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免疫组化-双重染色免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。
2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。
3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
双重免疫荧光细胞化学标记方法双重免疫荧光细胞化学标记方法在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色。
一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A或抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TM—RITC或RB200标记或PE标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。
在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗丹明标记，可采用以下染色方法：1．一步法双重染色方法先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。
2．二步法双染色方法先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A 抗体染色，按间接法进行。
结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。
激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。
主要用途：1．细胞及生物荧光样品观察分析。
2．绿荧光蛋白分析。
3．荧光原位杂交分析。
4．光切片扫描。
5．3D图像处理。
6. 时间序列拍摄成像.。
免疫组化（IHC）经验超全总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。
我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。
经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。
一、石蜡切片和冰冻切片的比较？1.要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
2.冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
3.石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
1.单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。
免疫组化双重染色方法和步骤：在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合;同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照);两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体.用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色);不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应.特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
试剂配制：1、3％过氧化氢甲醇：30％H2O210ml＋纯甲醇90ml→充分混匀。
2、0.3％过氧化氢甲醇：30％H2O21ml＋纯甲醇99ml→充分混匀。
3、免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：NaCl8.5g＋磷酸氢二钠（无水）2.8g＋磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
4、0.3％TritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚）：TritonX－100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
免疫荧光双染完整版免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
一、[实验诊断综合]免疫组化双重染色方法和步骤在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一样品中共存或同一种细胞中共存，因此出现了免疫组织化学双重染色。
此方法有几种类型，包括免疫酶组织化学和免疫荧光细胞化学法结合；同一切片的再度染色法(先对第一种抗原染色，阳性部位拍照，再用酸处理使抗原抗体解离，继之，对第二种抗原染色、拍照)；两种酶标抗体3又重染色(分别用辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶标记第二抗体．用间接法分别显示A和B抗原，如两种一抗来自同一种属，常有重叠染色)；不同种属来源的抗体双重染色。
目前，最常用的是最后一种方法。
不同种属来源的抗体双重染色，两种抗体间无交又反应．特异性较高，即使细胞内抗原量很少也能检测。
但是，当两种抗原存在于同一部位而其中之一浓度较高，占绝对优势时将妨碍另一种抗原染色，此种情况应分别染色，首先染色含量较少的抗原，再显示含量丰富的抗原。
在该方法中应用最多的是把SABC法或SP法的实验流程重复两次，其中两种不同特异性抗体(可以是小鼠或大鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体的任何两个组合)，与一抗对应的不同种属生物素化二抗和两种不同显色系统。
即可将不同部位或相同部位的两种抗原显示出来。
该方法用于石蜡切片时应考虑所选择的两个抗体的修复方法应该一致或一个抗体的修复对另一个抗体的染色结果没有影响。
SP法双重染色步骤1～6步骤与SABC法相同，但无需使用生物素阻断剂：7．切片加入A特异性抗体(如兔抗A抗体)，4=C过夜孵育后，PBS冲洗3次，每次5分钟8.滴加生物素化二抗(如抗兔二抗)，室温孵育切片10分钟，继而PBS冲洗3次，每次5分钟；9.滴加链霉菌抗生物素蛋白—碱性磷酸酶，室温孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟10．碱性磷酸酶显色液(BCIP／NBT)显色(紫蓝色)．PBS冲洗3次，每次5分钟；11．滴加0．05％盐酸，室温10分钟(可避免已显色的抗原褪色)；12．滴加抗小鼠二抗同种属的非免疫血清，37~C孵育10分钟；13．滴加B特异性抗体(如小鼠抗B抗体)，4~C过夜孵育。
