化学发光免疫分析法(CLIA)
A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法:
(竞争法:用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体,待检抗原与检测信号成反比)
一、原理:本实验采用竞争法,酶标抗原与标准品抗原竞争抗体,标准品抗原浓度越大,结合到抗体上的酶标抗原越少,RLU越小,B/B
值越小。例:A为一种抗原
小分子,有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析,使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗A 抗体(FITC-A抗体)发生竞争性免疫反应,再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒,反应生成物结合在磁微粒上,在磁场经分离、洗涤后加发光底物,用冷光分析仪检测发光强度(RLU),测定尿液中A的含量。
二、仪器:
1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司);
2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min
3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯)
4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)
5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂)
6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司)
三、试剂
1、A标准品
2、A单克隆抗体
3、A-BSA结合物
4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子(5mg/mL)
5、FITC标记的A单克隆抗体
6、HRP标记的A
7、PBST 洗涤液(0、05mol/L PBS, 含0、05% Tween-20)
8、分析缓冲液(0、05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7、4, 含2、0%BSA、0、5 %的水解明胶、0、1%的Proclin-300)
9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢与对碘苯酚溶液)
实验用水为二次蒸馏水
四、试剂处理
1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品;
2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存、 FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。(具体分析)
五、数据处理
通过测量标准品与样品溶液的发光强度(RLU),使用Fl ash’n glow LB955 发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理、线性方程采用的就是logit(Y)-log(X)的线性回归数学模型, 以logitY 为纵坐标, logX 为横坐标, 其线性方程表达式为logit(Y) = a + blog(X), 线性方程中 X 为标准品(或待测样品)溶液的浓度, logit(Y) =ln(y/1-y),y=B/B0,式中, B 为标准品(或待测样品)溶液的发光强度, B0 为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光强度、根据标准品的浓度与发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品
的发光强度值得样品的浓度。
B、板式磁性微粒子化学发光免疫分析法(双抗体夹心法):
一、原理:以磁性微粒子作为分离固相,96孔板为反应容器,辣根过氧化
物酶(HRP)催化H2O2-liminol化学发光体系作为检测体系。采用双抗体
夹心法,在溶液中形成FITC-抗体—抗原-HRP复合物,引入偶联FITC抗
体的磁性微粒子,在反复施加磁场的作用下,通过洗涤将没有结合的游
离蛋白与免疫复合物分离,以辣根过氧化物酶(HRP)催化H2O2-liminol
化学发光体系作为检测体系,实现对待测抗原的检测。
二、仪器
1、BHP9504 微孔板化学发光分析仪(北京滨松光子技术有限公司,
北京);
2、管式发光分析仪(Berthold 技术有限公司, 德国);
3、DEM-III 型洗板机(北京拓普分析仪器有限公司, 北京); 电热
恒温水浴箱(北京长安科学仪器公司, 北京);
4、XW-80A旋涡式震荡混合仪(上海精科实业有限公司, 上海);
5、白色不透光96-孔微孔板(英科新创科技有限公司, 厦门);
6、磁分离器采用美国Promega 公司的Magnabot 96 磁分离装置、
三、试剂
1、A标准品以及配对的A单克隆抗体均购自Fitzgerald 公司(康科
德, 美国);
2、辣根过氧化物酶(HRP)、异硫氰酸荧光素(FITC)以及Tween 20 购
自Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯, 美国);
3、化学发光底物(鲁米诺与H2O2)来自美国的DPC 公司;
4、牛血清蛋白(BSA)购自德国的Merck 公司; 抗FITC 抗体包被的
磁颗粒悬浊液(粒径: 2、8 μm, 浓度: 5 mg/mL)购自意大利的
Adaltis 公司、
5、96 孔微孔板先用300 μL 含1% (w/V)的BSA 的磷酸缓冲液(PBS)在
4 ℃封闭12 h; 整个实验过程中的冲洗液为浓度就是0、01 mol/L 的磷
酸盐缓冲液, 含0、05%吐温-20 (V/V)、
6、正常混合人血清来自北京科美东雅生物技术有限公司, 所需血样来
自于解放军301 医院(北京)门诊及住院病人、
7、样品标本无需特殊处理, 采用常规医用技术收集全血, 静置, 离心
沉淀后, 吸取血清, 分装, 密封,－20 ℃保存备用、检测前, 血清于室温平衡30 min 后,轻微摇晃使其混匀、
四、实验方法
具体操作步骤为: 先将25μL A标准品(梯度浓度稀释)或待测血清, 40μL HRP-A抗体结合物与40μL FITC-A 抗体结合物加入到96孔板的微孔内; 在37 ℃条件下温育70 min 后, 向体系中加入80 μL 抗FITC 抗体包被的磁颗粒悬液; 再经过15 min的孵育后, 用96孔板专用磁分离器进行分离, 洗涤液清洗3次; 最后加入90μL鲁米诺与H2O2化学发光底物, 在室温下放置10 min 后进行发光测量、
C、对比
