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基于植物分子标记的谱系地理学研究
摘要：分子谱系地理学技术主要是基于分子标记的谱系地理学。其主要是通过叶绿体基因里面的rpl16、trnK 内含子，trnT-trnF、atpB-rbcL、psbA-trnH的标记，运用分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA) 方法统计种群遗传多样性及遗传分化参数并以Mantel test模型分析遗传距离与地理距离之间的相关性。常用于种群遗传多样性及遗传分化评价参数有：Nei氏基因多样性、单倍型丰富度、私有等位基因数目及分布。目前的研究中常常会结合其他的分子标记技术来全面的揭示居群的演化。此外，分子谱系研究对于植物种植资源的鉴定、物种的遗传多样性、濒危物种的保护，以及一些外来入侵植物的研究都具有重要的意义。
关键词：谱系地理、分子标记、遗传多样性、进化；
谱系地理学(phylogeography ) 是Avise 在1987年提出的关于历史生物地理学的新概念主要探讨一个物种的基因谱系当前地理分布格局的历史成因，同时对种内居群的扩散迁移等微观进化历史进行有效的推测。谱系地理学的重要理论基础之一是溯祖理论，溯祖理论是探讨近缘种或种内基因谱系的数学和统计学理论，为遗传漂变历程的反向理论，即依据现存居群中存在的中性遗传变异，回推出此变异如何产生的历史过程，即回推至共同祖先基因型所经历的历史事件。
谱系地理学结合分子生物学技术和统计分析技术发展出的分子谱系地理是目前国际上群体遗传学研究的最新进展，该理论应用母系遗传的叶绿体变异构建趋近于物种树的基因树，显示居群演化的地理痕迹。近年来结合统计分析技术发展出了嵌套分支分析NCA ，这一分析方法能够把基因型或单倍型网状进化树用于分析目前基因型或单倍型遗传变异的空间分布，并能将影响居群遗传结构的现代因素( 如基因流) 和历史性事件( 如片断化快速扩展和拓殖现象等) 区分开来，对居群的动态结构和历史事件发生的过程和时间顺序有一清晰的认识，全面地反映居群的进化历史。
基因谱系的重建及其解释是谱系地理学分析的两个基本步骤。因此，谱系地理学研究中最基本、关键性的问题是选择适宜的分子遗传标记以获得全面的系统发育信息。
最早的研究遗传结构的分子标记，是基于细胞中的大分子的细胞学和生化标记，这种标记受外界因素的影响较大，不够精确的；染色体标记的标记能力有限，而DNA分子标记是基于遗传物质本身的标记，是DNA水平上的遗传多态性的直接反映，是继形态学标记、细胞学标记及生化标记之后，近年来广泛应用的一种新的遗传标记。它有许多优点：直接以DNA作为研究对象，在植物体各个组织、各个发育时期均可检测到；标记数量极多，遍及整个基因组；多态性高，自然存在着许多等位变异；有许多分子标记表现为共显性，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息。
目前常用的分子标记有RFLP、AFLP、RAPD、SSR 、ISSR 等。前两者操作较复杂，RAPD 稳定性和重复性较差。SSR 引物设计比较麻烦、ISSR(nter-simplesequence repeat) 是一种新型的分子标记，是由Zietkiwicz(1994)等创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。
等位酶、RAPD 等分子数据是无序数据(unordered data)，可用于种群遗传分析，但不能提供系统发育信息，一般不用于谱系地理学研究。尽管具有系统发育信息的核DNA 标记，如DNA 序列或限制性位点已用于植物谱系地理学研究，但面临着区分直系同源(orthology) 和旁系同源(paralogy) 的难题。
大多数被子植物叶绿体DNA(chloroplastDNA，cpDNA) 为单倍型、母系遗传、缺乏杂合细胞质、不发生等位基因重组，比双亲遗传的核DNA 标记在亚种群间表现出更大的遗传分
化，其有效种群大小比核DNA 有效种群大小要小，能产生更清晰的种群历史踪迹；相对于线粒体基因组，cpDNA 不存在DNA 分子内重组导致高频率基因重排、重复/ 缺失、外源DNA( 如核DNA)转移导致基因连锁极少保守等不利因素，特别是，对于重粒种子的植物，利用依赖种子扩散的母系遗传cpDNA，能很好地推测种群片断化历史。因此，cpDNA 标记被认为是植物谱系地理学研究的首选标记。大量研究表明，cpDNA 非编码序列( 内含子和基因间隔区) 不受选择影响，核酸位点比编码序列表现出更大的变异，多态性丰富，能提供更多的系统发育意义的信息位点。早期开展植物谱系地理学研究采用的cpDNA标记多选用单个DNA 片段，主要集中在蛋白质编码基因，如rbcL、matK、ndhF、atpB、rpS4 等，其目的是阐述较高水平的系统发育关系。大多数cpDNA 非编码区( 内含子和基因间隔区) 是被保守编码基因所包围的可变区域，不受选择影响，是中性的，其核酸位点比编码区表现出更大的变异，保持着丰富的多态性，能提供更多的系统发育意义的信息位点，近年来已开始广泛用于植物种间较低分类阶元和种内谱系地理学研究。由于cpDNA 非编码区不是在所有的被子植物中都存在变异，研究者经常不得不通过测序一定数量研究个体的不同cpDNA 基因内含子或基因间隔区，以寻找适合于研究的cpDNA 标记。为此，候选cpDNA 非编码区通常采用已开发的通用PCR引物或扫描已公布测序结果的相近种cpDNA 基因组序列。为了获得全面的系统发育信息，常采用两个或多个cpDNA 标记。适合于种内植物谱系地理学研究的常用标记主要有：rpl16、trnK 内含子，trnT-trnF、atpB-rbcL、psbA-trnH。
trnK 内含子位于LSC 上，5′端邻接chlB 或rps16，3′端邻接psbA，几乎存在于所有陆生植物和被子植物中，常被应用于种子植物各级分类阶元( 从种到科) 的谱系分析。由于trnK 内含子提供的简约信息特征和系统发育结构优于快速进化的编码基因( 如matK)，与其它cpDNA 标记相比，揭示出更高的种内变异。一些被子植物trnK 内含子已进化形成特殊的AT 重复茎环结构，是种内系统发育树重建和种群遗传分析的理想标记。
trnT-trnF 是应用于植物分子系统研究中最频繁的cpDNA 标记(Shaw 等，2005)，是由trnT(UGU)中间的非转录区trnL(UAA)Ⅰ型内含子和trnT 与trnF(GAA)间转录区构成。尽管它是编码区，但是它被认为是相当保守的编码质体聚合酶的启动子，具有很大的变异性，其中，trnL(UAA)Ⅰ型内含子包含有大量的系统发育信息特征。trnT-trnF 常被应用于推测种内和属内系统发育关系，也成功地解决了科间或被子植物大进化支的系统发育难题。
atpB-rbcL 位于LSC 上，包含编码能量代谢ATP 合成酶亚基和光合作用二磷酸核酮糖羧化酶大亚基的基因启动子，是最早运用于植物系统发育推测的cpDNA 基因间隔区标记。早期研究表明，推测较高植物类群系统发育，atpB-rbcL 标记十分理想，在谱系关系较近的物种之间也存在着相当丰富的变异。相对其它cpDNA 非编码区标记，atpB-rbcL 提供的系统发育信号相当有限，但确认物种，十分实用。
trnH-psbA 是cpDNA 最可变的基因间隔区，在被子植物中位于LSC 上trnK 基因内含子上游，毗连反向重复，被推荐为陆生植物系统分析的通用标记，已在许多不同的被子植物系统和苔藓植物中广泛应用。但是，它在种内表现的高度变异性，用于界定某些被子植物种，如，麦瓶草属、菝葜属，仍存在着一些问题。
为了分析等位基因频率空间分布，基于理想种群遗传平衡法则的有关种群遗传学分析被应用于谱系地理学研究，特别是用分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA) 方法统计种群遗传多样性及遗传分化参数并以Mantel test模型分析遗传距离与地理距离之
间的相关性。常用于种群遗传多样性及遗传分化评价参数有：Nei氏基因多样性、单倍型丰富度、私有等位基因数目及分布。单倍型之间的亲缘关系是谱系地理学研究的关键问题之一，因此，系统发育树经常被用于揭示它们之间的关系。由于古老等位基因多数是由多个后代等位基因共祖，二叉树很难准确展示说明种内基因进化关系，必须用多叉网状树，即基因谱系。如果是二叉树，经常发生零长度枝，也就是进化树拓朴结构的末支系(tip clades) 与内支
