多克隆体制备与单克隆体制备对比

抗PLA2G13多克隆和单克隆抗体的制备与鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：李淑珍, 刘莹, 陈苗, 柳晓兰, 唐小波, 高建恩, 朱大岭, 孙启鸿【摘要】目的: 制备分泌型的磷脂酶A2 G13（group XIII secreted phospholipase A2, PLA2G13）的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）, 并对抗体进行特性鉴定。

方法: 以人正常肝cDNA 文库为模板, 构建重组表达质粒pGEX-4T-1-PLA2G13（即PLA2G13-GST）和pET-32a-PLA2G13（即PLA2G13-His）。

PLA2G13-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb和鼠mAb。

采用Western blot鉴定兔抗人PLA2G13 pAb的特异性。

采用Western blot 和Immunohistochemistry鉴定鼠抗人PLA2G13 mAb的特异性。

结果: PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白在均大肠杆菌中以包涵体形式大量表达。

Western blot鉴定表明, 兔抗人PLA2G13 pAb 可特异地识别HepG2细胞系中相对分子质量（Mr）约19700的蛋白, 与文献报道中PLA2G13的实际Mr相符。

通过筛选共获得8株可稳定分泌抗PLA2G13的杂交瘤细胞株, Western blot鉴定表明6株可识别重组人PLA2G13蛋白, 免疫组织化学鉴定显示2株可特异性识别正常肝组织中的PLA2G13蛋白。

结论: 成功地制备了抗人PLA2G13兔pAb和鼠mAb, 为进一步研究PLA2G13的功能提供了特异性检测工具。

【关键词】PLA2G13 原核表达融合蛋白抗体制备分泌型的磷脂酶A2 G13（group XIII secreted phospholipase A2, PLA2G13）是分泌型磷脂酶家族的成员之一, 基因定位于10q22.1, 包含195个氨基酸, 相对分子质量（Mr）约21400, 主要存在于细胞外基质, 成熟型PLA2G13 Mr约19700, 其结构特征类似于磷脂酶家族另一个成员PLA2G12, 但二者的组织分布呈现很大差别［1］。

单克隆抗体和多克隆抗体的区别一、单克隆抗体（一）单克隆抗体单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。

通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B 细胞杂交瘤。

1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。

将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。

利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。

这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。

（二）优势和局限性1．单克隆抗体的优点(1)杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。

(2)可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。

(3)由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如IRMA和ELISA等。

(4)由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。

2．单克隆抗体的局限性(1)单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。

由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。

(2)单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。

(3)制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高。

（三）应用1．检验医学诊断试剂作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。

单克隆抗体和多克隆抗体有很多区别首先1.制备上的区别经过特定抗原处理过的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞通过细胞融合的方法得到杂交瘤细胞，经HAT培养基筛选、ELISA检测效价后就得到阳性克隆株，最后进行细胞培养或将细胞注入到动物（一般为balb/c 小鼠）腹腔中用腹水培养，收集上清/腹水纯化后就能得到单克隆抗体。

而制备多克隆抗体就没有单克隆抗体繁琐，只需将抗原（纯度越高越好）直接注入到动物体内进行免疫，经过3~4次免疫，ELISA测其效价合格后，收集血液离心得到上清，纯化后即能得到多克隆抗体。

因此制备多抗的周期就比单抗的短，首次制备价格也比单抗要低。

2.应用上的区别单抗和多抗都有各自鲜明的特点与优势。

单克隆抗体的特异性高，一旦制备成功就可以永续的生产完全一致的抗体，因此可以对其特异性进行全面、系统地验证。

但如果所识别的抗原表位被破坏，实验的结果将会受到很大的影响，这也是单抗的缺点之一。

而多克隆抗体的特异性较差，即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限。

所以在用多抗做免疫检测时，更容易造成背景，例如在WB中有杂带，在IHC中背景较深等等。

虽然还存在着交叉反应*的问题，但由于多抗识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。

在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。

单抗与多抗的区别是什么摘要：本文主要介绍了单克隆抗体与多克隆抗体的定义，并介绍单抗、多抗在制备流程、特点及应用上的区别。

单抗与多抗的定义抗原上可以引起机体产生抗体的分子结构叫做抗原决定簇，也称为抗原表位。

一个抗原可以有许多不同的抗原决定簇，因此，机体也可以产生多种不同的抗体。

由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。

而由多个B淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体。

多克隆抗体与单克隆抗体的区别多克隆抗体特点：1.识别任一抗原上的多个表位。

所得血清为异质性抗体混合物，其亲和力各有不同。

2.多克隆抗体主要由 IgG 亚类组成。

3.通常使用多肽免疫原制备以独有表位为靶标的多克隆抗体，尤其是针对高同源性的蛋白家族。

抗体制备：制备成本低廉且制备速度较快。

制备过程比单克隆抗体简单。

优点：多克隆抗体可识别任一抗原上的多个表位，因此具有以下优点:a.高亲和性：由于靶蛋白上的多个表位能够结合不止一个抗体分子，多克隆抗体可放大低表达水平靶蛋白的信号。

但是，这会影响定量实验（如流式细胞术实验）结果的准确性。

b.可识别多个表位，有利于免疫沉淀 (IP) 和染色质免疫沉淀 (ChIP) 实验获得更好的结果。

c.与单克隆抗体相比，对微小抗原变化（例如多态性、糖基化异质性或者轻微变性）的包容性更强。

d.可识别与免疫原蛋白质具有高度同源性的蛋白质，还可用于筛查非免疫原物种的靶蛋白。

通常是检测变性蛋白质的首选。

f.多表位通常可提升检测的稳定性。

缺点：a.易产生批次间差异。

b.产生大量非特异性抗体，可能会在某些应用中产生背景信号。

c.由于具有多个表位，检测免疫原序列的交叉反应性非常重要。

d.不适用于探测抗原的特定结构域，因为抗血清通常会识别多个结构域。

单克隆抗体​特点：1.不易产生批次间差异。

2.仅由一种抗体亚型组成（例如 IgG1、IgG2、IgG3）。

如需使用二抗进行检测，应针对正确的亚类选择抗体。

抗体制备：技术要求较高。

应用技术之前需接受专门培训。

需要花费较长时间制备杂交瘤细胞。

优点：a.制得的杂交瘤细胞为持续且可再生产的单克隆抗体来源，而且所有批次均相同，有助于提升实验过程和实验结果的一致性和标准化水平。

b.单克隆抗体只检测每个抗原上的一个表位，因此具有以下优点:切片和细胞染色产生的背景信号更少。

特异性地检测一个靶表位，不易与其它蛋白质发生交叉反应。

由于具有高特异性，单克隆抗体非常适于用作实验中的一抗，其产生的背景染色信号通常显著低于多克隆抗体。

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多克隆抗体和单克隆抗体的用途盘点单克隆抗体的定义:单克隆抗体是仅与目标蛋白某一特定表位结合的单一抗体。

单克隆抗体的制备：简洁来说就是将免疫原注射到宿主动物体内产生免疫反应，之后把 B 细胞从脾脏中移出，单种 B 细胞与骨髓瘤细胞融合为 B 细胞杂交瘤，成为一个永生化胞株。

这样一来，杂交瘤的 B 细胞就会始终产出只识别单一表位的单克隆抗体，通常这个胞株会有一个特定的克隆号（clone number），用来与其他胞株区分。

杂交瘤接下来可以被注射到小鼠的腹腔中大量生产，杂交瘤分泌富含抗体的一种液体，被称作腹水，用注射器抽取纯化，就可获得大量的单克隆抗体。

多克隆抗体定义：多克隆抗体是指与目标蛋白上多种不同表位结合的多种不同抗体. 多克隆抗体制备：多克隆抗体的第一步和单克隆抗体一样，都是将免疫原注射到宿主体内产生免疫反应，激活了多种B细胞。

不同的是免疫过后，多克隆抗体就直接从免疫宿主的血清中分别出来，或接着进行纯化，没有与骨髓瘤细胞融合的过程。

一旦宿主动物死亡，需要免疫新的动物，这时血清中的抗体就会有所不同。

虽然多抗每批次有稍微差别，但是由于它识别的表位多，这个差别影响并不算太大，而单克隆抗体虽然价格偏高，可是特异性更强更稳定。

可以说单抗和多抗是各有各的优点。

多克隆抗体和单克隆抗体的用途：1、定义多克隆抗体和单克隆抗体有用性的两个关键特征涉及它们各自对抗原的特异性和灵敏度。

2、抗体的特异性是由其结合域和目标抗原之间的相对亲和力打算的，而其他分子是存在的。

对这种特异性的利用对免疫学讨论人员和临床医生来说是至关重要的，由于很多应用都是利用多克隆和/或单克隆抗体来特地检测目标分子。

结合抗原特异性，抗体的灵敏度是一个重要的参数，打算了它在试验室的有用性。

3、高灵敏度的抗体特别适用于诊断应用，如免疫沉淀、West Blot 和酶联免疫吸附试验（ELISA），由于它们能够识别低水平的目标抗原。

免疫沉淀是一种分析技术，通过使用特异性结合抗原的抗体将抗原从混合物中分别出来。

单克隆抗体的制备方法与应用一、前言单克隆抗体是指一种具有高度特异性和亲和力的抗体，其来源于单个B细胞克隆。

相比多克隆抗体，单克隆抗体更加纯净、稳定和可靠，因此在生物医学研究、诊断和治疗等方面有着广泛的应用。

本文将介绍单克隆抗体的制备方法与应用。

二、单克隆抗体的制备方法1. 免疫动物首先需要选取适当的动物进行免疫，通常选择小鼠或大鼠。

在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。

2. 免疫原选择选择合适的免疫原是制备单克隆抗体的关键步骤。

常见的选择包括蛋白质、多肽、细胞表面分子等。

在选择时需要考虑到其特异性、稳定性和可重复性等因素。

3. 免疫程序在进行免疫前需要对动物进行预处理，例如注射低剂量的抗生素来消除潜在的感染。

接着，将免疫原注射到动物体内，通常需要多次免疫以增强免疫效果。

在免疫过程中需要对动物进行监测，例如采集血样检测抗体水平。

4. 融合细胞的制备在获得足够的抗体后，需要从动物体内采集B细胞并与骨髓瘤细胞进行融合。

常用的骨髓瘤细胞包括SP2/0和NS0等。

5. 单克隆抗体筛选通过限稀法或单一细胞分离法等方法将融合细胞分离为单个克隆，并通过ELISA、免疫印迹等方法筛选出特异性较高的单克隆抗体。

接着对筛选出的单克隆抗体进行扩增和纯化等处理。

三、单克隆抗体的应用1. 生物医学研究单克隆抗体在生物医学研究中有着广泛的应用，例如作为特定蛋白质或分子的检测工具、用于药物开发和治疗等。

2. 诊断单克隆抗体在诊断方面也有着重要的应用，例如用于肿瘤标志物的检测、病原体的检测等。

3. 治疗单克隆抗体在治疗方面也有着广泛的应用，例如用于治疗癌症、自身免疫性疾病等。

其中一些单克隆抗体已经被批准为药物并用于临床治疗。

四、总结单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的抗体，在生物医学领域中有着广泛的应用。

其制备方法包括适当动物选择、合适免疫原选择、多次免疫程序、融合细胞制备和单克隆抗体筛选等步骤。