株表达量(1.00)显著或极显著提高。

【结论】成功获得拟南芥转基因纯合植株,FaGST基因在拟南芥植株中已过量表达。

【总页数】5页(P21-25)【作者】陈锡;陈莹;刘晓霞;刘重阳;吴溪;姚文琴;王小利【作者单位】贵州省草业研究所;贵州大学生命科学学院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室/喀斯特山区植物资源利用与育种国家地方联合工程研究中心【正文语种】中文【中图分类】S505.53;Q943.2【相关文献】1.AtNUDT8过量表达的拟南芥转基因植株2.拟南芥PTR3基因过表达载体构建及转基因植株的获得3.拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定4.拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定5.拟南芥醛还原酶编码基因 At3g04000表达模式分析及过量表达转基因植株获得因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

拟南芥AtJ2基因植物超量表达载体的构建杨礼香;王正询;柯德森;巫锦雄;黎钰汝【期刊名称】《广州大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(009)004【摘要】在胁迫条件下,分子伴侣可以稳定蛋白质结构,防止蛋白质凝聚变性,并修复受伤害蛋白.J蛋白是一类重要的分子伴侣.AtJ2是拟南芥(Arabidopsis thaliana)J蛋白中的一种.为研究该基因的功能,提取了拟南芥幼苗的总RNA,经过RT-PCR获得了AtJ2的全长.并将其构建入表达载体pMD中,得到重组质粒pMD/AtJ2.通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)将此重组质粒转化入拟南芥,得到了转基因植株,为后续该基因的功能研究奠定基础.【总页数】4页(P37-40)【作者】杨礼香;王正询;柯德森;巫锦雄;黎钰汝【作者单位】广州大学,生命科学学院,广东,广州,510006;广州大学,生命科学学院,广东,广州,510006;广州大学,生命科学学院,广东,广州,510006;广州大学,生命科学学院,广东,广州,510006;广州大学,生命科学学院,广东,广州,510006【正文语种】中文【中图分类】Q942【相关文献】1.花生AhPLDα基因植物过表达载体构建及对拟南芥的遗传转化 [J], 刘义杰;陈四龙;程增书;王瑾;宋亚辉;郝军会;张朋娟;李玉荣2.小麦atpC基因植物超量表达载体的构建 [J], 关尔鑫;魏鑫;李玥莹;王凤涛;蔺瑞明;徐世昌3.紫花苜蓿半胱氨酸合酶基因MsSDCS-0植物GFP荧光表达载体构建与拟南芥转化 [J], 赵菲佚;马家琦;安建平;焦成瑾;马伟超4.枯草芽孢杆菌突变株proBA基因植物表达载体的构建及转基因拟南芥的耐盐性能初探 [J], 曾永辉;陈喜涵;苗丽霞;曹军卫5.拟南芥AtJ2基因定位表达载体的构建 [J], 杨礼香;王正询;柯德森;巫锦雄因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。