GmHSFA1基因克隆及其过量表达提高转基因大豆的耐热性

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(6): 1156−1160/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2002CB111302)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 何光源, E-mail: hegy@; Tel: 027-******** 第一作者联系方式: E-mail: chenglibao453@; Tel: 027-********Received(收稿日期): 2008-11-05; Accepted(接受日期): 2009-01-28.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01156表达大豆GMCHI基因能够提高原核生物耐低温性程立宝1,2李淑艳3景新明2何光源1,*1华中科技大学中英HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室 / 教育部分子生物物理重点实验室 / 生命科学与技术学院, 湖北武汉 430074; 2中国科学院植物研究所, 北京 100093; 3孝感学院生命科学与技术学院, 湖北孝感432000摘要: 低温是种子萌发过程中常见的自然灾害, 在我国北方经常发生, 这导致种子萌发率较差、降低植株活力等后果。

利用cDNA-AFLP技术从低温(4℃)吸胀24 h的抗低温吸胀大豆品种中黄22 (低温吸胀24 h对萌发率无影响的品种)中分离出一个基因片段, 命名为GMCHI (GenBank登录号为 EU699765), 通过RACE方法得到全长为387 bp的cDNA序列。

在NCBI数据库中的查询表明, GMCHI基因和数据库记录的基因序列同源性较低, 因此可以断定GMCHI是在大豆中被发现的新基因。

半定量RT-PCR显示GMCHI受ABA和PEG诱导。

该基因与PET30A连接后转入原核细胞, 经过IPTG诱导, 6% SDS-PAGE电泳条带说明, GMCHI在大肠杆菌中能够表达。

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(12): 2174 2179 /zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.02174大豆GmTINY1基因的克隆与表达分析黄方何慧迟英俊盖钧镒喻德跃*南京农业大学国家大豆改良中心/作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095摘要: 采用基因芯片技术, 从大豆中鉴定了一个荚优势表达基因。

利用生物信息学的方法, 拼接了该基因的全长序列, 并通过RT-PCR克隆了该基因。

Blast检索分析表明, 该基因编码一个具有AP2结构域的转录因子, 且与拟南芥DREB类蛋白TINY的氨基酸相似度最高, 将该基因命名为GmTINY1。

GmTINY1包含一个735 bp的开放阅读框, 编码244个氨基酸残基。

GmTINY1与拟南芥TINY和TINY2蛋白的相似度分别为59%与62%。

系统发生分析表明, GmTINY1、TINY和TINY2位于一个分支, 且同属于DREB亚家族。

实时定量RT-PCR检测表明, GmTINY1基因在荚中高丰度表达, 在花中的表达量也较高, 在根中的表达量较低, 而在叶片中未检测到表达。

基因芯片信息分析结果表明, GmTINY1在种子发育的子叶期的种脐部分高丰度表达。

由此推论, GmTINY1基因在大豆生殖器官发育中可能发挥调控作用, 可能与种子发育过程中种脐的形成有关。

关键词: 大豆；转录因子；AP2；TINY；DREBCloning and Characterization of GmTINY1 Gene in Soybean (Glycine max)HUANG Fang, HE Hui, CHI Ying-Jun, GAI Jun-Yi, and YU De-Yue*National Center for Soybean Improvement / National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural Univer-sity, Nanjing 210095, ChinaAbstract: Plant reproductive development involves the coordination of a lot of genes encoding transcription factors. The AP2 domain transcription factors have been proved with critical roles in plant reproductive development. By microarray analysis, we identified a gene which showed higher expression in pod as 500 folds as that in leaf of soybean. The Blast searches indicated this gene encodes a dehydration responsive element binding protein (DREB)-like protein showing highest similarity to Arabidopsis TINY, therefore named as GmTINY1. By searching soybean genome and EST databases, the putative full-length cDNA sequence for GmTINY1 was in silico assembled. The GmTINY1 gene was cloned from soybean seeds at 15 DAF (days after flowering) by RT-PCR. GmTINY1 contained a complete open reading frame (ORF) of 755 bp which encoded a peptide of 244 amino acids. The predicted molecular mass and isoelctric point of GmTINY1 are 26.76 kD and 5.12, respectively. An AP2 domain and a Ser-rich domain were identified in GmTINY1 amino acid sequence by Motif Scan server. The GmTINY1 encoding product showed 59% and 62% sequence similarities with Arabidopsis TINY and TINY2, respectively. Multiple sequences alignment revealed that a highly conserved AP2 domain was present in each AP2 domain transcription factor. In this AP2 domain, it was found that a Ser66 was specifically present in GmTINY1, DREB1B, TINY and TINY2 proteins but a Cys66 in DREB1A and DREB1C proteins, in-dicating, like Arabidopsis TINY, TINY2 and DREB1B, GmTINY1 might be able to bind both the dehydration responsive ele-ment(DRE) and ethylene responsive element (ERE) motifs while DREB1A and DREB1C only bind DRE motif. Besides, it was found that a Ser-rich domain probably involving translational modification on GmTINY1 protein was located close to AP2 do-main. The neighbor-joining phylogenetic tree showed that the AP2 domain transcription factors were grouped into four subfami-lies: DREB, ERF, AP2, and RA V; and GmTINY1, TINY, and TINY2 were grouped into a branch which attributed to the DREB subfamily. With an attempt to understand the biological role for GmTINY1 and to verify the microarray result, we used the Real-time quantitative PCR approach to analyze the expression pattern of GmTINY1 in various soybean organs. We found that expression of GmTINY1 was the highest in pod, relatively lower in flower and root, but undetectable in leaf, indicating that GmTINY1 may play some roles in soybean reproductive organs and root, but not in leaf. The Blast search results against soybean本研究由国家自然科学基金项目(30771362和30800692)，教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(200803071018)，江苏省自然科学基金项目(BK2008334)和南京农业大学青年创新基金项目(KJ08002)资助。

摘要氨基酸通透酶（AAP）在植物吸收和转运氨基酸的过程中发挥至关重要的作用。

拟南芥AtAAP1是植物中发现的第一个氨基酸转运蛋白，在水稻、玉米、马铃薯、豌豆、蚕豆、菜豆等农作物中也有较多报道。

目前，关于大豆GmAAP的研究却较为少见，AAP 能提高豆科植物对外源氮的吸收与利用率，增加种子内贮藏蛋白含量，进而提升大豆品质。

本研究从大豆中成功克隆出GmAAP基因，对其进行生物信息学分析和亚细胞定位，明确该基因行使功能的区域；同时分别在大豆和转基因拟南芥中对该基因的表达模式进行研究；通过20种编码氨基酸亲和试验，结合转GmAAP基因拟南芥种子中20种编码氨基酸含量的试验结果，明确GmAAP蛋白对氨基酸的吸收特性；通过单一氨基酸培养试验，测定转基因大豆发根GmAAP基因表达和氮代谢关键酶活性，旨在解析GmAAP 基因与氮代谢的关系。

试验结果可为GmAAP功能的研究奠定基础，同时也为大豆氮素的高效利用提供候选基因。

主要结果如下：1. 以大豆Williams 82为试验材料，通过RT-PCR同源克隆到GmAAP基因，其开放阅读框长度为1440 bp，编码479个氨基酸。

生物信息学分析表明，GmAAP蛋白分子量为53.286 kD，理论等电点为8.93，不稳定指数为34.04，蛋白结构稳定；各二级结构占据比例为α-螺旋（47.18%）、β-转角（2.71%）、β-折叠（15.66%）、无规卷曲（34.45%）；跨膜区与疏水性分析显示其含有10个跨膜区，且构成跨膜区的氨基酸多为疏水性氨基酸；GmAAP与野生大豆GsAAP亲缘关系最为相近，且序列比对一致性为100%，与绿豆、木豆、蒺藜苜蓿一致性依次为91.93%、90.55%、82.78%，且其10个跨膜区序列较为保守。

构建融合表达载体，利用PEG-Ca2+介导法转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析，明确了GmAAP定位在质膜上。

2. 通过荧光定量PCR分析GmAAP基因在大豆中的表达模式，发现其主要表达部位是根和叶，其次是果荚和种子，在茎和花中表达量最低。

大豆蔗糖代谢相关基因GmCInv1和GmSPP1的克隆及功能分析菜用大豆是一种重要的豆类蔬菜,指处于鼓粒末期(R6-R7)籽粒饱满,荚和籽粒翠绿色,但籽粒尚未完全成熟的大豆。

食味品质是菜用大豆的重要品质要素,籽粒的蔗糖含量是食味品质中的甜味因子。

本研究以菜用大豆品种“南农菜豆6号”为材料,克隆了参与蔗糖合成和代谢的两个酶的基因GmCInv1和GmSPP1,并对两基因的表达模式及功能进行初步分析,旨在了解这些基因对组织中糖分累积及植物生长发育的影响。

主要试验结果如下: 1.菜用大豆不同组织中蔗糖含量变化随着大豆籽粒的发育,籽粒中的蔗糖含量在花后15天(DAF15)到DAF30天是逐渐升高的,DAF30-35天蔗糖含量降低,DAF35-DAF50蔗糖含量升高。

大豆花期根和花等组织中的蔗糖含量较高。

2.GmCInv1基因的克隆及序列分析以编码拟南芥细胞质转化酶基因序列为探针,通过电子克隆方法,从菜用大豆中克隆得到编码大豆细胞质转化酶GmCInv1基因。

序列分析发现GmCInv1包含一个长为1668bp的开放阅读框,编码555个氨基酸,推测蛋白质的分子量是63.20kD。

GmCInv1与百脉根细胞质转化酶Ljinv1氨基酸序列相似性达到92%。

3.GmCInv1基因的表达模式分析和功能分析利用实时定量PCR对GmCInv1基因的组织特异性进行分析。

结果显示,GmCInv1在大豆籽粒的不同发育时期表达量不同,呈先升高后降低的趋势,在DAF35天是表达量最高。

GmCInv1在苗期根部和花中的表达量较高,在茎中表达量最低。

随着叶片的发育,叶片初期的GmCInv1表达量很低,后期GmCInv1表达量却很高。

将GmCInv1转化拟南芥进行过表达分析,与对照相比转基因株系糖分组成发生变化,叶片中蔗糖含量降低,葡萄糖含量升高,但种子蔗糖含量与野生型相比并无显著差异。

转基因GmCInv1拟南芥的生长发育受到影响,莲座叶数目增加,开花延迟。

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2022, 48(4): 851 859 / ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2022.13013过表达ZmCIPKHT基因增强植物耐热性许静1高景阳1李程成2宋云霞1董朝沛1王昭1李云梦1栾一凡1陈甲法2周子键2,*吴建宇1,2,*1 河南农业大学农学院, 河南郑州 450002; 2河南农业大学生命科学学院, 河南郑州 450002摘要: 高温胁迫对植物正常生长发育及产量的影响越来越显著。

为了适应外界环境的变化, 植物进化出了一系列应对高温胁迫的分子遗传机制。

类钙调磷酸酶B蛋白(CBL)互作蛋白激酶(CIPK), 在ABA信号转导途径上积极参与植物对高温胁迫的响应。

在前期全基因组关联分析的基础上, 本实验克隆了一个与玉米耐高温性状相关的候选基因ZmCIPKHT, qRT-PCR结果表明ZmCIPKHT基因受高温胁迫的显著诱导。

室内表型鉴定的实验发现过表达ZmCIPKHT的转基因拟南芥植株在高温胁迫下, 比野生型的存活率显著提高, 生长状态更好。

玉米原生质体瞬时转化实验证明ZmCIPKHT蛋白定位于细胞核中。

酵母双杂交实验验证了ZmCIPKHT蛋白与玉米CBLs家族中的ZmCBL4蛋白存在互作关系。

同时, ZmCIPKHT转基因拟南芥在高温胁迫条件下, 脱落酸(ABA)通路相关基因的表达水平有其相应的变化, 揭示了ZmCIPKHT可能依赖于ABA信号转导通路来增强植物的耐热性。

这些结果为解析玉米CBL-CIPK信号通路依赖于ABA途径对植物非生物胁迫响应的分子机制提供了新的实验根据。

关键词:玉米; 耐热性; 蛋白激酶; CBL-CIPK; ABA信号通路;Overexpression of ZmCIPKHT enhances heat tolerance in plantXU Jing1, GAO Jing-Yang1, LI Cheng-Cheng2, SONG Yun-Xia1, DONG Chao-Pei1, WANG Zhao1,LI Yun-Meng1, LUAN Yi-Fan1, CHEN Jia-Fa2, ZHOU Zi-Jian2,*, and WU Jian-Yu1,2,*1 College of Agriculture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China;2 College of Life Science, Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002, Henan, ChinaAbstract: The effects of high temperature stress on the normal growth and yield of plants is more and more serious. To adapt thechanges of external environment, plants have evolved a series of molecular genetic mechanisms to respond to high temperaturestress. The calcineurin B-like protein (CBL) interacting protein kinase (CIPK) is actively involved in response to high temperaturestress depended on ABA signal transduction pathway in plants. Based on previous genome-wide association analysis, a candidategene ZmCIPKHT related to maize high temperature tolerance was cloned in this study. Real-time quantitative PCR results showedthat ZmCIPKHT gene was significantly induced by high temperature stress. Transient transformation of maize protoplasts revealedthat ZmCIPKHT was localized in the nucleus. Overexpressing ZmCIPKHT plants of transgenic Arabidopsis thaliana had signifi-cantly higher survival rate and better growth status than wild type under high temperature stress. The yeast two-hybrid experimentconfirmed that the interaction between ZmCIPKHT protein and ZmCBL4 protein in maize CBLs family. The relative expressionlevels of genes related to abscisic acid (ABA) pathway in transgenic Arabidopsis thaliana with ZmCIPKHT under high tempera-ture stress were changed accordingly, indicating that the regulations of ZmCIPKHT genes under high temperature stress were inthe ABA-dependent pathway. These results provide a new experimental basis for elucidating the molecular mechanism of maizeCBL-CIPK signaling pathway dependent on ABA pathway to abiotic stress in plants.Keywords: maize; heat tolerance; protein kinase; CBL-CIPK; ABA signal pathway玉米是一种重要的食品、饲料以及工业原料, 在我国粮食生产安全中占领重要地位。

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(1): 76−83 /zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00076大豆GmTIP1;1基因的克隆与表达分析张大勇1胡国民3易金鑫1,*许玲1 Ali ZULFIQAR 4刘晓庆1袁玲玲2徐照龙1,2何晓兰1黄益洪1马鸿翔11江苏省农业生物学重点实验室 / 江苏省农业科学院农业生物技术研究所, 江苏南京 210014; 2南京农业大学农学院, 江苏南京210095; 3扬州大学生物科学与技术学院, 江苏扬州225009, 4 Department of Plant Breeding and Genetics, University of Agriculture, Fais-alabad 38040, Pakistan摘要: 利用RT-PCR方法从大豆根部组织获得Glyma03g34310.1开放阅读框(ORF)全长, 经测序验证、Blast比对与同源性分析发现该序列编码的蛋白质与其他植物的TIP1;1蛋白具有较高的相似性, 故命名为GmTIP1;1基因(GenBank登录号为AK285481), 该基因ORF长753 bp, 编码1个包含250个氨基酸的蛋白, 在ORF内部第381个核苷酸处含有1个94 bp的内含子, 符合↓GT--AG↓的剪接方式; 系统进化树分析发现GmTIP1;1聚类到豆科植物分支,其他不同科的植物也有规律地聚到了不同分支, 推测该蛋白氨基酸序列可以作为植物分类的依据之一; 半定量RT-PCR结果表明该基因在大豆的不同器官、不同器官的不同发育阶段均具较高且同等的表达水平, 暗示该基因在植物的整个发育进程中均具重要作用; 在盐胁迫的不同时间点其表达量有下降的趋势, 但仍然保持较高的表达水平;以pYES2为酵母表达载体, 转化酿酒酵母INVSc1菌株, 获得重组酵母INVSc1 (pYES2-GmTIP1;1), 转化菌株在盐胁迫下的存活率明显高于对照INVSc1 (pYES2), 而在干旱胁迫下则没有显著差异, 表明该基因的表达能有效地提高酵母的耐盐性。