15-AtCS82基因T—DNA插入突变体筛选和过表达转基因植株的获得
- 格式:pdf
- 大小:895.19 KB
- 文档页数:6
转基因植物的筛选与鉴定随着植物转基因技术的不断进步,它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导,利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
标签:拟南芥;转基因植物;筛选1 文献综述1.1 转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA,细胞组织培养等方法,将外源基因导入到植物的组织或细胞中,获得转基因植物的技术[1]。
从转基因植株成功之后,转基因技术飞速发展,如今,植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2 基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索,现已发现多种基因转化的方法,例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法,农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点,但对宿主细胞有着严格的要求。
每种方法都有其优缺点,所以根据植物的不同种类,我们要选择合理的转化方法,达到理想的转化效果。
1.3 本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展,已经成为许多国家重点发展的新目标新领域,它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究,由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步,改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象,通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。
借由本次实验研究,可深入了解基因工程等相关领域的理论,可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。
2 转基因植物的筛选与鉴定2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥2.1.2 载体与菌株重组表达载体PMDC150-35S(由实验室提供)、农杆菌菌株GV31012.1.3 主要试剂75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素(重组表达载体含有的抗性)、利福平2.1.4 培养基LB培养基:5g/L酵母提取物,10g/L蛋白胨,10g/L NaCl,15g/L琼脂(只固体培养基添加)1/2MS培养基2.2 实验方法2.2.1 拟南芥种植:将种子放在浸过水的滤纸上,放在4℃的冰箱中,不见光培养24小时,然后取出种子种在营养土里,在光照强度8000Lux,温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。
植物低温胁迫适应性应答综述摘要:对植物低温胁迫适应性应答的研究进展,包括低温诱导蛋白、低温转录因子、低温信号转导、不饱和脂肪酸酶,以及低温次级氧胁迫进行了综述。
关键词:植物;低温胁迫;适应应答低温胁迫包括0-12℃之间的冷胁迫(chillingstress)和0℃以下的冰冻胁迫(freezing stress)两种。
它是一种严重的自然灾害,不仅限制作物的区域分布和生存,还对作物产量有很大影响。
探讨植物在低温胁迫下的生理生化变化及其抗寒冻机理。
对改善作物抗寒冻性能,提高经济作物产量,改善环境绿化状况均有十分重要的理论与经济意义和社会效益,是人们关注和研究解决的植物生理学和农业问题之一。
1 低温胁迫下的植物损伤环境温度改变会引起物质在水溶液中发生物理化学变化。
随着温度降低,水分子的粘滞性可以增大几倍。
使得溶剂以及水分子的扩散速率下降,盐的溶解性也降低,而气体的溶解性增大。
生物体缓冲系统的pH提高。
另外,细胞结冰往往伴随着脱水。
使细胞内渗透压增大,细胞体积缩小。
质膜系统和细胞骨架受到损伤,气体交换受阻,生物大分子结构改变并导致功能丧失,有害物质积累,植物细胞器如线粒体、叶绿体、核糖体的结构与功能也受到影响。
植物体内包括光合、呼吸、生长发育、代谢、蒸腾以及营养水分吸收等在内的几乎所有的生命活动都会不同程度地受到寒冷胁迫的干扰。
有关植物冷害的最早学说是Lyons在1973年提出的“膜脂相变”学说。
该学说认为,与热激胁迫所引起的蛋白质变性以及折叠受阻不同,低温对冷敏感植物的伤害首先是改变了磷脂双层膜的膜相,尤其是改变了质膜的空间构象和物理状态,使从片层(lamellar)转变为非片层(non-lamellar)或六方晶Ⅱ(hexagonalⅡ),从液晶相转变为凝胶相。
膜相的改变可能抑制细胞膜发挥正常功能,而构象的改变影响了膜的稳定性,使蛋白质从膜上解聚下来,发生膜融合。
2低温胁迫对植物细胞生物学和生物化学的响应虽然植物不能像动物那样靠运动来趋利避害,但在长期进化过程中也形成了多种在寒冻环境下生存的适应机制,包括被动适应机制和主动适应机制。
押广东卷基因工程1、(2023广东高考)种子大小是作物重要的产量性状。
研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。
通过遗传分析和测序,发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割,用DNA连接酶将两者连接。
为确保插入的DAI基因可以正常表达,其上下游序列需具备_________。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。
在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图),用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________(填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见下,在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。
2、(2022广东高考)“绿水逶迤去,青山相向开”大力发展低碳经济已成为全社会的共识。
押广东卷基因工程1、(2023广东高考)种子大小是作物重要的产量性状。
研究者对野生型拟南芥(2n=10)进行诱变筛选到一株种子增大的突变体。
通过遗传分析和测序,发现野生型DAI基因发生一个碱基G到A的替换,突变后的基因为隐性基因,据此推测突变体的表型与其有关,开展相关实验。
回答下列问题:(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DAI基因转入突变体植株,若突变体表型确由该突变造成,则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DAI基因,用限制性核酸内切酶对PCR产物和_________进行切割,用DNA连接酶将两者连接。
为确保插入的DAI基因可以正常表达,其上下游序列需具备_________。
(3)转化后,T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。
在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下,选出单一位点插入的植株,并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图),用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交,将T1代种子播种在选择培养基上,能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基,选择阳性率约_________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_________(填“自交”、“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基,阳性率达到_________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变,研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段,再使用限制性核酸内切酶X切割产物,通过核酸电泳即可进行突变检测,相关信息见下,在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑_________。
【答案】(1)野生型(2)①. 载体(基因表达载体)②. 启动子和终止子(3)①. DAI基因和卡那霉素抗性基因②. 75 ③. 自交④. 100 ⑤. 【解析】【分析】1、基因突变是基因结构的改变,包括碱基对的增添、缺失或替换;基因突变发生的时间主要是细胞分裂的间期;基因突变的特点是低频性、普遍性、少利多害性、随机性、不定向性。
高级植物生理学04盐胁迫及其它盐胁迫全世界约有1/3的盐渍化土壤,我国约有250 多万公顷的各种盐渍土壤,主要分布在沿海地区或内陆新疆、甘肃等西北干旱、半干旱地区。
随着工业污染加剧、灌溉农业的发展和化肥使用不当等原因, 次生盐碱化土壤面积有不断加剧的趋势。
这些地区由于土壤中含有较多的盐类植物常受盐害而不能正常生长和存活,给农业生产造成重大损失。
植物耐盐机理和耐盐作物品种的培育已成为当前的研究热点之一。
综合治理盐渍土、提高植物的耐盐性、开发利用盐水资源已成为未来农业发展及环境治理所亟待解决的问题。
钠盐是形成盐分过多的主要盐类,NaCl和Na2SO4含量较多称为盐土,Na2CO3与NaHCO3含量过多称为碱土。
自然界这两种情况常常同时出现统称为盐碱土。
一、盐胁迫对植物的伤害机理盐害包括原初盐害和次生盐害。
原初盐害是指盐离子的直接作用,对细胞膜的伤害极大;次生盐害是指盐离子的间接作用导致渗透胁迫,从而造成水分和营养的亏缺。
1、生理干旱。
土壤盐分过多使植物根际土壤溶液渗透势降低,植物要吸收水分必须形成一个比土壤溶液更低的水势,否则植物将受到与水分胁迫相类似的危害,处于生理干旱状态。
如一般植物在土壤盐分超过0. 2 %~0.5 %时出现吸水困难,盐分高于0. 4 %时植物体内水分易外渗,生长速率显著下降,甚至导致植物死亡。
2、直接盐害。
(1)细胞内许多酶只能在很窄的离子浓度范围内才有活性,从而导致酶的变性和失活,以致于影响了植物正常的生理功能和代谢。
高浓度盐分影响原生质膜,改变其透性,盐分胁迫对植物的伤害作用,在很大程度上是通过破坏生物膜的生理功能引起的。
盐胁迫还可影响膜的组分用NaCl 和NaCO3溶液处理玉米幼苗发现膜脂中不饱和脂肪酸指数降低,饱和脂肪酸指数相对增多,这也证明了盐离子能影响膜脂成分的组成。
(2)植物吸收某种盐类过多而排斥了对另一些营养元素的吸收,导致不平衡吸收,产生单盐毒害作用,还造成营养胁迫。
第39卷第3期 2013年6月 湖南农业大学学报(自然科学版) Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences) Vb1.39 NO.3
Jun.2013 D0I:10.3724/SRJ.1238.2013.00253
AtCS82基因T—DNA插入突变体筛选和 过表达转基因植株的获得
陈锦华 ,郭磊 ,易力雄 ,刘春林 ,阮颖 (湖南农业大学a.生物科学技术学院;b.农学院,湖南长沙410128)
摘 要:AtCS82是拟南芥中一个功能未知的基因,推测该基因可能与种子油脂合成代谢相关。为探明AtCS82基 因的功能,采用半定量RT-PCR法对AtCS82基因在拟南芥不同组织(茎、叶、花、果荚)中的表达情况进行了分析, 发现其在果荚中的表达量较高,而在茎、叶、花中的表达量明显偏低,推测AtCS82基因可能参与种子发育;使 用三引物法对T-DNA捅入突变体进行纯合子筛选,并通过RT-PCR检测纯合子植株中AtCS82基因的表达情况, 试验结果证明获得了稳定遗传的AtCS82基因沉默纯合突变体;通过构建pCAMBIA1300-35S::CS82过表达载体, 并转化拟南芥哥伦比亚野生型(Co1)的方式,获得了AtCS82基因的过表达转基因植株。
关键词:拟南芥;AtCS82基因;纯合子筛选;过表达;转基因植株 中图分类号:Q786 文献标志码:A 文章编号:1007—1032(2013)03—0253 ̄06
Screening of T-DNA insertion mutants and construction of plants with AtCS82 over expressed
CHEN Jin—hua ,GUO Lei ,YI Li—xiong ,LIU Chun—lin ,RUAN ring (a.College ofBioscience and Biotechnology;b.College ofAgronomy,Hunan Agricultural University,Changsha 410128 China)
Abstract:The function of AtCS82 gene in Arabidopsis is still unknown,but it is supposed to be associated with seed oil anabolism.To investigate the function of AtCS82 gene,semi—quantitative RT-PCR was used to analyze the expression of AtCS82 gene in different tissues ofArabidopsis(stem,leaf,flower,pod),the results show expression ofAtCS82 gene was high in pod,but low in stem,leaf and flower,indicating the participation of AtCS82 gene in seed development.Three primers were used to screen homozygous mutants with T-DNA insertion,and the expression of AtCS82 gene in homozygous mutant plant was tested using RT-PCR,the results proved the obtaining of stable pure mutant with AtCS82 gene silenced.AtCS82一overexpressing transgenic plants were obtained by constructing pCAMBIA 1 300-35S::CS82 recombinant plasmid,followed by transforming into Arabidopsis thaliana of Columbia ecotype(Co1).
Key words:Arabidopsis thafiana;AtCS82 gene;screening homozygous mutant;over expression;transgenic plants
目前,油菜已成为第 大经济作物 l,而菜籽 油已经成为第二大植物油[ 。油菜菜籽油产量及其 品质的提高一直是油菜育种工作者重点关注的问 题,而探寻脂肪酸代谢调控机理是油菜分子育种研 究的一项重要内容。目前,关于植物脂肪酸合成的 部位与主要生化过程的研究成果 较多,而对其 分子调控机理的报道较少。甘蓝型油菜为异源四倍 体,且生长周期较长,研究难度较高。相比之下,
收稿19期:2013 ̄)3—13 基金项目:同家自然科学基金项目(31071455) 作者简介:陈锦华(1989一),女,湖南新化人,硕士研究生,主要从事植物分子生物学研究,kongbai122@yahoo.tom.cn; 通信作者,
yingruan@ hotmail.com 254 湖南农业大学学报(自然科学版)http:llwww_hnndXb.tom 201 3年6月 同属十字花科的拟南芥具有植株小、生长周期短、 易于转化、基因组小且遗传信息丰富l6J等优点,加 之二者在基因组结构上有一定的保守性 引,拟南 芥中的许多功能基因与油菜中的同源基因具有相 似的功能[】引,这使得人们可以利用拟南芥的生物信 息和DNA资源,通过对拟南芥中同源基因的研究 来加快对油菜基因组的研究。 本课题组在系统分析油菜种子发育和代谢产 物转化过程的基础上,以开花后20 d和35 d的油 菜种子作为抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)的材料,构建了油菜种子发育中 同化产物转化2个关键时期的SSH文库L1 。以该 SSH文库为基础,分析EST序列【l ,并与拟南芥 基因比对,筛选得到一个同源性较高、预期与油脂 合成代谢相关的拟南芥基因序列,命名为AtCS82。 为了从分子水平研究AtCS82基因的功能,首 先需要获得AtCS82基因沉默的纯合突变体和过表 达转基因植株。笔者通过对T_DNA插人突变体的 筛选,获得了1株稳定遗传的AtCS82基因沉默纯 合突变体株系;通过构建pCAMBIA1300-35S::CS82 过表达载体,并转化拟南芥 rabidopsis thaliana)哥 伦比亚野生型(Co1),获得了AtCS82基因的过表达 转基因植株,现将结果报道如下。 1材料与方法 1.1 材料 拟南芥 rabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型 (Co1)由湖南农业大学植物发育与表观遗传调控实 验室保存;AtCS82基因T_DNA插入突变体cs82 种子购自美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中 心。将拟南芥种子播种于盛有浸透营养液的蛭石的 小钵中,避光4℃春化3 d,转至22℃、16 hf光1/8 h(暗)光周期下培养,每周浇灌1~2次营养液。以生 长45 d的Col野生型植株为试验材料,进行AtCS82 基因表达水平分析;以生长25 d的突变体植株为试 验材料,进行纯合子筛选。 1.2 AtCS82基因T_DNA插入纯合突变体的筛选 1.2.1拟南芥不同组织中AtCS82的表达水平检测 为了探寻AtCS82基因在拟南芥不同组织中的 表达水平,根据TAIR网站(http://www.arabidopsis. org)上公布的拟南芥AtCS82基因cDNA序列,采用 Primer Premier 5引物设计软件设计了1对引物 CS82一S/CS82-A。弓I物序歹U为:CS82一S,5r_ATGA GCTATTAAGTTTGTTGTAC-3 ;CS82-A,5"TCAC GGTTTAGGCCCG_=; 。 分别取生长45 d的Col野生型拟南芥的茎、叶、 花及生长4、7 d的果荚,采用Trizol法【l 6J提取各组织 的总RNA,将其反转录为cDNA,以CS82-S/CS82-A 为引物,进行PCR扩增。预期PCR产物大小为432bp。
1.2.2 T-DNA插入纯合子的三引物检测 使用三引物法 5J筛选T_DNA插入纯合突变体 (以下简称纯合突变体)基因型的鉴定需要3条引物 (LP、RP和BP),使用T_DNA Primer Desig网站 (http://signa1.salk.edu/tdnaprimers.2.htm1)提供的在线 工具设计所需的3条引物,序列分别为:CS82一 F(LP), 5r_GGCCTAGACCGAAAGCAATAC一3 ; CS82-R(RP).5 L CAACAACCGTTGTTTTTCCTG一 3 ;LBb 1.3(BP),5 r_TAGCATCTGAATTTCATAACC AATCTCGATACAC一3 。 将购买的突变体cs82种子播种于盛有蛭石的 小钵内,待植株生长25 d后,随机选取10株f编号 为cs82—1~cs82一lo)生长良好者,以Col野生型拟 南芥为对照,分别提取全基因组DNA,分别采用 LP/RP和BP/RP引物组合,以全基因组DNA为模 板进行PCR扩增,根据电泳结果判断该植株是否为 纯合突变体。LP/RP和BP/RP预期PCR产物大小 分别为1 220 bp和559~859 bp。
1.2.3纯合突变体中AtCS82表达的RT-PCR验证 根据表达部位分析试验的结果,选取适当生长 时期的已初步鉴定的纯合突变体和Col野生型拟南 芥的适当组织作材料,提取总RNA,反转录为 cDNA,以CS82一S/CS82-A为引物,进行RT-PCR 检测。
1.3 AtCS82基因过表达载体的构建 1.3.1引物设计及AtCS82全长CDS片段的克隆 根据TAIR网站上公布的拟南芥AtCS82基因 序列,采用Primer Premier 5引物设计软件设计1