石莼提取物抗氧化及抗菌活性研究

药物研究Themedicinestudy

基金项目：浙江省大学生科技创新项目。作者简介：吴淳涛（1987－），男，浙江海洋学院药学专业本科生，e－mail：Chuntao007@126．com。通讯作者：童国忠（1956－），男，高级实验师，从事海洋药物研究，E－mail：xkouyang@zjou．edu．cn。石莼提取物抗氧化及抗菌活性研究

吴淳涛童国忠章卢超浙江海洋学院食品与药学学院，浙江舟山316004【摘要】本文研究了石莼提取物的抗氧化及抗菌活性，研究比较了乙醇、氯仿、乙酸乙酯的石莼粗提物抗氧化、抗菌活性。结果显示三种提取物的DPPH清除率，羟自由基清除率及还原力均随浓度的增加呈递增趋势；且石莼多酚对金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌和麦氏弧菌有较好的抗菌作用。【关键词】石莼多酚；抗氧化活性；抗菌活性【中图分类号】R961.1【文献标识码】A【文章编号】1007－8517（2011）06－0033－03StudyofantioxidantandantibacterialactivitiesofUlvalactucaextractWuChun－tao，TongGuo－zhong，ZhangLu－chaoSchoolofFoodandPharmacy，ZhejiangOceanUniversity，Zhoushan，Zhejiang316004Abstract：AntioxidantandantibacterialactivitiesofUlvalactucawereinvestigated．Theantioxidantactivitiesandantibacterialoftotalmethanolextractandtwodifferentsolventfractions（ethylacetate，chloroform）wereevaluated．Reducingpower，DPPHandhy-droxylradicalscavengingactivityoftheseextract，increasedwithincreasingconcentrationoftheextract．Methanolextract，ethylacetateextractandchloroformextractwerefoundtobeantibacterialactivitytostaphylococcusaureus，Vibrioparahaemolyticus，Vibriovulnifi-cusandVibriometschnikovii．Keywords：Ulva；Antioxidationactivity；Antibacterialactivity

海洋是天然药物的重要来源，由于生长在特殊生态环境下，海藻普遍含有特殊作用的生物活性物质。近几年来，随着高灵敏的现代分析和分离技术应用于海藻资源的开发，已发现了一批重要的抗癌、抗菌、抗炎、抗氧化等方面表现出较好的生物活性物质。我国海藻品种众多，海藻中绿藻门是藻类中比较高级的一大类群。由于其具有边缘宽、产量高、分布广等特点，使之成为中国野生藻中资源及其丰富的一种。据《本草纲目》记载，石莼具有软坚散结、清热解毒、利水降脂等功效［1］。石莼属（UlvalacyucaL．，隶属于绿藻门、绿藻纲、石莼目、石莼科，其藻呈黄绿色）海藻活性物质的研究已成为现代海洋生物学研究的重要部分。有两层细胞组成的膜状体，边缘宽大［2］。石莼分布广泛，可做饲料，又可用来制绿藻胶和绿肥。本文制备了石莼的乙醇粗提物及氯仿，乙酸乙酯粗提物，并分别对几种粗取物的抗氧化及抗菌活性进行了研究。1材料与试剂石莼（采自舟山海域），Folin－Ciocalteu试剂、碳酸钠、没食子酸（GA）、二苯代苦味酰基自由基（DPPH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、铁氰化钾、无水乙醇、三氯乙酸（TCA）、三氯化铁磷酸氢钠、磷酸氢二钠、邻二氮菲、硫酸亚铁、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、H2O2（30%）（以上试剂均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司）。生化试剂：金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门菌、福氏4型志贺菌、小肠耶尔森菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、麦氏弧菌（由舟山市定海区疾控中心提供）。旋转蒸发仪RE－2000型上（海亚荣生化仪器厂）；紫外可见分光光度计（U－2800日本日立紫外可见分光光度计有限公司；循环水式多用真空泵（SHB－ⅢA河南省太康科教材料厂）；超级恒温槽SC－15（宁波江南仪器厂）；超声波清洗器（SK5200H上海科导超声仪器有限公司）；电子天平（BSA323S赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；超纯水器（UPWS－Ⅰ－20T杭州永达洁净水科技有限公司）。2实验方法2.1石莼粗提物的制备石莼清水漂洗后自然晾干剪碎，用万能粉碎机粉碎，称取粉末300g，以乙醇为提取溶剂，超声辅助提取，滤渣重复提取两次，合并滤液，减压旋转蒸发溶剂，得甲醇粗提物。将所得粗提物平均分成三份，其中两份分散于水中，分别用氯仿和乙酸乙酯萃取，每种溶剂萃取三次，合并萃取液，置于圆底烧瓶中，旋转蒸发去除溶剂，分别得氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物。2.2石莼多酚含量的测定多酚含量测定［3］：以AOAC（1970）的标准分析方法测定，即用Folin－Ciocalteu试剂在碱性条件下与多酚类物质形成蓝色复合物后，用紫外－可见分光光度计检测。2.2.1绘制没食子酸标准曲线取浓度为0.05mg/ml的没食子酸0.1ml、0.3ml、0.5ml、0.7ml、0.9ml在10ml的试管内，然后加入0.1ml福林酚试剂，3min后加2%的Na2CO32ml，后用蒸馏水定容到5ml，在25℃下反应30min，在760nm处测定吸光度，平行测3次。2.2.2石莼粗提物多酚含量测定取石莼粗提物40mg，用10ml甲醇定容，配成4mg/ml的样品溶液。取溶液0.5ml，置于10ml试管内，然后加入0.1ml福林酚试剂，3min后加入2%碳酸钠溶液2ml，再用蒸馏水定容到5ml，25℃下反应30min，在760nm处测定吸光度，平行测3次。·33·中国民族民间医药Chinesejournalofethnomedicineandethnopharmacy药物研究Themedicinestudy2.3石莼多酚抗氧化活性的测定样品溶液的配制：取石莼粗提物40mg，用10ml甲醇定容，配成4mg/ml的样品溶液1；取氯仿萃取物40mg，用10ml甲醇定容，配成4mg/ml的样品溶液2；取乙酸乙酯萃取物40mg，用10ml甲醇定容，配成4mg/ml的样品溶液3。2.3.1清除DPPH自由基的能力测定（DPPH法）［4］分别取不同浓度的样品1，样品2和样品3，分别加入甲醇定容至2ml，加入2mlDPPH（甲醇溶液，0.2mmol/L，现用现配），混合均为后室温暗处放置30min，于517nm处测定吸光度Asample；2ml甲醇溶液于517nm处测定吸光度Asampleblank；2mlDPPH中加入2ml甲醇于517nm处测定吸光度Acontrol；4ml甲醇于517nm处测定吸光度Ablank。平行测定3次，计算平均值和标准偏差。石莼多酚样品对DPPH的清除率按下式计算：清除率（%）=［1－（Asample－Asampleblank）/（Acontrol－Ablank）］×100%2.3.2清除羟自由基的能力测定［5］取浓度为0.75mmol/L邻二氮菲1mL于试管中，依次加入PBS（pH值为7.40）2mL，蒸馏水1mL，充分混匀后，加入浓度为0.75mmol/L的硫酸亚铁1mL混匀，加质量分数为0.12%的H2O21mL置于37℃水浴90min，536nm处测其吸光度为Ap；用1mL蒸馏水代替1mLH2O2，为Ab；用样品代替1mL的蒸馏水，为As。样品对羟自由基清除率=（As－Ap）/（Ab－Ap）×100%2.3.3还原能力测定（铁氰化钾还原法）［6］水解液还原力测定按照Oyaizu（1988）方法进行：2ml样品和2ml0.2M（Ph6.6）磷酸盐缓冲液+2ml的1%铁氰化钾，混合物在50℃保温20分钟，接着在混合物中加入2ml10%的三氯乙酸TCA，然后取出2ml混合物加入2ml蒸馏水和0.4ml0.1%氯化铁（三氯化铁）于试管中，反应10分钟后，测定700nm处吸光值，吸光值高表明还原力高。2.4石莼提取物抗菌实验使用琼脂平板孔穴法（K－B法）和采用试管倍比稀释法的方法测量石莼提取物对不同细菌生长的抑制试验。测量抑菌环的直径，测出的混合物完全抑制细菌生长的最低浓度为最低抑制浓度（MIC）。3实验结果与分析3.1石莼多酚含量3.1.1没食子酸标准曲线见图1。

图1没食子酸标准曲线3.1.2样品多酚含量把测得的样本吸光度A代入公式y=8.5435x+0.0727，计算得石莼粗体物中多酚含量为0.90%；氯仿相多酚含量为1.62%；乙酸乙酯相多酚含量为1.26%。3.2石莼多酚抗氧化活性3.2.1清除DPPH自由基能力的测定DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517nm有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系的，因此可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。石莼不同浓度各种粗提物的DPPH清除率见表1及图2。

表1石莼各项多酚提取物清除DPPH自由基的能力比较浓度（mg/ml）DPPH清除率（%）乙醇粗提物氯仿萃取物乙酸乙酯萃取物216.2975.5574.87429.0593.9888.34644.4897.7793.04848.0897.4494.08注：表中数据为平均值±标准偏差（n=3）

图2石莼粗提物DPPH清除率

由表1和图2可知，粗提物，氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物均有清除DPPH自由基的作用。氯仿与乙酸乙酯的萃取物对DPPh自由基的清除率比粗提物大。并随着浓度的增加，三者对DPPH自由基的清除率也增加。3.2.2石莼多酚清除羟自由基能力的测定羟自由基（·OH）系活性氧一种。羟自由基能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物，继而又发现许多由它所致有害效应当加入羟自由基的清除剂后会明显降低。利用体系中的H2O2可以产生羟自由基，将Fe2+氧化成Fe3+，使邻二氮菲与Fe2+的络合物破坏，吸光度降低，加入还原性物质后可以与羟自由基反应保护Fe2+免遭氧化，吸光度比原来增大，因此可用于检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。石莼不同浓度各相羟自由基清除率见表2及图3。由表2数据及图3的线性可知，三者均有清除羟自由基的能力。并且随着浓度的增大清除率也增大，因此可以推测石莼多酚对羟自由基的清除率可能有量效关系。3.2.3石莼多酚铁还原能力测定还原力法的原理为：K3Fe（CN）6+样品→K4Fe（CN）6+样品氧化物，K4Fe（CN）6+Fe3+→Fe4［Fe（CN）6］3在波长700nm条件下测定吸光度A，A越大，则样品的还原力越大，因而可以测定浒苔多酚的还原力。石莼不同浓度各相提取物还原力见表3及图4。·43·中国民族民间医药Chinesejournalofethnomedicineandethnopharmacy药物研究Themedicinestudy表2石莼各项多酚提取物清除羟自由基能力比较浓度（mg/ml）羟自由基清除率（%）粗提物氯仿萃取物乙酸乙酯萃取物0.225.6537.1835.670.441.1855.819.980.662.8278.3175.120.875.442.8588.47注：表中数据为平均值±标准偏差（n=3）