B16细胞培养

细胞增殖快非常好养，但是要及时换液，否则也很容易死亡、或变形。

我养的最
好的时候，天天都在换液，两三天就要消化传代。

我用的消化液一般是消化用
含EDTA的胰酶0.25%，个人感觉效果比较好一点。

消化步骤：吸出培养液，加入PBS洗涤（视培养瓶大小加入相应的量，25CM加
入1-2ML）而后加一次胰酶（25CM培养瓶加0.6ML）作用 2-3分钟，轻轻摇晃使
均匀作用在细胞层面上。

要一直在显微镜下观察，以防消化过头，等细胞从梭形
变成椭圆形（或是棱角变钝），本来连成片的细胞之间开始有小小的空间，细
胞与细胞好象是一粒粒的，界限清楚，这时是消化的最佳时机。

（细胞的活力最
好，又非常容易吹打）加入培养液进行吹打十几次即可。

如果消化到细胞全部飘起来，就消化的稍微有点过了。

如果细胞的形态还是老样
子，就消化的有点不足，吹打起来十分费力，有大片的细胞就会贴在壁上，起不
来，而且很不均匀。

只好重新加胰酶消化。

还有就是细胞长的比较密时，胰酶可以比平时多加一点，消化时间适当延长。

雅吉货号中文名称英文名称种属组织来源形态学生长方式培养基血清
YJ255 小鼠黑色素瘤细
胞
B16 小鼠黑素瘤
成纤维细胞
样
贴壁RPMI-1640 C S
B16用加10%血清，加双抗的RPMI-1640培养液，0.25%胰酶消化对数生长期B16细胞，传代比约1:5.
倒置相差显微镜下，对数生长期品源B16细胞形态为梭形或不规则形。

非接触式共培养技术在体外细胞实验中的初步应用[ 07-09-17 10:40:00 ] 编辑：studa20作者：赵学铭，刘易欣，倪春生，赵秀兰，孙涛，古强，孙保存【关键词】 ,间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养,［摘要］目的研究与恶性黑色素瘤细胞进行非接触式共培养的间充质干细胞表型变化，从而明确非接触式共培养体系可以应用于两种细胞之间相互作用的研究。

方法利用Transwell进行非接触式共培养，分析间充质干细胞形态变化，利用免疫组织化学与免疫荧光检测其Ⅷ因子和CD34表达。

结果间充质干细胞在非接触式共培养体系中可以被恶性黑色素瘤细胞诱导为多角形或短梭形，同时Ⅷ因子和CD34表达上调。

结论初步表明与恶性黑色素瘤细胞非接触式共培养的间充质干细胞中部分细胞表型发生改变，明确非接触式共培养体系可以应用于MSC和恶性黑色素瘤细胞之间相互作用的研究。

［关键词］间充质干细胞；恶性黑色素瘤；非接触式共培养Primary application of in vitro cell research by indirect coculture system［Abstract］ Objective To study the phenotype change and interactions of mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by B16, a mouse malignant melanoma cell line.Methods Indirect coculture was based on transwell system to analyse the phenotype change of MSC. Determination of the expression of Ⅷ factors and CD34 by immunohistochemistry and immunofluorescence.Results MSC was form in polygon and fusiform induced by B16. Then the immunohistochemistry and immunofluorescence staining show Ⅷ factors and CD34 was upregulation of MSC.Conclusion The results of the indirect coculture experiments with B16 cell and MSC in vitro can initially confirm that parts of the MSC transform their phenotype, it means that indirect coculturesystem may used in cell interaction research in vitro.［Key words］ mesenchymal stem cells; malignant melanoma; indirect cocuuture间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是指存在于骨髓基质中的非造血组织的另一类重要的干细胞，它最显著的生物学特征是既有自我更新的能力，又具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的潜能［1,2］。

中华眼镜蛇毒组分C对B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用目的：研究中华眼镜蛇毒组分C（FC）对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞生长的抑制作用。

方法：采用MTT比色法、生长抑制实验、集落形成实验，探讨FC对小鼠B16黑色素瘤细胞株的毒性作用。

结果：FC对B16细胞有明显的毒性作用，处理细胞48 h，其IC50=1.75 μg/ml。

FC处理B16细胞24、48、72 h后，各时间点的细胞存活数随FC的浓度升高而减少，细胞的生长受到抑制。

FC还显著抑制B16细胞的集落形成，当FC浓度为0.5、1.0、2.0 μg/ml时，其抑制率分别为33.42%、50.57%、77.34%。

结论：中华眼镜蛇毒组分C对B16细胞具有明显的细胞毒性和生长抑制作用。

标签：中华眼镜蛇毒；黑色素瘤；细胞毒眼镜蛇是我国南方常见的毒蛇之一，据文献报道，眼镜蛇毒对多种肿瘤细胞有较好的杀伤作用。

中华眼镜蛇毒组分C是从中华眼镜蛇毒中分离出的具有明显抗癌活性的组分，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中呈单一区带，分子量约6000 Da[1]。

以往研究表明眼镜蛇毒组分C体内外都具有较好的抗白血病和其他肿瘤作用[2-6]。

本文探讨了其对体外培养的小鼠B16黑色素瘤细胞株的毒性作用。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株小鼠B16黑色素瘤细胞株由广州医学院实验中心提供。

1.1.2 主要试剂噻唑蓝（MTT）：SIGMA产品；二甲基亚枫（DMSO）：天津市化学试剂一厂（分析纯）；RPMI1640：GIBCO产品；新生牛血清：杭州四季青生物工程有限责任公司。

1.1.3 中华眼镜蛇毒组分C（fraction C from naja naja actra venom，FC）由广州蛇毒研究所提供。

1.1.4 主要仪器SW-CJ-1F型洁净工作台：苏净集团安泰公司；自动化酶免分析仪：北京圣健北方医疗仪器有限公司；CO2培养箱：美国QUEUE，Stabil therm；倒置显微镜：重庆光学仪器厂。

●重悬液（A液）的配制：向RPMI1640培养基中加入2%胎牛血清和10 mM HEPES ●重悬液（B液）的配制：向PBS 缓冲液中加入2%胎牛血清和10 mM HEPES
1.侧群细胞（Side population cells，SP）是利用流式细胞术和Hoechst 染料
进行造血干细胞分离时发现的一群特殊的细胞，这群特殊的细胞具有类似干细胞的自我更新和多向分化的能力。

2.取处于对数生长期的B16F10 细胞制成单细胞悬液，以3 ×105个/孔的
细胞量接种于6 孔板内，置于37 ℃，5% CO2 培养箱中培养过夜。

3.实验分为6 个组别：阳性对照（维拉帕米）组、空白对照组、Das（16.67
μmoL/L）组、ATRA（16.67μmoL/L）组、Das+ATRA（16.67 μmoL/L）组、Das/ATRA-NPs（16.67 μmoL/L）组。

每孔加入750 μL 药液，阳性对照组和空白对照组加等量的RPMI 1640 培养基。

4.药液与细胞共同培养24 h 后，阳性对照组加入浓度为100 μg/mL 的维拉
帕米处理20 min。

弃去孔内药液，PBS 缓冲液洗涤细胞2 次，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞。

5.每组各加入1 mL 预热至37 ℃的重悬液（A 液）重悬细胞，再加入5 μL
Hoechst 原液，37 ℃水浴避光孵育90 min。

反应90 min 后，立即用预冷的PBS 缓冲液洗涤细胞2 次，1000 rpm离心5 min 收集细胞。

6.再用预冷的重悬液（B 液）重悬细胞，加入2 μL PI 染色液，充分混匀
后，采用流式细胞仪进行检测分析。

B16F10小鼠黑色素瘤高转移细胞
Cat Number：KG078 For Research Use Only
一、组成:
二、客户自备试剂:
1、PBS (凯基货号：KGB5001)
2、Complete growth medium (凯基货号：KGM 31800-500)
3、0.25% （W/V） Trypsin-0.53mM EDTA (凯基货号：KGY0012)
三、细胞简介:
四、常见问题及解决方案:
1、培养瓶有破裂，培养液有漏液：细胞极大可能会污染，所以我们会及时安排帮老师解决。

2、细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。

次日观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞
活力正常，剩余漂浮的细胞可以离心去掉，留10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。

客户收到细胞后请务必仔细阅读细胞注意事项，确保细胞的培养条件一致，如果由于培养条件不一致导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

由于运输的情况，所以极个别细胞会出现不稳定，客户收到细胞后务必第一时间和我们联系，告知细胞具体情况，以便我们技术人员能及时有效的和老师沟通，不胜感谢！。

茶叶提取物EGCG和GCG及ECG对B16细胞内黑色素生成的抑制作用张向娜;林勇;黄建安;刘仲华;梁丹丹【摘要】Inhibitory effects of tea extracts EGCG, GCG and ECG on melanoma cell B16 from mouse were studied in this paper. Cells were treated with different concentrations of GCG, ECG, EGCG and Arbutin, and their morphology was observed in an inverted microscope. The proliferation rate of B16 was determined using MTT method, tyrosinase activity was detected by using L-DOPA as substrate, and NaOH-lysis approach was employed to measure the melanin synthesis. The results showed that EGCG, ECG, GCG could significantly inhibit the melanogenesis and tyrosinase activity in cells B16 with a dose-dependent manner. The proliferation rate would be lower than 50% when the concentration was increased to 60 μg/mL. Compared with the control group, tyrosinase activities affected by the three substances were reduced by 26.67%, 27.27% and 32.71%, respectively, the melanin inhibition rates were all above 30%.In conclusion, tea extracts could efficiently inhibit melanogenesis. The inhibitory effect of GCG was best, followed by ECG, EGCG, and arbutin in turn.%为研究茶叶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechingallate,GCG)和表儿茶素没食子酸酯(epicatechingallate,ECG)对体外培养B16小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影响,分别用不同浓度的EGCG、GCG、ECG和熊果苷(Arbutin,AR)处理细胞,观察效应物对细胞形态的影响,用溴化二苯四偶氮法(MTT法)测定茶叶提取物对细胞增殖率的影响,以左旋多巴(L-DOPA)为底物,测定细胞内酪氨酸酶的活性,采用氢氧化钠裂解法测定细胞内黑色素的含量.结果显示,EGCG、ECG、GCG能显著抑制B16细胞的黑色素生成和酪氨酸酶的活性,且呈剂量依赖关系;当浓度为60μg/mL时,细胞增殖率均低于50%,酪氨酸酶活性与对照组相比分别降低了26.67%、27.27%和32.71%,黑色素生成抑制率均在30%以上.结果表明,茶叶提取物能通过多种途径抑制黑色素生成,且GCG的作用效果最优,ECG的作用效果次之,三者的作用效果均优于熊果苷的作用效果.【期刊名称】《湖南农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(043)004【总页数】6页(P405-410)【关键词】茶叶提取物;表没食子儿茶素没食子酸酯;没食子儿茶素没食子酸酯;表儿茶素没食子酸酯;B16黑色素瘤细胞;黑色素生成;酪氨酸酶【作者】张向娜;林勇;黄建安;刘仲华;梁丹丹【作者单位】国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;国家植物功能成分利用工程技术研究中心,湖南长沙 410128;湖南省植物功能成分利用协同创新中心,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128;湖南农业大学园艺园林学院,湖南长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】Q946.84+1健康、白皙的肌肤是东方女性理想的肌肤状态，而皮肤黑色素的含量及分布很大程度上影响着肌肤的呈色。