蛋白酶酶活测定方法
一、 实验原理：
一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。
一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增
量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。
二、 试剂配制：
A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）
试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。
底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。
三、 操作步骤：
1. 试样
1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用
2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min
3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止
4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
2.空白
1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min
2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min
3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。 四、 Lowry法显色反应
试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液 1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反应30min。与水对照分别测定750nm吸光度，试样的吸光度为A1 ，空白的吸光度为A0。
实验四、蛋白酶酶活力的测定
一、 原理
以酪蛋白为反应底物，令蛋白酶在其最适宜条件下反应一定时间，用三氯乙酸终止反应后过滤或离心得上清液，用Folin比色法测上清液中蛋白酶解物的浓度，计算蛋白酶活力。蛋白酶活力定义：在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成与1μg酪氨酸相当的三氯醋酸可溶物所需的木瓜蛋白酶的量，为1个酶活力单位（u）。 二、材料、仪器与试剂
（一）材料：木瓜蛋白酶
（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管（10、15ml）、
漏斗、滤纸、试管架，容量瓶、移液管（1、10ml）、烧杯（25ml）、玻璃
棒。
（三）试剂：
1福林试剂(Folin试剂)
市场购买的Folin试剂。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释3倍
的福林试剂。 2、中性稀释液－pH7.2磷酸盐缓冲液
称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol/L溶液
(A液)。称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol/L
溶液(B液)。取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2
的磷酸盐缓冲液。 3、酪蛋白溶液
2g恒重的酪蛋白，用0.5mol/LNaOH溶液润湿后加入80ml pH7.2磷酸盐缓
冲液，沸水浴溶解，冷却后，用1 mol/L盐酸调至pH 7.0，再用磷酸盐缓冲液定
容至100ml，得浓度为2%的酪蛋白溶液。临用现配。 4、三氯醋酸溶液
称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL，得0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液
5、 酪氨酸标准溶液 精确称取精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再用水稀释5
倍，得到200μg/mL的酪氨酸标准溶液。取200μg/mL的标准酪氨酸溶液，配
实验四、蛋白酶活力的测定
1.实验目的 掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。
2.实验原理 蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨
酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量
成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。
酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。
3.主要仪器和试剂 试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA溶液
仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。
4.实验步骤 （1）标准曲线绘制 管号 标准酪氨酸标准液 0.55mol/L碳酸
钠溶液（mL） 稀Folin试剂
（mL） 吸取量（mL） H2O（mL） 浓度（µg/mL）
1 0 10 0 5 1
2 1 9 10 5 1
3 2 8 20 5 1
4 3 7 30 5 1
5 4 6 40 5 1
6 5 5 50 5 1 （2）样品的测定
取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将
三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反
应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。三支试管中反应液用
滤纸过滤。另取三支试管（一支空白。两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加
入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却
实验四 碱性蛋白酶活力的测定
一、实验原理
以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成
相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子
质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液
中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。
二、试剂和仪器
试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶
液（称取5g酪蛋白置于500mL 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，
加热使其溶解）、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀
释3倍使用
仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器
三、实验步骤
1、酶液的萃取
称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，
从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤
纸过滤后得到澄清的酶液。 2、酶活力的测定
样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L
碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混
匀，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静
置半小时。
空白管：先在每支试管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸
溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。
将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶
液和1mL Folin试剂，摇匀后在40℃恒温水浴中显色20 min，以相应的空白管中
