细胞生物学实验二细胞器的分级分离

实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。

一、实验背景与目的随着细胞生物学研究的不断深入，对细胞内不同结构和功能区域的了解日益重要。

细胞器分级分离技术作为一种重要的细胞生物学研究方法，能够有效地将细胞内各种细胞器分离纯化，从而便于研究其形态结构、化学组成和生理活性。

本实验旨在通过分级离心法，分离纯化细胞内线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，并对其形态和生化特性进行观察和分析。

二、实验原理细胞器分级分离法是利用细胞器大小、形状、密度等物理性质的差异，通过离心力将细胞器分离纯化的方法。

根据细胞器的大小和密度，选择合适的离心速度和时间，可以将细胞器分离成不同的层次。

通常，线粒体、内质网、高尔基体等细胞器在离心过程中分别位于不同的层。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 人胚胎肝细胞- 生理盐水- 0.25%胰蛋白酶- 10%Triton X-100- 线粒体提取缓冲液- 内质网提取缓冲液- 高尔基体提取缓冲液- 1%戊二醛固定液- 磷酸盐缓冲液（PBS）2. 实验仪器：- 离心机- 显微镜- 电子天平- 移液器- 离心管四、实验步骤1. 细胞悬液的制备：- 将人胚胎肝细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，待细胞生长至80%汇合度时，用生理盐水洗涤细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。

2. 细胞器的分离：- 将细胞悬液按1:1比例加入预冷的生理盐水，用移液器吹打细胞，使细胞分散均匀。

- 将细胞悬液转移至离心管中，在4℃、1500g下离心10分钟，弃去上清液，得到细胞沉淀。

- 向细胞沉淀中加入预冷的线粒体提取缓冲液，重悬细胞，在4℃、1500g下离心10分钟，弃去上清液，得到线粒体沉淀。

- 重复上述步骤，分别得到内质网和高尔基体沉淀。

3. 细胞器的观察和分析：- 将线粒体、内质网和高尔基体沉淀分别用1%戊二醛固定，进行电子显微镜观察。

- 对分离得到的细胞器进行生化分析，如酶活性测定、蛋白质含量测定等。

五、实验结果1. 细胞器的形态观察：- 线粒体：呈棒状、椭圆形或圆形，外被双层膜，内部有嵴和基质。

分离细胞器的方法细胞器是细胞内的重要结构，它们在细胞的生存和功能执行中起着至关重要的作用。

分离细胞器是细胞生物学和生物化学研究中的重要操作，可以帮助科研人员更好地了解细胞器的结构和功能。

下面将介绍几种常用的分离细胞器的方法。

一、差速离心法。

差速离心法是一种常用的分离细胞器的方法，通过利用细胞器的不同密度来进行分离。

首先，需要将细胞悬液置于离心管中，然后进行低速离心，使细胞器沉淀到离心管底部。

接下来，将上清液转移到另一个离心管中，进行高速离心，这样可以将不同密度的细胞器分离出来。

通过这种方法，可以获得相对纯净的细胞器样品。

二、梯度离心法。

梯度离心法是利用密度梯度离心离心细胞器的方法。

首先，需要制备密度梯度离心液，然后将细胞悬液均匀地加在离心管上，进行超速离心。

在离心过程中，不同密度的细胞器会在密度梯度中分层沉淀，从而实现分离。

这种方法可以得到高纯度的细胞器。

三、超声破碎法。

超声破碎法是一种利用超声波对细胞进行破碎，分离细胞器的方法。

首先，将细胞悬液置于超声破碎仪中，经过超声波的作用，细胞膜会破裂，释放出细胞器。

然后，通过差速离心或梯度离心的方法，可以将细胞器分离出来。

这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。

四、亲和层析法。

亲和层析法是利用生物分子之间的特异性相互作用来分离细胞器的方法。

通过将含有特定亲和基质的层析柱与混合细胞器悬液一起进行层析，利用细胞器与亲和基质之间的特异性结合来实现细胞器的分离。

这种方法可以得到高纯度的细胞器样品，适用于对细胞器纯度要求较高的实验。

五、离心上清法。

离心上清法是一种简单快捷的分离细胞器的方法。

首先，将细胞悬液进行差速离心，将上清液收集起来。

然后，通过连续的离心步骤，可以逐渐将不同密度的细胞器分离出来。

这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。

总结。

以上介绍了几种常用的分离细胞器的方法，每种方法都有其特点和适用范围。

在实际操作中，可以根据实验的需要选择合适的方法进行细胞器的分离，以获得满意的实验结果。

细胞组分的分级分离方法
细胞组分的分级分离方法包括密度梯度离心法、贴壁培养法、超速离心法、层析法和电泳法。

密度梯度离心法是根据细胞密度的不同，在高速离心机中经过长时间离心，使细胞分层沉淀，形成密度梯度。

根据密度梯度的不同，可以将不同密度的细胞分开。

这种方法分离效果好，可以获得较为纯的细胞，适用于大多数细胞类型的分离。

但这种方法需要使用大型设备，操作也比较复杂，需要专业人员操作。

贴壁培养法是根据细胞贴壁生长速度的不同，将不同种类的细胞分离。

这种方法需要在培养皿中加入适量的培养液，然后将待分离的细胞悬液加入培养皿中，让其在培养液中贴壁生长。

由于不同种类的细胞贴壁生长速度不同，因此经过一定时间的培养，可以观察到不同种类的细胞在培养皿中形成的“岛屿”状分布。

根据不同种类的细胞形成的“岛屿”状分布的不同，可以将它们分离出来。

此外还有超速离心法、层析法和电泳法等方法。

这些方法各有特点，可以根据实验需求选择合适的方法进行细胞组分的分级分离。

《细胞生物学》实验教学大纲（执笔人：张利平审核人：教学院长：）一、课程简介（一）课程代码：（二）课程名称：《细胞生物学》实验( Experiment of Cell Biology )（三）修读对象：生物科学及生物技术专业本科生（四）总学时与学分：27学时/3学分（五）考核方式：随堂测试（六）相关课程：医学细胞生物学、普通生物学、医学遗传学（七）内容提要：这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学实验教学编写的，适用于四年制生物科学及生物技术专业学生。

细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。

为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基本技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。

大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。

选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微观察、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞培养、细胞融合等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。

二、教学目的和教学方法：培养学生基本的细胞生物学实验方法并培养学生的实际动手操作能力，帮助学生形成基础实验研究思路，为后续的学习和实验研究打下基础。

全书内容共5个实验，针对各专业学生教学根据具体情况采用学生动手操作为主，部分操作教师演示示教为辅的方式结合进行。

三、教学学时分配总学时27，各实验学时分配如下：实验一：鸡血细胞的融合实验 6学时实验二：细胞器的分级分离 6学时实验三：微丝染色及形态学观察 5学时实验四：细胞中碱性蛋白的显示 5学时实验五：红细胞膜的通透性 5学时四、选用教材和主要教学参考书教材：《细胞生物学》翟中和主编高等教育出版社出版教学参考书：1.分子细胞生物学韩贻仁科学出版社2.细胞生物学王德耀上海科学技术出版社3.细胞生物学研究方法与技术(第二版) 刘鼎新北医、协和医大联合出版社4.细胞生物学实验(第二版) 杨汉民高等教育出版社1997年07月出版5.Molecular Biology of the Cell 4th Edition, Bruce Alberts et al.6.Molecular Cell Biology 4th Edition, Harvey Lodish et al.目录实验一鸡血细胞的融合实验 (5)实验二细胞器的分级分离 (6)实验三微丝染色及形态学观察 (7)实验四细胞中碱性蛋白的显示 (9)实验五红细胞膜的通透性 (10)实验一鸡血细胞融合实验【教学目的】1.掌握细胞融合的概念及基本原理。