分子生物学实验室常见实验

生物化学与基础分子生物学实验本实验旨在增进学生对于生物化学与基础分子生物学知识的理解，同时也希望借此机会增强学生的实验动手能力和实验数据分析能力。

本实验主要分为两部分，第一部分是生物化学实验，主要包括蛋白质的提取、纯化和酶促反应的研究。

第二部分是基础分子生物学实验，主要涉及DNA的提取、PCR扩增和凝胶电泳检测等。

一、生物化学实验1. 蛋白质的提取蛋白质的提取是研究蛋白质功能和结构的基础。

常用的蛋白质提取方法有机械破碎法、化学破碎法和生物学破碎法等。

本实验以细胞生物学破碎法为主要方法，即利用超声波或手工研磨等方法将细胞破碎。

其中，手工研磨可以选择石英砂或三氧化二铬等研磨介质。

破碎过程中需加入适量浓度等渗液和抑制剂，以防止蛋白质的降解和氧化。

2. 蛋白质的纯化蛋白质的纯化是进一步研究蛋白质结构和功能的关键。

常用的蛋白质纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、透析、亲和层析和电泳等方法。

本实验以离子交换和凝胶过滤为主要方法。

其中，离子交换可利用正离子交换和负离子交换两种模式进行，考虑到蛋白质电荷状态的不同以及离子交换树脂的不同选择，从而使得目标蛋白质与其它蛋白质的区分度大大增加。

凝胶过滤则利用凝胶的孔径大小进行分离纯化。

3. 酶促反应的研究酶促反应是生物化学研究的重要组成部分，可以研究酶的特性、动力学以及酶对于特定底物和抑制剂的亲和性等。

本实验选择酶促细胞色素C氧化为模型反应。

反应中需要考虑诸多因素，如温度、pH、反应时间等，同时还需考虑反应体系中酶、底物和抑制剂的摩尔比例关系。

二、基础分子生物学实验1. DNA的提取DNA的提取是基础分子生物学实验的关键步骤，其目的是提高纯度和量。

常用的DNA提取方法有化学法、机械法、热平衡法和离心法等。

本实验以盐酸摇法为主要方法进行DNA的提取。

其中将细胞经过适当处理后加入盐酸和β-己糖苷酯，在恒温和摇动条件下分离得到DNA。

2. PCR扩增PCR是分子生物学中的核心技术之一，是一种复合酶链反应。

分⼦⽣物学实验中常见的问题与对策-9⼀、质粒提取常见问题分析与策略1.⽤试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？1）细菌⽼化请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进⾏液体培养。

2）细菌培养物⽣长过度或不新鲜不要于37℃培养超过16⼩时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。

3）质粒拷贝数低由于使⽤低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的⾼拷贝数载体。

4）菌体中⽆质粒有些菌体本⾝不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。

例如柯斯质粒在⼤肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。

另外检查筛选⽤抗⽣素使⽤浓度是否正确。

5）菌体过量，碱裂解不充分取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体⽤量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量。

对低拷贝数质粒，提取时可加⼤菌体⽤量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的⽤量（应保持1：1：1.4⽐例）。

6）溶液使⽤不当溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放⼊37℃⽔浴⾄完全溶解、澄清，⽅可使⽤。

7）质粒未全部溶解（尤其质粒较⼤时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8）⼄醇残留洗涤液Ⅱ洗涤后应离⼼并静置数分钟尽量去除残留⼄醇后，再加⼊洗脱液洗脱回收。

9）洗脱液加⼊位置不正确洗脱液应加⼊吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表⾯达到最⼤洗脱效率。

10）洗脱效率：洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液⽤量、洗脱次数、加⼊洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。

PH7.0－8.5之间，洗脱液⽤量不得⼩于50µl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃⽔浴预热可以有效提⾼得率30%。

2.试剂盒提取质粒纯度不⾼，如何解决？1）有蛋⽩质污染应在加⼊去蛋⽩液后，以⾜够⾼的转速离⼼，使沉淀紧密，并⼩⼼地吸取上清液，避免吸⼊沉淀。

另外，不要使⽤过多菌体。

经悬浮液、裂解液、中和液处理，离⼼后溶液应为澄清的，如果还混有微⼩蛋⽩悬浮物可再次离⼼去除后再进⾏下⼀步骤。

第1章绪论两个经典实验1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验：先将光滑型致病菌（S 型）烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌（R 型）分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力；当他们将经烧煮杀死的S 型细菌和活的R 型细菌混合再感染小鼠时，实验小鼠每次都死亡。

解剖死鼠，发现有大量活的S 型细菌。

实验表明，死细菌DNA 进行了可遗传的转化，从而导致小鼠死亡。

（执行者：美国著名的微生物学家Avery ）2、T2 噬菌体感染大肠杆菌：当细菌培养基中分别带有35S 或32P 标记的氨基酸或核苷酸，子代噬菌体就相应含有35S 标记的蛋白质或32P 标记的核酸。

分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌，经过1~2 个噬菌体DNA 复制周期后进行检测，子代噬菌体中几乎不含带35S 标记的蛋白质，但含30%以上的32P 标记。

说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA 而不是蛋白质。

（执行者：美国遗传学实验室科学家Hershey和他的学生Chase）噬菌体侵染细菌的过程：T2 噬菌体感染大肠杆菌实验：两个实验的主要论点论据：生物体吸收外源DNA （而非蛋白质）改变了其遗传潜能。

其他：基因的概念：基因是产生一条多肽链或功能RNA 分子所必需的全部核苷酸序列。

遗传密码的构成要素包括：DNA序列、mRNA 序列、密码子、反密码子、氨基酸、氨酰tRNA 和蛋白质序列。

朊病毒为一种具有传染性的蛋白质，但它仍然受正常细胞DNA序列的控制，是细胞内蛋白质在分子水平的病变。

分子生物学主要研究内容：重组DNA技术（基因工程）基因表达调控研究结构分子生物学基因组、功能基因组与生物信息学研究第2章染色体与DNA核苷酸通过3，5-磷酸二脂键连接形成链状的生物大分子。

每个核苷酸由磷酸、核糖（又称戊糖）和碱基构成2.1染色体2.1.1概述染色体包括DNA和蛋白质（组蛋白和非组蛋白），为遗传物质的主要载体。

性质：1、分子结构相对稳定；2、能够自我复制，使亲、子代之间保持连续性；3、能指导蛋白质的合成，从而控制生命过程；4、能产生可遗传的变异。

分子生物学实验指导主编:于冰马春泉高传军杨峰山主审:李海英黑龙江大学生命科学学院2006 年 3月目录绪论分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备................................................... 1 实验一植物基因组 DNA 的分离.................................... 6 实验二 RNA 的分离................................................... 11 实验三 DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测.............................. 15 实验四 DNA/RNA浓度、纯度的测定及浓度的调整............ 21 实验五聚合酶链式反应(PCR .................................... 24 实验六随机扩增多态性 DNA 反应(RAPD ..................... 28实验七甜菜 M14品系 AFLP 分析.................................... 32 实验八生物信息学 (49)前言黑龙江大学生命科学学院自成立以来,相继成立了生物工程专业,生物技术专业,生物制药专业和食品科学与工程专业。

分子生物学是一门二十一世纪的前沿学科,而实验操作是分子生物学的一个重要组成部分。

我们结合了我院现有的仪器设备及材料情况,为本科生设立了八个分子生物学实验项目(包括一个综合性实验项目 ,以使学生掌握分子生物学领域中最基本的实验技能。

本书编写充分考虑了实验的系列操作性,比如从基因组 DNA 、总 RNA 的提取到琼脂糖凝胶检测,从 DNA 浓度的调整到 PCR 技术,从分子标记技术到生物信息学分析等,完全贯穿了分子生物学的基本实验技术。

对生命科学学院的本科生来说是一本很好的实验教材。

实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl 或20 μl；连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；dNTP（10 mM）分装成50 μl；无菌水分装成1 ml；注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。

（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。

（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。

（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。

（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。

每人负责六个月。

其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。

由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。

二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。

2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。

3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。

4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。

注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。

5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。

在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。

6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。

注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。

表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/mlIPTG 1 M 0.05-0.6 mM五、基因扩增1．引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成（jinan@）。

分子生物学实验室常见实验
1.基因克隆：通过PCR扩增目标基因或外源基因，将其克隆到载体中，如质粒、病毒等，使其能够在宿主细胞中表达。

2. PCR：聚合酶链式反应，是一种可在体外扩增DNA序列的技术，适用于从少量DNA样品中扩增特定区域的DNA片段。

3. 蛋白质表达与纯化：通过基因克隆，将目标蛋白质表达于宿主细胞中，并通过蛋白质纯化技术将其纯化出来。

4. DNA测序：通过测序仪对DNA序列进行测定，可以用于基因组测序、基因突变分析等。

5. RNA干扰：通过RNA干扰技术，将RNA分子导入到细胞中，靶向特定的基因，从而抑制基因表达。

6. 细胞培养：将细胞放入培养皿中，提供合适的营养物，使其在体外生长并繁殖，可用于体外实验研究。

以上是分子生物学实验室常见实验，这些实验技术广泛应用于生命科学领域的基础研究和应用研究，为疾病诊断和治疗等方面提供了重要的科学支持。

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分子生物学实验报告慕蓝有志班梦想学院目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验八RT-PCR扩增目的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验十感受态细胞的制备及转化 (23)实验十一克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验十二地高辛标记的Southern杂交 (27)实验十三阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达 (31)思考题 (32)分子实验心得总结 (33)实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。

二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。

质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。

特别是常用的大肠杆菌。

大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。

它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。

当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。

然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。

最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。

此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。

培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。

实验室中最常用的是LB培养基。

三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1. 胰蛋白胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养皿2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。